生物样品稳定性的考察

生物样品稳定性考察的技术要求

默认分类2010-06-09 23:58:08 阅读126 评论0 字号：大中小订阅

从指导原则中我们可以理解样品稳定性包含了5个方面，但申报资料中往往只对其中的2～3项进行考察，应引起审评注意。

（1）冰冻稳定性（冷冻稳定性）：配制好数份低、中、高含药生物样品后冰冻，分别在数天或数十天时，取出化冻测定血药浓度，计算回收率来考察稳定性。冷冻稳定性（常规为－20℃）的目的是考察样品贮存的低温极限条件。因此所有样品分析必须满足一定时间内在特定的贮存温度下的稳定性要求。如有些样品冻存仅一周稳定，不能满足样品分析周期要求，可采用合适的方式延长冷冻稳定性，如采用超低温冰箱保存降低冰冻温度，也可采用加入适当的稳定剂，如含巯基化合物，添加抗氧化剂维生素C能大大延长冷冻稳定性。

（2）样品处理后的溶液中分析物的稳定性（测定溶液的稳定性）：含药生物样品于配制好后按“血浆样品的处理”项立即处理，置室温中分别在数小时或数十小时时测定，常将测定溶液放置在低温进样器中考察。该实验的目的是，考察在样品量大、分析批内待机时间长所致的待测样品发生的变化或仪器污染/疲劳/基线漂移等所造成的系统偏差。

HPLC法中如采用UV或FLD检测，可采用统计样品主峰面积RSD%考察。生物样本污染较大，当采用MS或MS/MS 检测时，连续进样易污染加热毛细管，导致主峰面积逐渐下降，此时需要同时跟踪线性测定进行考察。也可考察降解杂质的变化来判断，如含奥美拉唑生物样品通过考察主要降解杂质磺酰化物，这种方法有时更为准确。

（3）冻融稳定性：配制好低、中、高含药生物样品，冻融数次（常3次）, 测定血药浓度，计算回收率来考察稳定性。由于生物样品分析复杂、误差大，易产生可疑数据，往往需要重新测定来确定数据的可信度，该稳定性为上述测定提供保证。如含赖诺普利血样，冷冻放置7天内基本稳定，冻融两次赖诺普利降解50％以上。解决冻融不稳定性的办法有：血样采集分离后，立即定量分成多份冷冻方式，满足实验要求。

（4）室温稳定性：配制好低、中、高含药生物样品后，在室温条件下放置数小时至数十小时后，按“血浆样品的处理”

项立即处理测定，计算回收率来考察稳定性。该实验目的考察血浆样品处理过程中，待处理样品放置的合适条件。如文献报道，含尼莫地平血样在室温稳定性较差，需要冻融后立即处理测定，但这种情况会影响测定的效率，经室温稳定性考察后发现，在严格避光条件下，血样在24h内稳定。

（5）储备液的稳定性：对照品储备液分别置冰箱中（4℃）放置数天数十天后，取出后直接测定，测定方法可不同于含药生物样品的测定。如仅放置几天，可采用测定条件连续测定，计算样品主峰面积的RSD%来考察；如对照品容易获得，可采用新配制对照品溶液外标法计算储备液的含量来考察；对于昂贵的对照品（如代谢物）可采用HPLC归一化法联合吸收系数法来考察待测成分的变化。

生物等效性试验中样本保存及前处理应注意的几个问题

审评三部李士敏魏农农赵明

【摘要】本文对生物等效性试验所用生物样本采集后到检测前在保存过程中应注意的几个方面的问题进行了阐述，希望能对从事此方面研究的人员有所帮助。

由于生物等效性试验的样本来源多为血样或尿样，所含的药物浓度较低，内源性干扰成分多，目标药物多与蛋白结合或呈缀合状态，在整个试验过程中，样本测定周期长，测试工作量大，因此其分析方法学的要求与一般的药物分析方法相比具有其自身的特点，我们在建立方法学时，应注重以下几个方面：

一、样品采集后的的处理和贮存

鉴于生物样本的特点，为了避免样品中被测药物发生分解或产生其他化学变化，取样后最好立即进行分析测定，但实际工作中几乎无法做到，常需将收集到的样品冷藏、冰冻，临用前再融化并放至室温后使用。

在样本冷冻贮藏前，需及时进行处理。血浆和血清都需要在采血后及时分离（24小时内），若不及时分离，血凝后再冰冻保存，则因冰冻时引起细胞溶解，阻碍血浆或血清的分出，同时因溶血而影响药物浓度变化。尿液主要是水、尿素及盐类，是很好的细菌生长液，因此应在取样后立即测定。不能立即测定时，应于4℃冷藏，如在室温保存，则应在采样后的尿液中加入少量防腐剂甲苯（1%）或氯仿（饱和）。生物样品中的一些不稳定的药物（如普鲁卡因、丙酸、红霉素、阿糖胞苷），易受血浆酯酶水解的影响，当采好样品之后应立即加入酯酶抑制剂氟化钠、三氯醋酸等，防制药物分解。易氧化的药物（如儿茶酚类、阿扑吗啡等）一般直接在-15℃仅能保存4周；若样品中加入维生素C或其他抗氧剂，则可稳定10周。生物样品在采样、贮存与分析过程中都应注意可能造成样品的损失或污染，以免将污染物作为药物新的代谢物。

二、生物样本贮存期间的稳定性考察

由于生物等效性试验样本从采样到检测的周期通常需要几周至几个月，在其贮存期间目标药物的稳定性需经考察验证。含药样本稳定性是指样品中的药物从采样至测定时性质和含量的稳定程度，它是贮存条件、药物的化学性质、空白生物样品和容器系统的函数，在特定的容器和生物样品中待测物的稳定性不能外推至其他系统。生物样本稳定性的评价应考察：

1、短期室温稳定性：要求高、低浓度样本在4~24 h内稳定。考察温度、光照、空气、酶解等因素。

2、长期低温条件下的稳定性：从第一个样本采集至最后一个样本的分析为一个考察时间周期，贮存温度一般为-20℃，如果需要也可在-70℃贮存。要求高、低浓度至少分别测定3次，测得结果与第一天测得的相应浓度比较应保持稳定。

3、冻融试验：取高、低浓度各3份于-20℃贮存24小时，取出后在室温自然解冻，取样测定，然后再将样品放回冷冻12~24小时，如此重复循环二次以上，分别比较各次测定结果。

4、对照液和内标液的稳定性：室温考察6小时稳定性，然后冷藏7~14天或恰当的周期后进行测定，与新配溶液的测定结果进行比较。

三、生物样本的前处理方式

在测定体液、组织匀浆等生物样品中药物及其代谢物时，首先要将生物样本中的蛋白质除去，使与蛋白质结合的药物释放出来，以便准确地测定药物及其代谢物的浓度。除蛋白的方法有：1）加入与水混溶的有机溶剂及中性盐（如乙醇、甲醇、丙酮和乙腈；硫酸铵、硫酸钠、氯化钠；）；2）加入酸性沉淀剂（如三氯醋酸、高氯酸等）；3）加入重金属离子（如铅、钡、钨酸等）；4）组织的酶消化法（如枯草杆菌蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶等）。

对于与内源性物质缀合的药物同样需先进行缀合物的水解。缀合物水解的方法常用的有：酸水解、酶水解、溶剂解。

经过除蛋白或对缀合物进行水解后的生物样本，需进行进一步的提取净化才能进行分析测试，通常可采用液?液萃取或液?固萃取法进行纯化。

以上是我们对生物样本采集后到检测前在保存过程中应注意的几个方面的一些看法，希望对进行此方面研究的人员有所帮助。

作者：cde

原料药稳定性试验报告

L- 腈化物稳定性试验报告一、概述 L-腈化物是L- 肉碱生产过程中的第一步中间体（第二步中间体： L-肉碱粗品；第三步中间体：L-肉碱潮品），由于L- 肉碱生产工艺为间歇操作，即每生产一步中间体，生产完毕并出具合格检测报告后，存入中间体仓库，以备下一步生产投料所需。根据本公司L- 肉碱产品的整个生产周期，L- 腈化物入库后可能存放的最长时间为4 周（约28 天）。以此周期为时间依据制定了L- 腈化物稳定性试验方案，用于验证L-腈化物在再试验期限内的各项质量指标数据的稳定性，并且能否符合L- 腈化物的质量标准，此次稳定性试验的整个周期为28 天，具体的稳定性试验方案以ICH 药物稳定性指导原则为基础制定，以确保L- 腈化化物稳定性试验的可操作性。二、验证日期 2010 年1 月13 日- 2010 年2 月10 日三、验证方案 1）样品储存和包装：考虑到L- 腈化物今后的贮藏、使用过程，本次用于稳定性试验的样品批次与最终规模生产所用的L- 腈化物的包装和放置条件相同。 2）样品批次选择：此次稳定性试验共抽取三批样品，且抽取样品的批次与最终规模生产时的合成路线和生产工艺相同

3）抽样频率和日期：从2010.1.13 起，每隔7 天取样一次，共取五次，具体日期为：2010.1.13 、2010.1.20 、2010.1.27 、 2010.2.3 、2010.2.10 ，以确保试验次数足以满足L- 腈化物的稳定性试验的需要。。 4）检测项目：根据L- 腈化物的质量标准的规定，此次稳定性试验的检测项目共五项，分别为外观、氯含量、熔点、比旋度、干燥失重。这些指标在L- 腈化物的储存过程中可能会发生变化，且有可能影响其质量和有效性。 5）试样来源和抽样：L- 腈化物由公司102 车间生产，经检测合格后储存于中间体仓库，本次稳定性试验的L- 腈化物均取自于该中间体仓库，其抽样方法和抽样量均按照L- 腈化物抽样方案进行抽样。抽样完毕后直接进行检测分析，并对检测结果进行登记，保存，作为稳定性数据评估的依据。四、稳定性试验数据变化趋势分析及评估通过对三批L- 腈化物的稳定性试验，对其物理、化学方面稳定性资料进行评价，旨在建立未来相似情况下，大规模生产出的L- 腈化物是否适用现有的再试验期（28天）。批号间的变化程度是否会影响未来生产的

生物样品定量分析方法验证指导原则

9012 生物样品定量分析方法验证指导原则
1. 范围
准确测定生物基质（如全血、血清、血浆、尿）中的药物浓度，对于药物和制剂研发非常重要。这些数据可被用于支持药品的安全性和有效性，或根据毒动学、药动学和生物等效性试验的结果做出关键性决定。因此，必须完整地验证和记录应用的生物分析方法，以获得可靠的结果。
本指导原则提供生物分析方法验证的要求，也涉及非临床或临床试验样品实际分析的基本要求，以及何时可以使用部分验证或交叉验证，来替代完整验证。
生物样品定量分析方法验证和试验样品分析应符合本指导原则的技术要求。应该在相应的生物样品分析中遵守 GLP 原则或 GCP 原则。
2. 生物分析方法验证
2.1 分析方法的完整验证
分析方法验证的主要目的是，证明特定方法对于测定在某种生物基质中分析物浓度的可靠性。此外，方法验证应采用与试验样品相同的抗凝剂。一般应对每个物种和每种基质进行完整验证。当难于获得相同的基质时，可以采用适当基质替代，但要说明理由。
一个生物分析方法的主要特征包括：选择性、定量下限、响应函数和校正范围（标准曲线性能）、准确度、精密度、基质效应、分析物在生物基质以及溶液中储存和处理全过程中的稳定性。
有时可能需要测定多个分析物。这可能涉及两种不同的药物，也可能涉及一个母体药物及其代谢物，或一个药物的对映体或异构体。在这些情况下，验证和分析的原则适用于所有涉及的分析物。
对照标准物质在方法验证中，含有分析物对照标准物质的溶液将被加入到空白生物基质中。此外，色谱方法通常使用适当的内标。应该从可追溯的来源获得对照标准物质。应该科学论证对照标准物质的适用性。分析证书应该确认对照标准物质的纯度，并提供储存条件、失效日期和批号。对于内标，只要能证明其适用性即可，例如显示该物质本身或其相关的任何杂质不产生干扰。当在生物分析方法中使用质谱检测时，推荐尽可能使用稳定同位素标记的内标。它们必须具有足够高的同位素纯度，并且不发生同位素交换反应，以避免结果的偏差。
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原料药与药物制剂稳定性试验指导原则

生物样品分析前处理技术

生物样品的前处理涉及很多方面，但主要应考虑生物样品的种类，被测定药物的性质和测定方法三个方面的问题。1.样品的分离、纯化技术应该依据生物样品的类型。例如，血浆或血清需除蛋白，使药物从蛋白结合物中释出；唾液样品则主要采用离心沉淀除去粘蛋白；尿液样品常采用酸或酶水解使药物从缀合物中释出，当原型药物排泄在尿中时，可简单地用水稀释一定倍数后进行测定。2.根据被测定药物的结构、理化及药理性质、存在形式、浓度范围等，采取相应的前处理方法。例如，药物的酸碱性（pka）、溶解性质涉及到药物的提取手段；是否具有挥发性涉及到能否采用气相色谱法测定；药物的光谱特性及官能团性质涉及到分析仪器的选择、能否制成衍生物及应用特殊检测器的可能性。药物在样品中的浓度相差很大，浓度大的样品，对前处理要求可稍低；浓度越低则样品前处理要求越高。此外，药物在体内常产生许多代谢产物，其中一些代谢物仍具有药理活性，需要与原型药分别测定，因而也要了解药物的药理学性质和药物动力学特性。3.样品于测定前是否需要纯化以及纯化到什么程度均与其后采用的测定方法的不同而不同。即纯化程度与所用测定方法的专属性、分离能力、检测系统对不纯样品污染的耐受程度等密切相关。一般说来，放射免疫测定法由于具有较高的灵敏度和选择性，因此当初步除去主要干扰物质之后即可直接测定微量样品；而对灵敏度和专属性较差的紫外分光光度法，分离要求就要相应高一些；至于常用的高效液相色谱法，为防止蛋白质等杂质沉积在色谱柱上，上柱前需对生物样品进行去蛋白，有时对被测组分进行提取、制备衍生物等前处理。样品处理步骤与分析方法的选择 (一）去除蛋白质在测定血样时，首先应去除蛋白质。去除蛋白质可使结合型的药物均出来，以便测定药物的总浓度；去除蛋白质也可预防提取过程中蛋白质发泡，减少乳化的形成，以及可以保护仪器性能（如保护HPLC柱不被沾污），延长使用期限。去除蛋白法有以下几种。 1.加入与水相混溶的有机溶剂加入水溶性的有机溶剂；可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，使与蛋白质结合的药物释放出来。常用的水溶性有机溶剂有：乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等。含药物的血浆或血清与水溶性有机溶剂的体积比为1：（1～3）时，就可以将90％以上的蛋白质除去。水溶性有机溶剂的种类不同时，析出的蛋白质形状亦不同；并且所得上清液的pH值也稍有差别，如用乙腈或甲醇时，上清液pH为8.5～9.5，用乙醇或丙酮时，上清液pH为9～10。操作时，将水溶性有机溶剂与血浆或血清按一定比例混合后离心分离，取上清液作为样品。通常分离血浆或血清用的离心机（3000r/min）不能将蛋白质沉淀完全，而采用超速离心机（10000r／min）离心1～2min 便可将析出的蛋白质完全沉淀。离心时应用超速离心机专用的具塞塑料尖底管，可使析出的蛋白质牢固地粘在管底，便于上清液的吸取。 2.加入中性盐加入中性盐，使溶液的离子强度发生变化。中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋白质脱水而沉淀。常用的中性盐有：饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等。操作时，如按血清与饱和硫酸铵的比例为1：2，混合，离心（10000r/min）1～2min，即可除去90％以上的蛋白质。所得上清液的pH为7.0～7.7这种利用盐析的方法与有机溶剂提取法并用时，药物的回收率高，因而常常被采用。 3.加入强酸当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在。此时加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶住盐而沉淀。常用的强酸有：10％三氯醋酸、6％高氯酸、硫酸-钨酸混合液及5％偏磷酸等。含药物血清与强酸的比例为1：0.6混合，离心〈10000r／min）1～2min，就可以除去90％以上的蛋白质。取上清液作为样品。因加入了强酸，上清液呈酸性（pH0～4），在酸性下分解的药物不宜用本法除蛋白。过量的三氯醋酸可经煮沸，分解为氯仿和二氧化碳而被除去；也有用乙醚提取过量三氯醋酸的方法。过量的高氯酸可用碳酸钾、

微生物学的应用习题参考答案

第十一章微生物学的应用习题参考答案一、选择题 1-5. CDAAAAC；6. B 二、是非题 1-5. FFTFF；6-7. FT 三、填空题 1. 糖类化合物 2. 同型；异型 3. 自然；纯种 4. 深层培养；固体基质 5. 促进植物生长发育；增强抗寒抗旱；抗倒伏的能力；提高农作物的品质和产量 6. 高等植物叶绿素；蛋白质的合成；光合作用；养分的吸收和利用 7. 对病原菌的抑制作用；影响宿主或其他菌株的代谢活性；刺激机体的免疫系统；减缓乳糖不适症 8. 瘤胃内氨；蛋白质；蛋白质；非氨态氮；植物酶活性，提高单胃动物对；磷 9. 谷氨酸；赖氨酸；苏氨酸；异亮氨酸；缬氨酸；精氨酸 10. 谷氨酸钠为鲜味剂；色氨酸和甘氨酸为甜味剂；赖氨酸为营养增强剂 11. 保护细胞；影响细胞移动；增殖和分化；影响细胞的吞噬功能；屏蔽细胞膜上的机械感受器；调节合成细胞的能力；肿瘤 12. 深层通气发酵；固体通风发酵 13. 纯菌种的分离（用选择性培养法和平板分离法纯化得到）；纯培养操作及其保障措施（高温灭菌、空气除菌、无菌操作、认真贯彻执行生产操作规程等）；纯培养空间（经过无菌处理并在无菌条件保障下的玻璃培养器皿及其培养箱、摇瓶及摇瓶培养室、各种类型的大小发酵罐及其补料等设备） 14. 寄生；拮抗；竞争四、解释题

1. 菌根是土壤中某些真菌侵染植物根部，与其形成的菌-根共生体。与农业关系密切的是VA 菌根真菌，它是土壤共生真菌中宿主和分布范围最广的一类真菌。研究表明，V A菌根不但侵染的植物种类多，范围广，而且V A菌根的菌丝具有协助植物吸收磷类营养的功能。 2. 有机肥是利用历史最悠久、用量最大、综合效益俱佳的“多功能”微生物肥料，它实际上是动物排泄物、动植物残体被微生物部分或全部降解的混合物。它不但给作物提供养料，还能改善土壤的耕作性能。 3. 原位发酵又称分批发酵或分批培养，即在一个发酵罐或生物反应器中，投入一定量的发酵培养基，灭菌消毒后接入一定量的种子液，控制合适的发酵条件，让微生物在发酵罐中生长繁殖，当菌丝体增长到一定量后发酵过程自动转入次级代谢阶段，产生大量的目标产物（即药物)最后当产物的量不再明显增加时所有的发酵液一次性放出，进入分离纯化车间。 4. 以一定速度向发酵罐内连续供给新鲜培养基的同时，将含有微生物和产场的培养液以相同速度从发酵罐内放出，发酵罐内液量维持恒定。经过一定时问培养后，培养物就近似于恒定状态的生长和代谢，这时所有物质（营养物、产物、微生物细胞等）的浓度、环境的物理状态（如pH、DO）以及比生长速率等始终维持不变，即稳定状态。 5. 定向进化技术指人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外对基因进行随机突变，从一个或多个已经存在的亲本酶（天然的或者人为获得的）出发，经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过一定的筛选或选择方法最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。 6. 易错PCR（error prone PCR）是指在扩增目的基因的同时引入碱基错配，导致目的基因随机突变。五、简答题 1. 单细胞生产常用原料有：糖蜜、亚硫酸盐纸浆废液、谷氨酸发酵废液、稻草、稻壳、玉米芯、木榍等的水解液；天然气、乙醇、乙烷等；乳制品和啤酒生产的废弃物；发酵方法：深层通气发酵和固体通风发酵；主要用途：作为单细胞食品；提取核苷酸、辅酶A、乳糖酶等医药及生物试剂；主要菌种：产元假丝酵母、解脂假丝酵母、嗜石油假丝酵母等。 2. 原料；豆饼、麸皮、大麦、小麦和大豆等；菌种：黄曲霉、米曲霉；工艺流程：大豆等→熏蒸→接种→制曲→加盐和水→发酵→压滤→酱油。

生物样品前处理

生物样品前处理 2010-01-08 12:02:45| 分类：生物样品预处理生物样品的前处理 .生物样品预处理生物样品的前处理是体内药物分析的一个重要环节,也是整个分离分析过程中最繁琐的一个步骤。与原料药物和制剂相比,生物样品更为复杂:微量药物分布在大量生物介质中,对分析仪器的灵敏度提出了更高的要求;样品中含有大量内源性物质,不仅能与药物及其代谢物结合,而且常干扰测定。因此,生物样品中的药物必须经过分离、纯化与浓集,必要时还需对待测组分进行化学改性处理,从而为最后测定创造良好的条件。传统的样品前处理方法仍为溶剂萃取法,方法耗时、危害人体、污染环境,萃取使用大量溶剂,分析时需浓缩,会导致有效组分的损失。本文仅对近年相关文献报道的几种药物分析过程中生物样品预处理技术及应用进行综述。超临界流体萃取( supercritical fluid extraction ,SFE) 是环保型分离浓集技术,具有萃取效率和选择性高、省时、萃取溶剂(如便于挥发、提取物较为“干净”、环境污染少、操作条件易于改变等特点,不仅广泛应用于食品、化妆品、环境、医药及一些天然产物的分析,在生物体内药物分析方面也显示出一定的优势[1]。超临界流体萃取技术的原理是控制超临界流体在高于临界温度和临界压力的条件下,从目标物中萃取成分,当恢复到常压和常温时,溶解

在超临界流体中的成分立即与气态的超临界流体分开。该技术对于挥发性成分、脂溶性成分、小分子萜类及热敏物质等的提取,较传统方法有很多优越性。常用萃取剂为。由于超临界流体是非极性溶剂,对于低极性和非极性的化合物表现出优异的溶解性能,而对于大多数无机盐、极性较强的物质几乎不溶。通过添加改性剂,如甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯和水等,并通过加压改善其溶解性能,使超临界流体萃取技术对生物碱类、黄酮类、皂甙类等的应用也日趋普遍。针对生物样品中通常含有不同极性组分或含有大量脂溶性成分干扰的特点,当前研究工作主要集中在如何提高超临界流体的萃取能力及消除脂类干扰两个方面[2]。固相萃取技术以选择性吸附与选择性洗脱的液相色谱分离原理,对样品进行分离和纯化。按照所采用固相萃取剂的种类,可将固相萃取法分为3类:正相、反相和离子交换固相萃取。当前固相萃取剂的开发主要侧重于扩大萃取剂的适用范围,将极性、非极性基团,离子交换基团或高分子树脂混合使用的混合型吸附剂,成为目前研究的热点。根据分析物的极性、溶解度、pKa等理化性质,选取适合的固相萃取柱。对于非离子性物质而言,优先使用极性相似的固相萃取柱,如弱极性或非极性化合物选用、、等非极性柱,极性较强的则使用CN、柱。强离子型分析物则采用离子交换固相萃取。对于某些弱酸或弱碱性化合物,

9012生物样品定量分析方法验证指导原则

中国药典2015年版 9012生物样品定置分析方法验证指导原则一、范围准确测定生物基质（如全血、血清、血浆、尿）中的药物浓度，对于药物和制剂研发非常重要。这些数据可被用于支持药品的安全性和有效性，或根据毒动学、药动学和生物等效性试验的结果做出关键性决定。因此，必须完整地验证和记录应用的生物分析方法，以获得可靠的结果。本指导原则提供生物分析方法验证的要求，也涉及非临床或临床试验样品实际分析的基本要求，以及何时可以使用部分验证或交叉验证，来替代完整验证。本指导原则二和三主要针对色谱分析方法，四针对配体结合分析方法。生物样品定量分析方法验证和试验样品分析应符合本指导原则的技术要求。应该在相应的生物样品分析中遵守 G L P原则或GC P原则。二、生物分析方法验证 (一）分析方法的完整验证分析方法验证的主要目的是，证明特定方法对于测定在某种生物基质中分析物浓度的可靠性。此外，方法验证应采用与试验样品相同的抗凝剂。一般应对每个新分析方法和新分析物进行完整验证。当难于获得相同的基质时，可以采用适当基质替代，但要说明理由。一个生物分析方法的主要特征包括：选择性、定量下限、响应函数和校正范围（标准曲线性能）、准确度、精密度、基质效应、分析物在生物基质以及溶液中储存和处理全过程中的稳定性。有时可能需要测定多个分析物。这可能涉及两种不同的药物，也可能涉及一个母体药物及其代谢物，或一个药物的对映体或异构体。在这些情况下，验证和分析的原则适用于所有涉及的分析物。对照标准物质在方法验证中，含有分析物对照标准物质的溶液将被加人到空白生物基质中。此外，色谱方法通常使用适当的内标。应该从可追溯的来源获得对照标准物质。应该科学论证对照标准物质的适用性。分析证书应该确认对照标准物质的纯度，并提供储存条件、失效日期和批号。对于内标，只要能证明其适用性即可，例如显示该物质本身或其相关的任何杂质不产生干扰。当在生物分析方法中使用质谱检测时，推荐尽可能使用稳定同位素标记的内标。它们必须具有足够高的同位素纯度，并且不发生同位素交换反应，以避免结果的偏差。 1.选择性该分析方法应该能够区分目标分析物和内标与基质的内源性组分或样品中其他组分。应该使用至少6个受试者的适宜的空白基质来证明选择性（动物空白基质可以不同批次混 9012生物样品定量分析方法验证指导原则合），它们被分别分析并评价干扰。当干扰组分的响应低于分析物定量下限响应的20%,并低于内标响应的5%时，通常即可以接受0 应该考察药物代谢物、经样品预处理生成的分解产物以及可能的同服药物引起干扰的程度。在适当情况下，也应该评价代谢物在分析过程中回复转化为母体分析物的可能性。 2.残留应该在方法建立中考察残留并使之最小。残留可能不影响准确度和精密度。应通过在注射高浓度样品或校正标样后，注射空白样品来估计残留。高浓度样品之后在空白样品中的残留应不超过定量下限的20%，并且不超过内标的5%。如果残留不可避免，应考虑特殊措施，在方法验证时检验并在试验样品分析时应用这些措施，以确保不影响准确度和精密度。这可能包括在高浓度样品后注射空白样品，然后分析下一个试验样品。 3.定量下限定量下限是能够被可靠定量的样品中分析物的最低浓度，具有可接受的准确度和精密度。定量下限是标准曲线的最低点，应适用于预期的浓度和试验目的。 4.标准曲线应该在指定的浓度范围内评价仪器对分析物的响应，获得标准曲线。通过加人已知浓度的分析物（和内标）到空白基质中，制备各浓度的校正标样，其基质应该与目标试验样品基质相同。方法验证中研究的每种分析物和每一分析批，都应该有一条标准曲线。在进行分析方法验证之前，最好应该了解预期的浓度范围。标准曲线范围应该尽量覆盖预期浓度范围，由定量下限和定量上限(校正标样的最髙浓度）来决定。该范围应该足够描述分析物的药动学。应该使用至少6个校正浓度水平，不包括空白样品（不含分析物和内标的处理过的基质样品）和零浓度样品（含内标的处理过的基质〉。每个校正标样可以被多次处理和分析。应该使用简单且足够描述仪器对分析物浓度响应的关系式。空白和零浓度样品结果不应参与计算标准曲线参数。应该提交标准曲线参数，测定校正标样后回算得出的浓度应一并提交。在方法验证中，至少应该评价3条标准曲线。校正标样回算的浓度一般应该在标示值的:t l5%以内，定量下限处应该在±20%内。至少75%校正标样，含最少6个有效浓度，应满足上述标准。如果某个校正标样结果不符合这些标准，应该拒绝这一标样，不含这一标样的标准曲线应被重新评价，包括回归分析^ 最好使用新鲜配制的样品建立标准曲线，但如果有稳定性数据支持，也可以使用预先配制并储存的校正标样。 5.准确度分析方法的准确度描述该方法测得值与分析物标示浓度的接近程度，表示为：（测得值/真实值)x l00?^应采用加人已知 ? 363

《药典》原料药与药物制剂稳定性试验指导原则

附录ⅩⅠⅩC 原料药与药物制剂稳定性试验指导原则稳定性试验的目的是考察原料药或药物制剂在温度、湿度、光线的影响下随时间变化的规律，为药品的生产、包装、贮存、运输条件提供科学依据，同时通过试验建立药品的有效期。稳定性试验的基本要求是：（1）稳定性试验包括影响因素试验、加速试验与长期试验。影响因素试验用一批原料药或一批制剂进行。加速试验与长期试验要求用三批供试品进行。（2）原料药供试品应是一定规模生产的，供试品量相当于制剂稳定性试验所要求的批量，原料合成工艺路线、方法、步骤应与大生产一致。药物制剂供试品应是放大试验的产品，其处方与工艺应与大生产一致。药物制剂如片剂、胶囊剂，每批放大试验的规模，片剂至少应为10 000 片，胶囊剂至少应为10 000 粒。大体积包装的制剂如静脉输液等，每批放大规模的数量至少应为各项试验所需总量的10倍。特殊品种、特殊剂型所需数量，根据情况另定。（3）供试品的质量标准应与临床前研究及临床试验和规模生产所使用的供试品质量标准一致。（4）加速试验与长期试验所用供试品的包装应与上市产品一致。（5）研究药物稳定性，要采用专属性强、准确、精密、灵敏的药物分析方法与有关物质（含降解产物及其他变化所生成的产物）的检查方法，并对方法进行验证，以保证药物稳定性试验结果的可靠性。在稳定性试验中，应重视降解产物的检查。（6）由于放大试验比规模生产的数量要小，故申报者应承诺在获得批准后，从放大试验转入规模生产时，对最初通过生产验证的三批规模生产的产品仍需进行加速试验与长期稳定性试验。本指导原则分两部分，第一部分为原料药，第二部分为药物制剂。一、原料药原料药要进行以下试验。（一）影响因素试验此项试验是在比加速试验更激烈的条件下进行。其目的是探讨药物的固有稳定性、了解影响其稳定性的因素及可能的降解途径与降解产物，为制剂生产工艺、包装、贮存条件和建立降解产物分析方法提供科学依据。供试品可以用一批原料药进行，将供试品置适宜的开口容器中（如称量瓶或培养皿），摊成≤5mm厚的薄层，疏松原料药摊成≤10mm厚薄层，进行以下试验。当试验结果发现降解产物有明显的变化，应考虑其潜在的危害性，必要时应对降解产物进行定性或定量分析。 (1)高温试验供试品开口置适宜的洁净容器中，60℃温度下放置10 天，于第5 天和第10天取样，按稳定性重点考察项目进行检测。若供试品含量低于规定限度则在40℃条件下同法进行试验。若60℃无明显变化，不再进行40℃试验。 (2)高湿度试验供试品开口置恒湿密闭容器中，在25℃分别于相对湿度90%±5% 条件下放置10天，于第5天和第10天取样，按稳定性重点考察项目要求检测，同时准确称量试验前后供试品的重量，以考察供试品的吸湿潮解性能。若吸湿增重5% 以上，则在相对湿度75%±5%条件下，同法进行试验；若吸湿增重5%以下，其他考察项目符合要求，则不再进行此项试验。恒湿条件可在密闭容器如干燥器下部放置饱和盐溶液，根据不同相对湿度的要求，可以选择NaCl饱和溶液（相对湿度75%±1%，15.5～60℃），KNO3饱和溶液（相对湿度92.5%，25℃）。 (3)强光照射试验供试品开口放在装有日光灯的光照箱或其他适宜的光照装置内，于照度为4500 lx±500 lx的条件下放置10天，于第5天和第10天取样，按稳定性重点考察项目进行检测，特别要注意供试品的外观变化。关于光照装置，建议采用定型设备“可调光照箱”，也可用光橱，在箱中安装日光灯数支使达到规定照度。箱中供试品台高度可以调节，箱上方安装抽风机以排除可能产生的热量，箱上配有照度计，可随时监测箱内照度，光照箱应不受自然光的干扰，并保持照度恒定，同

生物等效性实验生物样品处理注意事项(严)知识讲解

生物等效性实验生物样品处理注意事项(严)

生物等效性实验生物样品处理注意事项一、样品采集后的的处理和贮存鉴于生物样本的特点，为了避免样品中被测药物发生分解或产生其他化学变化，取样后最好立即进行分析测定，但实际工作中几乎无法做到，常需将收集到的样品冷藏、冰冻，临用前再融化并放至室温后使用。在样本冷冻贮藏前，需及时进行处理。 1.1血液样本处理注意事项 1.1.1. 在肌肉注射或静脉输含有葡萄糖或电解质(含钾、钠、氯离子)的液体时，建议3小时以后采集静脉血样本进行这些项目的检验，以防止上述检验项目因输液引起的假性升高。 1.1.2保定非麻醉状态的动物时应尽量避免用力挤压动物头颈和胸腹，以免引起血液淤滞，局部组织缺氧，造成血液某些成分的改变，特别是测定乳酸，血液含氧量等指标时。 1.1.3血液中红细胞内外成分有很大差异，溶血可造成红细胞内的物质向细胞外转移，如K+、Mg2＋和某些酶类(LD、AST、ALT、ACP)；另外，溶血还可干扰某些化学项目(TBil、DBil、TC等)的测定，严重影响结果的准确性，血样本应防止溶血。引起溶血的原因有：注射器采血时抽吸力太大；血液与抗凝剂比例失调；混匀样本时过度振荡；注射器或采血容器带水或容器污染；全血放置时间长或突然受冷或受热；注射器中的血沫注入采血容器；真空采血时如未

采满至相应刻度，残存负压造成红细胞破裂；不拔针头直接注入采血容器；样本离心时离心力过大等。为避免溶血，取血时应注意： ①、抽拉注射器时应尽量避免注射器内产生大量真空； ②、添加抗凝剂后的容器在除必要干燥流程后应及时密封； ③、混匀样本时避免用力过度，切勿产生泡沫； ④、避免重复使用注射器、针头、采血管、毛细玻璃管等一次性用品，手术刀片和剪刀等器材取材时尽量洗去残留血液； ⑤、采血时的室温应控制在22℃至25℃，采取的血液容器在需要放入冰盒时，切勿紧贴冰袋，冰水； ⑥、当注射器内因吸入空气产生血沫时，注意弃掉血沫，在将血液注入采血容器时勿将血沫一并注入； ⑦、使用真空采血管需抽取负压时切勿过量； ⑧、将血液注入采血容器时要除去针头，轻柔推入； ⑨、离心带有血细胞的血样时，按照规格设定离心参数； 1.1.4. 正确选择采集管。通常情况下多采用血清为样本(不抗凝)，部分检测项目需注意样本属性为血清或血浆，两者不可替代。一些特殊检验项目需要使用抗凝剂时，应注意选择合适的抗凝剂并注意抗凝剂与血液的比例，以防止样本凝血或红细胞形态的改变；抗凝血样本采集后立即轻轻摇匀至少上下颠倒8次，以防凝血发生。 1.1.5. 多项化验采血顺序：血培养瓶(厌氧瓶优先)→蓝帽管→黑帽管→红/黄帽管→绿帽管→紫帽管→灰帽管→其他。

2015版药典生物样品定量分析方法验证指导原则(草案)

1 生物样品定量分析方法验证指导原则（草案） 1 1. 范围 2 准确测定生物基质（如全血、血清、血浆、尿）中的药物浓度，对于药物和3 制剂研发非常重要。这些数据可被用于支持药品的安全性和有效性，或根据毒动4 学、药动学和生物等效性试验的结果做出关键性决定。因此，必须完整地验证和5 记录应用的生物分析方法，以获得可靠的结果。6 本指导原则提供生物分析方法验证的要求，也涉及非临床或临床试验样品实7 际分析的基本要求，以及何时可以使用部分验证或交叉验证，来替代完整验证。8 生物样品定量分析方法验证和试验样品分析应符合本指导原则的技术要求。9 应该在相应的生物样品分析中遵守GLP原则或GCP原则。10 2. 生物分析方法验证11 2.1 分析方法的完整验证12 分析方法验证的主要目的是，证明特定方法对于测定在某种生物基质中分析13 物浓度的可靠性。此外，方法验证应采用与试验样品相同的抗凝剂。一般应对每14 个物种和每种基质进行完整验证。当难于获得相同的基质时，可以采用适当基质15 替代，但要说明理由。16 一个生物分析方法的主要特征包括：选择性、定量下限、响应函数和校正范17 围（标准曲线性能）、准确度、精密度、基质效应、分析物在生物基质以及溶液18 中储存和处理全过程中的稳定性。19 有时可能需要测定多个分析物。这可能涉及两种不同的药物，也可能涉及一20 个母体药物及其代谢物，或一个药物的对映体或异构体。在这些情况下，验证和21 分析的原则适用于所有涉及的分析物。22 对照标准物质23 在方法验证中，含有分析物对照标准物质的溶液将被加入到空白生物基质24 中。此外，色谱方法通常使用适当的内标。25 应该从可追溯的来源获得对照标准物质。应该科学论证对照标准物质的适用26 性。分析证书应该确认对照标准物质的纯度，并提供储存条件、失效日期和批号。27 对于内标，只要能证明其适用性即可，例如显示该物质本身或其相关的任何杂质28 不产生干扰。 29 当在生物分析方法中使用质谱检测时，推荐尽可能使用稳定同位素标记的内30 标。它们必须具有足够高的同位素纯度，并且不发生同位素交换反应，以避免结31 果的偏差。322

稳定性考察检验指南

稳定性试验指南：已有原料药和制剂产品的稳定性试验（EPMP/QWP/122/02 rev 1）执行日期：2004.03 1．介绍 1.1.目的：本指南是对《新原料药和制剂产品稳定性试验指南》（CPMP/ICH/2736/99corr）的扩展，它制定了已有原料药和相关制剂产品稳定性试验的要求。本指南中，已有原料药是指欧洲共同市场通过制剂产品批准的原料药。本指南适用于化学原料药及其制剂产品、草本药物、草本药物制剂及其相关草本药品，不适用于放射性制品、生物制品和通过生物技术生产的产品。本指南旨在例举已有原料药及其制剂产品主要稳定性资料的要求，但对实际情况中哟秋有特定的技术和具有特殊性的药品也给予了充分的灵活性。如有足够的科学依据也可使用其它方法。 1.2.范围：本指南旨在阐述已有原料药和相关制剂产品注册申请时需提交的资料。对于草本药物、草本制剂和草本药品，应参考《草本药品质量指南注意事项》稳定性章节（EMEA/CPMP2819/00）。 1.3.通则：稳定性试验的目的是为原料药或制剂产品的质量因受温度、湿度、光线等不同环境条件因素影响而发生的变化提供依据，并建立原料药的复检周期、制剂产品的货架寿命和建议贮存条件。本指南对试验条件选择的说明，参见《新原料药和制剂产品稳定性试验指南注意事项》（CPMP/ICH/2736/99现行）。 2．指南： 2.2.成品 2.2.1.通则：制剂产品正式稳定性考察计划的制定应以对原料药和制剂剂型的作用和性质的了解为基础。 2.2.2.光稳定性试验应对初期生产的至少一批制剂产品进行光稳定性试验。光稳定性试验的标准条件在《新原料药和药品光稳定性指南》（CPMP/ICH/279/95）中有描述。 2.2. 3.考察批次的选择：在提交申请时，应提供相同配方和相同剂型的建议市场销售用包装批次产品的稳定性考察资料。 2种方法可供选择： a)对于传统剂型（如：即释固体制剂、溶液剂）和已知有效成份稳定的制剂产品，可提供至少2 批中试产品的稳定性考察资料。 b)对于关键剂型或已知有效成份不稳定的制剂产品，应提供3批初期生产的产品稳定性考察数据。其中2批应至少为中试批量，第三批批量可略小些。初期产品的的生产工艺应模拟正常生产时的工艺，且产品质量相同并符合拟上市产品的质量标准。如果有可能，应使用不同批次的原料药进行生产。除非矩阵试验或篮状试验，应对每个规格和每种包装的产品进行稳定性考察。可提供其他支持性数据。 2.2.4.包装容器应对拟上市的产品包装（包括外包装和容器标签）进行稳定性考察。对于内包装容器外的产品或其

微生物样品前处理作业指导书

微生物样品前处理作业指导书 1.目的：为保证微生物样品检测的有效性，必须有合理的方法指导。 2.适用范围：食品（微生物检测）样品的前处理。 3.职责：由微生物操作人员进行微生物检测前的样品前处理。 4.操作步骤： 1实验室接到送检样品后应认真核对登记,确保样品的相关信息完整并符合检验要求。 1.1.2 实验室应按要求尽快检验。若不能及时检验，应采取必要的措施保持样品的原有状态，防止样品中目标微生物因客观条件的干扰而发生变化。 1.1.3 冷冻食品应在 45 ℃以下不超过15 min ，或2 ℃～5 ℃不超过 18 h 解冻后进行检验。 1.2 检验方法的选择 1.2.1 应选择现行有效的国家标准方法。 1.2.2 食品微生物检验方法标准中对同一检验项目有两个及两个以上定性检验方法时，应以常规培养方法为基准方法。 1.2.3 食品微生物检验方法标准中对同一检验项目有两个及两个以上定量检验方法时，应以平板计数法为基准方法。 2前处理步骤 2.1肉与肉制品检验按GB/T 4789.17-2003执行蛋与蛋制品检验按GB/T 4789.19-2003执行

水产食品检验按GB/T 4789.20-2003执行冷冻饮品、饮料检验按GB/T 4789.21-2003执行调味品检验按GB/T 4789.22-2003执行冷食菜、豆制品检验按GB/T 4789.23-2003执行糖果、糕点、蜜饯检验按GB/T 4789.24-2003执行酒类产品前处理按GB 4789.25-2003执行 2.2其他产品按GB 4789.1-2016及GB 4789.2-2016中步骤进行样品的稀释 2.2.1 固体和半固体样品:称取25g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1∶10的样品匀液。 2.2.2 液体样品:以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1∶10的样品匀液。 2.2.3 用1mL 无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1∶100的样品匀液。 2.2.4 同理操作,制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次,换用1 次1mL 无菌吸管或吸头。批准/日期：审核/日期：编制/日期：

化学原料药及制剂稳定性试验指导原则

附件２化学药物（原料药和制剂)稳定性研究技术指导原则（修订) 一、概述原料药或制剂的稳定性是指其保持物理、化学、生物学和微生物学特性的能力。稳定性研究是基于对原料药或制剂及其生产工艺的系统研究和理解，通过设计试验获得原料药或制剂的质量特性在各种环境因素(如温度、湿度、光线照射等)的影响下随时间变化的规律，并据此为药品的处方、工艺、包装、贮藏条件和有效期/复检期的确定提供支持性信息。稳定性研究始于药品研发的初期,并贯穿于药品研发的整个过程。本指导原则为原料药和制剂稳定性研究的一般性原则,其主要适用于新原料药、新制剂及仿制原料药、仿制制剂的上市申请（NＤA/ＡNDA,Ｎew ＤrugＡｐplｉcaｔion/Ａbbreviaｔｅd New Drug Aｐｐlicaｔiｏn)。其他如创新药(NCＥ,New Ｃhem ｉcal Ｅｎtity）的临床申请（IND,Inｖestiｇational NeｗＤrｕg Ａｐpｌication）、上市后变更申请（VariatiｏｎApｐｌicatｉon）等的稳定性研究,应遵循药物研发的规律，参照创新药不同临床阶段质量控制研究、上市后变更研究技术指导原则的具体要求进行。本指导原则是基于目前认知的考虑,其他方法如经证明合理也可采用。二、稳定性研究的基本思路

（一)稳定性研究的内容及试验设计稳定性研究是原料药或制剂质量控制研究的重要组成部分,其是通过设计一系列的试验来揭示原料药和制剂的稳定性特征。稳定性试验通常包括影响因素试验、加速试验和长期试验等。影响因素试验主要是考察原料药和制剂对光、湿、热、酸、碱、氧化等的稳定性,了解其对光、湿、热、酸、碱、氧化等的敏感性,主要的降解途径及降解产物，并据此为进一步验证所用分析方法的专属性、确定加速试验的放置条件及选择合适的包装材料提供参考。加速试验是考察原料药或制剂在高于长期贮藏温度和湿度条件下的稳定性,为处方工艺设计、偏离实际贮藏条件其是否依旧能保持质量稳定提供依据，并根据试验结果确定是否需要进行中间条件下的稳定性试验及确定长期试验的放置条件。长期试验则是考察原料药或制剂在拟定贮藏条件下的稳定性，为确认包装、贮藏条件及有效期/复检期提供数据支持。对临用现配的制剂，或是多剂量包装开启后有一定的使用期限的制剂,还应根据其具体的临床使用情况,进行配伍稳定性试验或开启后使用的稳定性试验。稳定性试验设计应围绕相应的试验目的进行。例如，影响因素试验的光照试验是要考察原料药或制剂对光的敏感性，通常应采用去除包装的样品进行试验;如试验结果显示其过度降解，首先要排除是否因光源照射时引起的周围环境温度升高造成的降解,故可增加避光的平行样品作对照，以消除光线照射之外其他

生物样品分析方法验证指导原则- 欧洲

European Medicines Agency 7 Westferry Circus, Canary Wharf, London, E14 4HB, UK 1 2 3 London, 19 November 2009 Doc. Ref: EMEA/CHMP/EWP/192217/2009 COMMITTEE FOR MEDICINAL PRODUCTS FOR HUMAN USE 4 (CHMP) 5 6 DRAFT GUIDELINE ON VALIDATION OF BIOANALYTICAL METHODS 7 8 DRAFT AGREED BY THE EFFICACY WORKING PARTY September 2009 ADOPTION BY CHMP FOR RELEASE FOR CONSULTATION 19 November 2009 END OF CONSULTATION (DEADLINE FOR COMMENTS) 31 May 2010 9 Comments should be provided using this template to EWPSecretariat@emea.europa.eu 10 KEYWORDS CHMP, EMEA, Guideline, validation, bioanalytical method, analyses

GUIDELINE ON VALIDATION OF BIOANALYTICAL METHODS 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 TABLE OF CONTENTS 1.INTRODUCTION (BACKGROUND) (3) 2.SCOPE (3) 3.LEGAL BASIS (3) 4.METHOD VALIDATION (4) 4.1C OMPLETE VALIDATION OF AN ANALYTICAL METHOD (4) 4.1.1Selectivity (4) 4.1.2Carry-over (5) 4.1.3Lower limit of quantitation (5) 4.1.4Calibration curve (5) 4.1.5Accuracy (6) 4.1.6Precision (7) 4.1.7Dilution integrity (7) 4.1.8Matrix effect (7) 4.1.9Stability (8) 4.2P ARTIAL VALIDATION (9) 4.3C ROSS VALIDATION (9) 4.4L IGAND-BINDING ASSAYS (9) 5.ANALYSIS OF STUDY SAMPLES (10) 5.1A NALYTICAL RUN (11) 5.2A CCEPTANCE CRITERIA OF AN ANALYTICAL RUN (11) 5.3C ALIBRATION RANGE (12) 5.4R EANALYSIS OF STUDY SAMPLES (12) 5.5I NTEGRATION (13) 6.INCURRED SAMPLES REANALYSIS (13) 7.STUDY REPORT (13) DEFINITIONS (16)