PCR反应体系中各种成分的作用

PCR反应体系中各种成分的作用
PCR反应体系中各种成分的作用

PCR反应体系中各种成分的作用

不同模板浓度的实验结果

用相同的引物、两种不同的模板,对6种不同模板量进行PCR扩增,发现在模板量<25ng的条件下,扩增产物强度相应减弱,大约到2ng左右时无扩增产物;当模板量在25ng~200ng之间时,扩增产物基本稳定,条带清晰、稳定,分辨率高;当模板量>200ng时,会出现大片段扩增产物的缺失或无扩增产物,且点样孔至泳道会出现相应增强的弥散背景。综合考虑,在25μl的PCR反应体系中,模板DNA以25~100ng为最适用量。同时模板DNA在200ng以下不影响扩增结果,但为降低TE缓冲液中EDTA对反应体系中Mg2+的不良影响程度,应该尽量降低DNA模板用量。

不同Mg2+浓度时实验结果

设置不同Mg2+浓度,当Mg2+浓度为1 0mM时,无PCR扩增产物;Mg2+浓度为1 5~2 5mM时,随着Mg2+浓度的增加,PCR扩增产物带型基本一致,但以2 0mM的扩增效果最好

不同引物浓度对PCR结果的影响

设置5种不同浓度的引物进行PCR扩增,当引物浓度在0 1~0 2μM时,扩增结果基本一致;但随着引物浓度的逐渐增加,开始出现弥散背景增强的趋势,并且有些扩增带发生减弱或缺失。为了保证反应结果的稳定性和特异性,引物浓度以0 .2μM左右为宜。

不同dNTP浓度对PCR结果的影响

采用2种引物(OPB17、OPA16),分别以4种不同的dNTP浓度进行PCR反应,发现dNTP浓度在100μM、150μM、200μM、300μM时,随着浓度的减小,扩增带明显减少或扩增强度减弱,当dNTP浓度<200μM时,扩增产物丰富、清晰、带浓,扩增片段产率与dNTP浓度呈正相关。综合考虑,以100~200μM的dNTP浓度为佳。

TaqDNA聚合酶对扩增结果的影响

设置5个梯度的TaqDNA聚合酶浓度,结果表明随着TaqDNA聚合酶浓度的增高,扩增产物量呈增多趋势。在0 5u~2 5u浓度间均有扩增产物,但随着TaqDNA聚合酶浓度增加的同时,弥散背景也相应增强。综合考虑,TaqDNA聚合酶浓度以1 0~1 5u结果较好

不同退火温度下的扩增效果

引物用OPD16和OPA01,按照优化的PCR反应体系将退火温度分别设置为33℃、36℃、39℃、42℃。结果表明随着退火温度降低,非特异性产物增加,有弥散背景;退火温度升高,特异性相对增加。

Mgcl2与dNTP互相作用及对PCR反应的影响用同一引物OPD07、相同模板DNA比较3种MgCl2浓度与3种dNTP浓度完全随机相结合的9个处理的PCR结果,研究了Mgcl2与dNTP的相互作用。结果表明,Mgcl2在低浓度时,

过量的dNTP对Mg2+的螯合作用明显,表现为降低Mg2+的酶催作用,PCR扩增产物减少或无,而低量的dNTP对Mg2+酶催的抑制作用减少,PCR扩增产物增多。在高浓度Mgcl2浓度下,dNTP无抑制作用。在相同Mg2+离子浓度和足量dNTP时,扩增产物相似。1-9泳道分别代表Mgcl2(mM)/dNTP(μM)的浓度(1/100、1/200、1/300、2/100、2/200、2/300、3/100、3/200、3/300)。

PCR反应体系与反应条件

标准的PCR反应体系:

10×扩增缓冲液 10ul

4种dNTP混合物各200umol/L

引物各10~100pmol

模板DNA 0.1~2ug

Taq DNA聚合酶 2.5u

Mg2+ 1.5mmol/L

加双或三蒸水至 100ul

PCR反应五要素:参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物:引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA 序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

设计引物应遵循以下原则:

①引物长度: 15-30bp,常用为20bp左右。

②引物扩增跨度:以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3’端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。

⑤引物3’端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处。

⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。

引物量:每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性

扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。

酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应,一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。

dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP 溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M NaOH或1M Tris。HCL 的缓冲液将其PH调节到7.0~7.5,小量分装, -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中,dNTP应为50~200umol/L,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。

模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是:溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS 还能与蛋白质结合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR扩增。RNA模板

提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA。

Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR反应中,各种dNTP浓度为200umol/L时,Mg2+浓度为1.5~2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少。

PCR扩增时建议在混合物上面铺一层石蜡油,减少PCR过程中尤其是变性时液体蒸发所造成的产物的丢失。研究表明,应用石蜡油可使扩增产量增加5倍,可能与石蜡油维持热恒定和整个反应体系中盐浓度有关。

尿嘧啶-DNA-糖基酶(UDG)

就是在pre-PCR阶段用dUTP替代dTTP,UDG存在于反应混合液中,其它所有反应成分保持不变。PCR反应的DNA链延长过程中DNA聚合酶用dU代替了dT,因而产物DNA序列中含有dU而不是dT,在新样品进行反应前,它们首先面临的是UDG。含有U的DNA链一旦遇上UDG,这些U就会被切除而使该链具有缺刻。在接下来的PCR加热过程中,有碱基缺失的DNA链分开后不能够被扩增。因此,UDG的使用赋予热启动一个额外的优点就是它能降解第一轮完整的循环之前形成的所有PCR产物。

TaqDNA聚合酶

Taq DNA聚合酶是从一种水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT1株分离提取的.yT是一种嗜热真菌,能在70~75℃生长.该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离的。该酶基因全长2496个碱基,编码832个氨基酸,酶蛋白分子为 94KDa.其比活性为200000单位/mg.75~80℃时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷酸,70℃延伸率大于60个核苷酸/秒,55℃时为24个核苷酸/秒.温度过高(90℃以上) 或过低(22℃)都可影响Taq DNA聚合酶的活性,该酶虽然在90℃以上几乎无DNA合成,但确有良好的热稳定性,在PCR循环的高温条件下仍能保持较高的活性.在92.5℃、95℃、97.5℃时,PCR 混合物中的Taq DNA聚合酶分别经130min,40min和5~6min后,仍可保持50%的活性,实验表明.PCR反应时变性温度为95℃~20sec,50个循环后,Taq DNA聚合酶仍有65%的活性.Taq DNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条件,也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的原因.Taq DNA聚合酶还具有逆转录活性,其作用于类似逆转录酶.此活性温度一般为65~68℃,有Mn2+存在时,其逆转录活性更高.

TaqDNA聚合酶是Mg2+依赖性酶,该酶的催化活性对Mg2+浓度非常敏感.以活性程度很低的鲑鱼精子DNA为模板,dNTP的浓度为0.7~0.8mmol/L时,用不同浓度Mg2+进行 PCR反应10min,测定结果为Mgcl2浓度在2.0mmol/L时该酶催化活性最高,此浓度能最大

限度地激活TaqDNA聚合酶的活性,Mg2+过高就抑制酶活性,当Mgcl2浓度在 10mmol/L时可抑制40~50%的酶活性.由于Mg2+能与dNTP结合而影响PCR反应液中游离的Mg2+浓度,因而Mgcl2的浓度在不同的反应体系中应适当调整,优化浓度.一般反应中Mg2+浓度至少应比dNTP总浓度高0.5~1.0mmol/L.适当浓度的KCL能使Taq DNA聚合酶的催化活性提高50~60%,其最适浓度为50mmol/L,高于75mmol/L时明显抑制该酶的活性.

1,引物和dNTP

100ul的反应体系中通常PRIMERS的浓度为0.3uM-3uM之间.dNTPs 在37uM-1.5uM.引物为15-25bp.过长或过短非特异性提高.

2,模板DNA

通常PRIMERS是10倍于DNA模板.如果引物对模板DNA的比例太高,非特异产物会提高,PCR效率降低.传统的PCR模板为50ngDNA.

3,退火温度

退火温度和引物结合模板的能力.结合力强温度高,反之,温度低.

4,延伸温度和时间

延伸温度通常为70-75C,时间取决于PCR产物的长度,一般100bp/Sec.1KB片段一般1分钟即可.

5.dNTPS

该成分为酸性,使用前应该调pH为7.0-7.5,浓度一般为20-200uM.量高,加快反应但降低精确度.

6.TAQ

酶一般为0.5-5U,依片段长度和复杂性(G/C)不同区别.

Mg2+是Taq DNA聚合酶活性所必需的,Mg2+浓度除影响酶活性与忠实性外,?也影响引物的退火, 模板与PCR产物的解链温度,产物的特异性引物二聚体的形成等。Mg2+浓度过低时,酶活力明显降低;过高时,酶可催化非特异性扩增。PCR中Mg2+浓度在0.5~2.5mmol/L之间。如果溶液中存在EDTA,或在引物贮备液中有其他螯合物或者DNA模板,会干扰Mg2+的浓度。因此,要适当调整Mg2+的用量。

Mg2+浓度优化法:首先须知模板DNA量,引物和dNTP的浓度和设定的PCR循环参数。反应中的PCR缓冲液中不加Mg2+。Mg2+是从10mmol/L MgCl2贮存液中逐一加入反应管中。开始以0.5mmol/L递增(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5~5.0mmol/L),在确定了Mg2+的适宜浓度以后,再以0.2mmol/L递增和递减n个浓度,来确定Mg2+的最适浓度。

dNTP溶于pH为7.0的NaOH贮存液中,最初的贮存液可稀释到10mol/L,分装后存放在-20℃冰箱中。dNTP使用浓度在20~200 μmol/L之间。4种dNTP?必须等浓度配合以减少错配误差。

在PCR反应中,使用低dNTP浓度,?可减少非靶位置启动和延

伸时的核苷酸错误掺入。一般可根据靶序列的长度和组成来决定最低dNTP浓度。例如在100μl?的反应体系中,4种dNTP的浓度为20μmol/L,可基本满足合成2.6μg DNA或?10pmol/L?的400bp序列。使用低dNTP浓度(每种dNTP浓度为2μmol/L),能够高度灵敏地(1/107)?扩增ras基因点突变的等位基因。

(一)引物设计的原则

1.一般原则

(1)引物长度应在15~30bp。其Tm=(G+C)×4+(A+T)×2,引物的有效长度Ln=2(G+C)+(A+T); Ln<38,因为>38时,最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度74℃,不能保证引物的特异性。

(2)引物中碱基的分布应当是随机的,避免一连串相同的碱基。3,端不应超过3?个连续的G或C,因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。

(3)G+C含量在40%~60%。

(4)两个引物在3,端绝对不能出现同源性,否则会形成二聚体。两引物之间不应有互补性,引物间连续的互补碱基必须少于4个。

2.引物的3,端引物的延伸是从3,端开始的,因此,引物3,端的末位碱基在很大程度上影响Taq DNA聚合酶的延伸效率,不能进行任何修饰。?实验表明,不同碱基的引发效率在引物3,端末位碱基处有错配时,有很大的不同。同等条件下,引物3,端第2位或3、4?位的错配对扩增量影响不大,但易出现非特异扩增和引物二聚体。所

以在设计引物时,应注意引物3,端尽量不用T,尤其应避免连续2个或2个以上的T。

3.引物的5,端引物的5,端对扩增特异性影响不大。因此可以被修饰而不影响扩增的特异性。如增加酶切位点、引入突变位点、标记生物素等。

4.密码子的简并,如扩增3,端区域,引物3,端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,影响扩增特异性与效率。

(二)引物的浓度

为使PCR效率达到最高,必须保证反应混合物中有足够的引物和dNTP。一般PCR反应中,引物的终浓度为0.2~1μmol/L。在此范围内,PCR?产物的量基本相同;但引物低于0.2μmol/L时,产物量降低。引物浓度过高则会促进非特异产物合成,还会增加引物二聚体的形成。非特异产物和引物二聚体又可作为PCR反应的底物,与靶序列竞争DNA聚合酶和dNTP底物,从而使靶序列的扩增量降低。

几乎所有形式的DNA和RNA都是PCR反应的合适底物,包括基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、预先扩增的DNA、cDNA和mRNA。大多数PCR操作中,对DNA模板的要求都不高,纯度要求亦不严,用量很低。理论上,单拷贝基因都可以扩增,但从高度复杂的DNA样品中进行扩增,可能比从质粒、噬菌体中进行扩增要困难些,如在PCR反应前用机械剪切或稀有限制酶消化基因组DNA可提高产量。

核酸标本来源广泛,可以从纯培养的细胞或微生物中提取,也可以从临床标本(血、尿、粪便、体腔积液、嗽口水等)及其他标本(血斑、毛发、?精斑等)中直接提取。无论标本来源如何?,?待扩增核酸都需部分纯化以去除核酸标本中的DNA聚合酶抑制物。以RNA作为模板进行扩增时,需要逆转录成cDNA?后才能进行正常的PCR循环。PCR 反应中的模板加入量一般为102~105个拷贝靶序列。人基因组DNA 1μg?相当于3×105个单拷贝靶分子;大肠杆菌DNA 1μg相当于3×105个靶分子。对于细菌基因组DNA或质粒DNA,每次反应所需量仅为pg到ng级。

扩增靶序列的长度根据不同的要求而不同,目的物一般在500bp以内,以100~300bp为佳。对扩增较长的PCR片段,模板的质量最为重要,在抽提纯化DNA的过程中,?应最大限度地避免其损伤。操作时尽可能减少反复吹打,可选用大孔径吸头,以避免对DNA的随机剪切。

PCR缓冲液(PCr Buffer)

用于PCR的标准缓冲液见PCR操作范例。于72℃时,反应体系的pH值将下降1个单位,接近于7.2。二价阳离子的存在至关重要,影响PCR的特异性和产量。实验表明,Mg2+优于Mn2+,而Ca2+无任何作用。

1.Mg2+浓度Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L(当各种dNTP浓度为200mmol/L时),但并非对任何一种模板与引物的结合都是最佳的。首次使用靶序列和引物结合时,都要把Mg2+浓度调到最佳,其浓度变化范围为1~10mmol/L。Mg2+过量易生成非特异性扩增产物,Mg2+不足易使产量降低。

样品中存在的较高浓度的螯合剂如EDTA或高浓度带负电荷的离子基团如磷酸根,会与Mg2+结合而降低Mg2+有效浓度。因此,用作模板的DNA应溶于10mmol/l Tris-HCl(pH7.6)0.1mmol/L EDTA 中。

dNTP含有磷酸根,其浓度变化将影响Mg2+的有效浓度。标准反应体系中4×dTNPs的总浓度为0.8mmol/L,低于1.5mmol/L的Mg2+浓度。因此,在高浓度DNA及dNTP条件时,必须相应调整Mg2+的浓度。

2.Tris -HCl缓冲液在PCR中使用10~50mmol/L的Tris –HCl缓冲液,很少使用其他类型的缓冲液。Tris缓冲液是一种双极化的离子缓冲液,pKa为8.3(20℃),△pKa为0.021/℃。因此,20mmol/l Tris pH8.3(20℃)时,在典型的热循环条件下,真正的pH值在7.8~6.8之间。

3.KCl浓度K+浓度在50mmol/L 时能促进引物退火。但现在的研究表明,NaCl浓度在50mmol/L时,KCl浓度高于50mmol/L将会抑制Taq酶的活性,少加或不加KCl对PCR结果没有太大影响。

4.明胶明胶和BSA或非离子型去垢剂具有稳定酶的作用。一般用量为100μg/ml,但现在的研究表明,加或不加都能得到良好和PCR结果,影响不大。

5.二甲基亚砜(DMSO)在使用Klenow片段进行PCR时DMSO是有用的;加入10%DM-SO有利于减少DNA的二级结构,使(G+C)%含量高的模板易于完全变性,在反应体系中加入DMSO使PCR产物直接测序更易进行,但超过10%时会抑制Taq DNA聚合酶的活性,因此,大多数并不使用DMSO。

模板

单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。若起始材料是RNA,须先通过逆转录得到第一条cDNA。虽然PCR可以仅用极微量的样品,甚至是来自单一细胞的DNA,但为了保证反应的特异性,还应用ng级的克隆DNA,μg水平的单拷贝染色体DNA或104拷贝的待扩增片段作为起始材料,模板可以是粗品,但不能混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白。

DNA的大小并不是关键的因素,但当使用极高分子量的DNA (如基因组的DNA时),如用超声处理或用切点罕见的限制酶(如Sal1和Not1)先行消化,则扩增效果更好。闭环靶序列DNA的扩增效率略低于线状DNA,因此,用质粒作反应模板时最好先将其线状化。

模板靶序列的浓度因情况而异,往往非实验人员所控制,实验可按已知靶序列量逆减的方式(1ng,0.1ng,0.001ng等),设置一组对照反应,以检测扩增反应的灵敏度是否符合要求。

标准的PCR反应体系

标准的PCR反应体系 PCR反应体系与反应条件 -------------------------------------------------------------------------------- 标准的PCR反应体系: 10×扩增缓冲液10ul 4种dNTP混合物各200umolL 引物各10~100mol 模板DNA 01~2ug TqDNA聚合酶25u g2+ 15mmolL 加双或三蒸水至100ul PCR反应五要素:参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和g2+ 引物:引物是PCR特异性反应的关键,PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则: ①引物长度:15-30b,常用为20b左右。 ②引物扩增跨度:以200-500b为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。 ③引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。 ⑤引物3'端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处。

⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量:每条引物的浓度01~1umol或10~100mol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。 酶及其浓度目前有两种TqDNA聚合酶供应,一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2。5U(指总反应体积为100ul时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。 dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1NH或1Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到70~75,小量分装,-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中,dNTP应为50~200umolL,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与g2+结合,使游离的g2+浓度降低。 模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是:溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS还能与蛋白质 结合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法, 要防止RNse降解RNA。 g2+浓度g2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR反应中,各种dNTP浓度为200umolL时,g2+浓度为15~20mmolL为宜。g2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低TqDNA聚合酶的活性,使反应产物减少。 PCR反应条件的选择 PCR反应条件为温度、时间和循环次数。 温度与时间的设置:基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90~95℃变性,再迅速冷却至40~60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70~75℃,在TqDNA聚合酶的作用下,使引物链沿模板延 伸。对于较短靶基因(长度为100~300b时)可采用二温度点法,除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸(此温度TqDNA酶仍有较高的催化活性)。

PCR反应条件体系总结

PCR反应体系与反应条件 -------------------------------------------------------------------------------- 标准的PCR反应体系: 10×扩增缓冲液10ul 4种dNTP混合物各200umol/L 引物各10~100pmol 模板DNA 0.1~2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至100ul PCR反应五要素:参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物:引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板D NA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则: ①引物长度:15-30bp,常用为20bp左右。 ②引物扩增跨度:以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。

③引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC最 好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生 非特异的扩增条带。 ⑤引物3'端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PC R失败。 ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克 隆很有好处。 ⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量:每条引物的浓度0.1~1u mol或10~100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增, 且可增加引物之间形成二聚体的机会。 酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应,一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2。5U(指总反应体积为100ul时),浓度过高 可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。 dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0~7.5,小量分装,-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中,dNTP应为50~200umol/L,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制),如其中任何一种浓度不

PCR反应体系

PCR反应体系 2007-07-20 11:04:33 PCR反应体系与反应条件 标准的PCR反应体系: 10×扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物各200umol/L 引物各10~100pmol 模板DNA 0.1~2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul PCR反应五要素:参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物:引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则: ①引物长度: 15-30bp,常用为20bp左右。 ②引物扩增跨度:以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。 ③引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3’端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。 ⑤引物3’端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处。 ⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。 引物量:每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。 酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应,一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。 dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP 粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0~7.5,小量分装, -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中,dNTP应为50~200umol/L,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。浓度过低又会降

关于PCR总结

PCR总结 若模板为环状质粒,最好先用酶将其切开成线性分子。 酵母、细菌及质粒基因组,每次反应的模板最大加入量分别为10ng,1ng和1pg。 引物的设计原则 1.引物的长度应适宜,一般要求18~25bp,一对引物中两个引物之间的长度差异应小于3bp。 2.基本成分:G+C的含量一般为40%~60%。四种碱基应随机的分布,避免碱基堆积的现象。尤其引物的3’端,不应有连续的3个G或C,否则会使引物与核酸的G或C富集区互补从而影响PCR的特异性。 3.引物自身:引物自身不应有反向重复序列或者大于3bp 的自身互补序列,否则引物自身会折叠形成发夹结构,将影响引物与待增DNA中的靶序列的杂交结合。 4.引物之间:引物之间不应存在互补序列,尤其应避免3’端的互补重叠以免形成引物二聚体。由于PCR反应体系中含有高浓度的引物,即使引物之间存在极为微弱的互补作用也会使引物相互杂交,最终得到引物二聚体的扩增产物。若引物二聚体在PCR反应的早期形成,它们将通过竞争DNA聚合酶、引物及四种单核苷酸从而抑制待增DNA的扩增。通过精心设计引物、应用热启动PCR(hot start PCR)或者降落PCR(touch down PCR)及特制的DNA聚合酶,可以减少引物二聚体的生成。 5.3’末端:引物的3’端(羟基端)是引发延伸的起点,因此一定要与模板准确配对,应尽量避免在引物3’端的第一位碱基是A。引物3’端最佳碱基的选择是G和C,因为他们形成的碱基配对比较稳定。 6.溶解温度:3’端引物和5’端引物应有相似的T m值(不同序列的DNA,Tm值不同。DNA中G-C含量越高,Tm值越高,成正比关系。),其差别不应大于5℃。扩增产物与引物的T m值的差别应小于10℃,以确保PCR循环中的扩增产物有

PCR反应体系有关的过程

PCR反应体系有关的过程 姓名:于烨敏学号:11243220 班级:113 第一部分 1、 PCR原料: DNA模板: 模板包含要用来扩增的靶基因区域,适当提高模板浓度,可减少循环次数,从而减少突变的发生和非特异性产物的形成;但过高的模板浓度会降低反应效率。 上游引物和下游引物: 是人工合成的短的单链DNA片段(寡核苷酸),经常由18-30个碱基组成,用来确定扩增区域的起止位点从而确定扩增的DNA片段大小;物与要扩增的双链DNA的两端精确互补,在退火中可以与DNA模板链特异性地结合。当引物与模板链结合后,DNA聚合酶就开始从引物链的结合位点催化合成新的DNA链。引物的量不能太多,过多的引物导致非特异性扩增的发生和引物二聚体的形成。 聚合酶: 聚合酶从引物结合位点开始沿DNA链移动,阅读DNA编码信息,填充正确的匹配核苷酸,催化DNA新链的合成;来源于生活在热泉中的一种细菌Thermus aquaticus的Taq聚合酶是目前使用最广泛的聚合酶。由于Taq酶没有3'-5'外切酶活性,在复制DNA的过程中可能会随机的引入错误的碱基。对于一般的PCR实验来讲,错误的产生不影响实验的结果;但特定的实验,如扩增的序列是用在测序或蛋白表达等用途时最好使用有较读活性的高保真酶,如Tli或Pfu。由于Taq酶相比其它酶要求的反应条件简单,扩增效率较高,因此可同其它酶混合起来以提高扩增长片段时的保真性。单独使用高保真酶扩增的产物如果与具有黏性末端的载体相连前,通常利用Taq酶在产物的3'末端增加一个多余的A碱基。 四种dNTP(dATP,dCTP,dGTP和dTTP): 是合成DNA新链的原料。dNTP的量与合成产物的大小有关,越长的片段需要越多的dNTP,但过多的dNTP能增加复制的错误率并可能抑制Taq酶活性。 缓冲液: 为维持DNA聚合酶的活性提供必要的pH值和离子浓度。 Mg离子: Mg离子对于维持聚合酶的活性是必须的,它通过稳定引物-模板相互作用而影响退火进程;同时也能稳定聚合酶同引物-模板形成的复制复合物,因此可以增加非特异性退火,进而形成非特异性产物。许多成分如EDTA和dNTP可以结合一部分Mg离子,所以Mg离子准确的用量需要实验来确定。一般来讲,低浓度的Mg离子增加复制的可信度,而高量的Mg离子降低特异性、引入突变。一般反应可通过变化温度、模板质和量而规避提高Mg量的操作。 添加剂: 1. 7-deaza-dGTP, Glycerol (5-10%), formamide (1-5%) or DMSO (2-10%):当模板GC

PCR反应中基本成分(引物、dNTP、模板等)的作用

PCR反应中基本成分(引物、dNTP、模板等)的作用 PCR(聚合酶链式反应)反应包括三个基本步骤,即:模板DNA的变性、模板DNA 与引物的退火复性、引物的延伸。PCR反应体系包括5种基本成分,依次为:引物、DNA聚合酶、dNTP、模板DNA、Mg2+。 PCR(聚合酶链式反应)反应包括三个基本步骤,即:模板DNA的变性、模板DNA 与引物的退火复性、引物的延伸。PCR反应体系包括5种基本成分,依次为:引物、DNA聚合酶、dNTP、模板DNA、Mg2+。 1、引物 引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板 DNA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则: ①引物长度: 15-30bp,常用为20bp左右。 ②引物扩增跨度:以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。 ③引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3’端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。 ⑤引物3’端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处。 ⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量:每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。 2、酶 目前有两种Taq DNA聚合酶供应,一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反

PCR反应体系中各种成分的作用

PCR反应体系中各种成分的作用 不同模板浓度的实验结果 用相同的引物、两种不同的模板,对6种不同模板量进行PCR扩增,发现在模板量<25ng的条件下,扩增产物强度相应减弱,大约到2ng左右时无扩增产物;当模板量在25ng~200ng之间时,扩增产物基本稳定,条带清晰、稳定,分辨率高;当模板量>200ng时,会出现大片段扩增产物的缺失或无扩增产物,且点样孔至泳道会出现相应增强的弥散背景。综合考虑,在25μl的PCR反应体系中,模板DNA以25~100ng为最适用量。同时模板DNA在200ng以下不影响扩增结果,但为降低TE缓冲液中EDTA对反应体系中Mg2+的不良影响程度,应该尽量降低DNA模板用量。 不同Mg2+浓度时实验结果 设置不同Mg2+浓度,当Mg2+浓度为1 0mM时,无PCR扩增产物;Mg2+浓度为1 5~2 5mM时,随着Mg2+浓度的增加,PCR扩增产物带型基本一致,但以2 0mM的扩增效果最好 不同引物浓度对PCR结果的影响 设置5种不同浓度的引物进行PCR扩增,当引物浓度在0 1~0 2μM时,扩增结果基本一致;但随着引物浓度的逐渐增加,开始出现弥散背景增强的趋势,并且有些扩增带发生减弱或缺失。为了保证反应结果的稳定性和特异性,引物浓度以0 .2μM左右为宜。 不同dNTP浓度对PCR结果的影响

采用2种引物(OPB17、OPA16),分别以4种不同的dNTP浓度进行PCR反应,发现dNTP浓度在100μM、150μM、200μM、300μM时,随着浓度的减小,扩增带明显减少或扩增强度减弱,当dNTP浓度<200μM时,扩增产物丰富、清晰、带浓,扩增片段产率与dNTP浓度呈正相关。综合考虑,以100~200μM的dNTP浓度为佳。 TaqDNA聚合酶对扩增结果的影响 设置5个梯度的TaqDNA聚合酶浓度,结果表明随着TaqDNA聚合酶浓度的增高,扩增产物量呈增多趋势。在0 5u~2 5u浓度间均有扩增产物,但随着TaqDNA聚合酶浓度增加的同时,弥散背景也相应增强。综合考虑,TaqDNA聚合酶浓度以1 0~1 5u结果较好 不同退火温度下的扩增效果 引物用OPD16和OPA01,按照优化的PCR反应体系将退火温度分别设置为33℃、36℃、39℃、42℃。结果表明随着退火温度降低,非特异性产物增加,有弥散背景;退火温度升高,特异性相对增加。 Mgcl2与dNTP互相作用及对PCR反应的影响用同一引物OPD07、相同模板DNA比较3种MgCl2浓度与3种dNTP浓度完全随机相结合的9个处理的PCR结果,研究了Mgcl2与dNTP的相互作用。结果表明,Mgcl2在低浓度时,

PCR反应程序

PCR反应程序 1.常规程序 将PCR 反应所需的成分配置完后,在PCR 仪上于94-96℃预加热几十秒至几分钟,使模板DNA 充分变性,然后进入扩增循环。在每一个循环中,先于94℃保持30 秒钟使模板变性,然后将温度降到复性温度(一般50-60℃之间),一般保持 30 秒钟,使引物与模板充分退火;在72℃保持1 分钟(扩增1kb 片段),使引物在模板上延伸,合成DNA ,完成一个循环。重复这样的循环25~35 次,使扩增的DNA 片段大量累积。最后,在72℃保持3-7min ,使产物延伸完整,4℃保存。 2.复性(退火)和延伸温度 复性的温度是PCR 扩增是否顺利的关键因素,通常在50-60℃ 之间。具体的温度主要由引物的Tm 值决定。延伸温度绝大多数设定为72℃。如果复性的温度很高,可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度,变成二步法PCR 。 3.反应时间 变性步骤一般使用30 秒钟,如果模板的G+C 含量较高,或直接用细胞做模板,变性时间可适当延长。复性时间有30 秒种一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定,一般采用1kb 用1 分钟来保证充足的时间。 4.循环次数 循环次数主要与模板的起始数量有关,在模板拷贝数为104~105 数量级时,循环数通常为25~35 次。 平台效应(plateau effect):PCR 扩增过程后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因:底物和引物的浓度已经降低,dNTP 和DNA 聚合酶的稳定性或活性降低,产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用,非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用,扩增产物自身复性,高浓度扩增产物变性不彻底。 5.PCR 反应液的配制 PCR反应体系的配置方式有时也会影响反应的正常进行。常规方法与其它酶学反应一样,在最后加入DNA 聚合酶。早期的PCR 仪没有带加热的盖子,要求在反应液上覆盖一层矿物油,防止水分蒸发。对于使用具3’-5’ 外切活性的高温DNA 聚合酶时,有时会扩增不出产物。在遇到这个问题时,如果将反应成分分开配制,A 管含模板、引物和dNTP ,以及调整体积的H2O ,B 管含缓冲液、DNA 聚合酶和水,然后再将两管溶液混合起来,可较好地克服这个问题。 按照常规的方法配制反应体系,有时会出现非特异性扩增的问题。

PCR反应体系与反应条件

PCR反应体系与反应条件 标准的PCR反应体系: 10×扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物各200umol/L 引物各10~100pmol 模板DNA 0.1~2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至100ul PCR反应五要素:参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物:引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则: ①引物长度: 15-30bp,常用为20bp左右。 ②引物扩增跨度:以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。 ③引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。 ⑤引物3'端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处。 ⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量:每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。 酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应,一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2。5U(指总反应体积为100ul时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。 dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP 粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0~7.5,小量分装, -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中,dNTP应为50~200umol/L,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。浓度过低又会降低PCR 产物的产量。dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。 模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是:溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS 还能与蛋白质 结合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取

酶切体系及PCR体系

酶切反应体系 1.反应体系尽可能的小。 2.酶切缓冲液为整个体系的十分之一,本实验室内切酶为NEB公司,缓冲液的选择,可参照该公司的使用说明。 3.内切酶的用量为反应体系的十至二十分之一(若为双酶切,则两种酶的总量占总反应体系的十至二十分之一),酶用量过大可能反而不利于酶切(因为内切酶中含有甘油)。4.DNA总量不宜大于2-3ug,否则在进行琼脂糖凝胶电泳时,会产生拖尾现象。 5.一般酶切温度为37℃水浴1-2h (小样鉴定1-2h,如要酶切回收,应切5-8h,特别是单酶切的载体,一定要切全,还应加去磷酸酶1-2h)。 6.一般小样鉴定为20ul总体系(酶一般用0.5ul),酶切回收为50-100ul总体系(酶一般用2-3ul,酶切3-4h后,可补加酶1ul)。 7.一般65℃水浴15分钟,灭活内切酶(也可不灭或,因为加入溴酚蓝后酶就失活了)。8.用0.8-1.2%的琼脂糖凝胶电泳。 PCR反应体系 1.反应体系一般为20-25ul 2.摸板:菌液2-5ul,质粒0.5-1ul,病毒DNA3-5ul 3.引物:25umol/l 各0.5ul 4.dNTP : 0.5ul 5.10X Buffer: 如含Mgcl2的为总体系的十分之一(2-2.5ul),如不含Mg cl2,应加入Mgcl2溶液1.5ul 6.Taq酶:0.5ul 7.加入Milli Q水,补齐至20-25ul PCR参数 1.95-96℃3-5 min 2. 95-96℃30-40 Sec 3. (TM-5℃)一般为45-60℃30-40 Sec 4.72℃ 30-180 Sec(一般一分钟为1000个碱基)5.72℃链延伸10 min 6. 10℃保存 以上只用于普通PCR,一般为鉴定用。

PCR体系优化

由于Taq DNA聚合酶是目前PCR反应体系中应用最广泛的酶,因此此文主要讨论使用该 酶的PCR反应体系。 A镁离子浓度 镁离子是热稳定DNA聚合酶的辅因子,其浓度对PCR至关重要。模板DNA的浓度,鳌合物(如EDTA和柠檬酸盐)、dNTP浓度和蛋白都会影响反应体系中游离镁离子的量。如果游离的镁离子含量不够,那么Taq DNA聚合酶则无法行使功能(figurel)。过多的游离镁离子 则会降低酶的保真度,可能会增加非特异性扩增。因此,研究者应当根据实际的实验结果来 优化每一反应中镁离子的浓度。可以用一系列的镁离子浓度梯度来验证,镁离子浓度范围为 1~4mM每次增加或降低 0.5~1 mM扩增产量最高,非特异性产物最低时的镁离子浓度即为最优。最优镁离子的浓度范围跟DNA聚合酶的类型相关,例如, Pfu DNA聚合酶似乎对镁离 子的依赖性更低,但其优化范围通常为2~6mM 许多DNA聚合酶产品提供 Mg-free reaction buffer和单独一管 25mMMgCl2,这样就可以自行调节 Mg+浓度,优化反应体系。MgC2溶液在反复冻融后会出现浓度分层,为获得均 一的溶液,在配液的时候,要确保MgCb溶液完全溶解并充分震荡混匀。非常简单的两步, 溶解和混匀,常常会造成实验失败。 有些科学家倾向于使用包含MgCb的buffer , MgC2的终浓度为1.5mM。值得注意的是有 文献报道发现使用此类buffer的结果并不稳定,有时体系内游离镁离子的浓度会有0.6mM 的变化,如果在90C加热10min,则结果趋于稳定,因此作者假设反复冻融的buffer中MgCb 可能会有沉淀现象发生。 M12345678 2.645 1.605 1.198- 0 0.5 10 1.5 2,0 2.5 3,0 3.5

pcr模板量

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理论上,只要知道任何一段模板dna序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用pcR就可将模板dna在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则: ①引物长度:15-30b,常用为20b左右。 ②引物扩增跨度:以200-500b为宜,特定条件下可扩 增长至10kb的片段。 ③引物碱基:g+c含量以40-60%为宜,g+c太少扩增效 果不佳,g+c过多易出现非特异条带。atgc最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。 ⑤引物3端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致pcR失败。 ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处。 ⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量:每条引物的浓度01~1umol或10~100mol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。

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