濒危植物连香树遗传多样性研究

第35卷第3期2011年5月

南京林业大学学报（自然科学版）

Journal of Nanjing Forestry University （Natural Science Edition ）

Vol．35，No．3May ，2011

http ：//www．nldxb．com ［

doi ：10．3969/j．issn．1000－2006．2011．03．013］收稿日期：2010－05－13修回日期：2010－09－30

基金项目：江苏省农业三项工程项目（SX （2002）073）

作者简介：黄绍辉（1967—），讲师，博士。E-mail ：shaohuihuang@yahoo．com．cn 。引文格式：黄绍辉，方炎明．濒危植物连香树遗传多样性研究［J ］．南京林业大学学报：自然科学版，

2011，35（3）：65－69．濒危植物连香树遗传多样性研究

黄绍辉1，方炎明

2

（1．徐州工程学院环境工程学院，江苏徐州221008；2．南京林业大学森林资源与环境学院，江苏南京210037）

摘要：以我国特有的濒危被子植物连香树为材料，采用RAPD 标记对分布于浙江、安徽、湖南、湖

北、四川、陕西、河南的11个天然居群进行了检测。以20个引物共扩增出691条DNA 片段，其中多态性条带328条，占总条带数的47.5%。AMOVA 分析表明，连香树的基因分化系数为0.4797，居群内变异占总变异的52.03%。由Nei 基因分化系数估计的基因流仅为0.5424，表明居群间基因交流困难。UPGMA 聚类分析表明，安徽歙县居群与河南济源居群的关系最远。遗传漂变等因素可能是连香树目前遗传结构的主要成因。保护现有生境、通过培育实生苗并扩大繁殖栽培的范围是目前对连香树比较好的保护措施。关键词：连香树；遗传多样性；天然居群中图分类号：S722文献标志码：A

文章编号：1000－2006（2011）03－0065－05

Study on the genetic diversity of an endangered plant Cercidiphyllum japonicum

HUANG Shaohui 1，FANG Yanming 2

（1．College of Environment Engineering ，Xuzhou Institute of Technology ，Xuzhou 221008，China ；2．College of Forest Resources and Environment ，Nanjing Forestry University ，Nanjing 210037，China ）Abstract ：Random amplified polymorphic DNA （RAPD ）markers were used to measure the genetic diversity of Cerci-diphyllum japonicum ，an endangered plant in China．The experiment was implemented among 11natural populations from Zhejiang ，Anhui ，Hunan ，Hubei ，Sichuan ，Shannxi and Henan of C．japonicum ．A total of 691DNA fragments were am-plified from 20RAPD primers ，of which 328were polymorphic ，account for 47．5%of all bands．AMOVA was used to de-termine the variation within and among populations．Results indicated that the variation among populations was 0．4797and that within populations was 52．03%．The gene flow was 0．5424based on the Nei gene differentiation index indicated that the gene intercourse was difficult among populations．Results of UPGMA cluster analysis indicated that the genetic dis-tance between the population of Shexian Anhui and Jiyuan Henan was the largest among populations．Genetic drift might have enhanced genetic differentiation within populations．In order to protect the species ，preserving the habitat and breed-ing the seedlings to expand the species were suggested．

Key words ：Cercidiphyllum japonicum ；genetic diversity ；population

物种的遗传多样性是长期进化的产物，也是物种生存和发展的前提，对稀有和濒危物种遗传多样性和群体遗传结构的研究，是揭示其适应潜力的基础，也可为进一步探讨稀有和濒危物种濒危机制及制定相应的保护措施提供科学依据

［1］

。物种的遗

传变异越丰富，对环境变化的适应性也就越大，而其遗传多样性的丧失则意味着该物种的部分灭绝

［2］

。因此，物种保护的目标应是尽可能地保存

物种现有的遗传变异。

连香树（Cercidiphyllum japonicum ）为国家二级濒危保护植物，在系统演化中处于比较原始的地位，

分布于山西南部、河南西南部、陕西南部、甘肃南部、安徽西部、浙江北部、江西北部和东部、湖北西部、四川西部和东南部等局部地区，生于海拔400 2500m 的常绿和落叶阔叶混交林中［3］。现有对连香树的研究报道中，主要是对其系统演化关

南京林业大学学报（自然科学版）第35卷

系［4－15］、生态学特性［16－17］、生物学特性如传粉生物学［18］等方面的研究，而对该物种在DNA水平上的遗传多样性等保护生物学相关研究却少见报道。

随机扩增多态性DNA（RAPD）技术能够灵敏地揭示两个亲缘关系十分相近个体之间的遗传变异，方法简便、成本较低、无需预先知道所研究物种的序列信息，而且还能够检测到丰富的多态性［19－20］，已在中华水韭（Isoetes sinensis）［21］、水杉（Metasequoia glyptostroboides）［22］等的遗传多样性研究中得到了较好的应用。以RAPD研究珍稀濒危物种具有一些潜在优势［23］，笔者采用RAPD分子标记对11个连香树自然居群的遗传多样性进行了研究，旨在阐明其遗传多样性水平和遗传结构，分析其致濒机制，从而为制定科学有效的保护策略和措施提供基础资料和科学依据。

1材料与方法

1．1供试材料及处理

根据连香树的分布范围，选取湖南新宁（110?59'E，26?23'N）、湖北长阳（110?43'E，30?17'N）、湖北巴东（110?25'E，31?20'N）、安徽歙县（124?34'E，40?49'N）、安徽金寨（115?47'E，31?08'N）、河南济源（112?07'E，35?10'N）、四川宝兴（102?35'E，30?25'N）、浙江天目山（119?26'E，30?21'N）、四川峨嵋（103?21'E，29?33'N）、陕西户县（108?30'E，33?50'N）等地的11个天然居群进行遗传多样性分析。每个居群在30个不同单株上采取5 6片无病斑嫩叶，迅速放入装有变色硅胶的密封袋中进行快速干燥。密封袋编号与单株的编号一致，带回实验室后保存于－70?低温冰箱中备用。

1．2DNA提取及RAPD-PCR扩增

采用改进的SDS-CTAB法［24］进行DNA提取。

参考亲缘关系较近的金缕梅科植物枫香（Liquid-ambar formosana）的RAPD反应体系［25］，对连香树RAPD反应体系中dNTPs的浓度、Taq酶用量、模板DNA浓度、引物浓度、Mg2+浓度、10?Buffer缓冲液用量及退火温度、退火时间、循环次数等因素进行分析，建立重复性强、稳定性好的连香树RAPD反应体系［26］，经实验获得的最后20μL连香树RAPD扩增体系为：25mmol/L的Mg2+2μL，10mmol/L的dNTPs 0.4μL，1μmol/min的Taq DNA酶0.4μL，BSA 0.6μL，10?Buffer缓冲液2.5μL，OD=0.5的引物0.8μL，约25ng模板。扩增程序为：94?预变性3min，1个循环；94?变性30s，37?退火15s，72?延伸90s，40个循环；72?最后延伸7min；4?保存。1．3RAPD数据分析方法

用POPGENE32软件计算RAPD扩增产物的观测等位基因数（A）、有效等位基因数（N

e

）和基因

多样性指数（h）、总体基因多样度（H

t

），以及各居

群基因多样度（H

s

）、基因分化系数（G

st

）和基因流

（N

m

）。用TFPGA软件包中AMOVA软件对遗传变异的三级谱系进行剖分。用TFPGA软件包中的tfpga程序计算出Nei无偏遗传距离，并用UPGMA 法进行聚类分析。

2结果与分析

2．1连香树居群的扩增多态性

对20个RAPD引物在11个连香树居群的扩增情况进行了统计。结果表明，20个引物共扩增出691条DNA片段，这表示对连香树基因组691个位点进行了检测。平均每个引物扩增出34.6条，其DNA片段大小分布在100 3000bp之间。其中，多态性条带328条，占总条带数的47.5%，平均每个引物扩增出多态性条带16.4条（表1），表明连香树天然群体遗传变异比较丰富。从扩增条带在各引物中的分布看，引物A17扩增出的条带最多，有39条，扩增出条带最少的是引物C20，有29条。而多态性条带数量以引物A02最多，为20条，引物B02最少，为10条。因此，不同引物在衡量和评价群体遗传多样性中有不同作用（图1）。表120个RAPD引物在连香树群体中扩增的DNA片段Table1Amplified DNA fragments with20primers

among populations of C．japonicum

P S T/条N/条B/%

A02TGCCGAGCTG372054．1

A03AGTCAGCCAC311445．2

A04AATCGGGCTG341750．0

A07GAAACGGGTG351851．4

A11CAATCGCCGT371951．4

A14TCTGTGCTGG351645．7

A16AGCCAGCGAA351645．7

A17GACCGCTTGT391641．0

B02TGATCCCTGG331030．3

B05TGCGCCCTTC331751．5

B15GGAGGGTGTT351542．9

C04CCGCATCTAC361850．0

C05GATGACCGCC321856．3

C08TGGACCGGTG331751．5

C11AAAGCTGCGG351542．9

C19GTTGCCAGCC331648．5

C20ACTTCGCCAC291551．7

E02GGTGCGGGAA381950．0

E14TGCGGCTGAG351440．0

F01ACGGATCCTG361850．0

合计2069132847．5

注：P．引物；S．序列5'－3'；T．扩增总带数；N．多态性条带数；B．多态位总百分率。

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第3期黄绍辉，等：

濒危植物连香树遗传多样性研究

图1引物F01对巴东居群1 15号个体和引物B02对峨嵋居群1 15号个体的扩增结果

Fig．1

Amplification results obtained from the samples of Badong （A ）and Emei （B ）populations of C．japonicum with primer F01and B02

2．2

连香树居群的基因多样性

各居群RAPD 扩增结果表明，由Nei 基因分化

系数估计的基因流为0.5424（表2），表明居群间

的基因流动水平较低。

由表2可知，连香树物种基因多样性仅为0.2463，基因分化系数也不高，为0.4797，表明总

变异中只有47.97%的变异存在于居群间，

而52.03%的遗传变异存在于居群内。居群内基因多样性也偏小，为0.1282，居群间基因多样性也仅为0.1181。表明居群基因分化程度偏低，居群内和居群间遗传多样性均不丰富。

表2

Nei 指数估测的连香树基因多样性的构成和遗传分化

Table 2

Constitution and differentiation of gene diversity estimated by Nei's index of C．japonicum

2．3连香树居群的遗传距离与遗传一致度

基因分化系数只能对一个居群的分化程度作出评价，却不能判定居群间相互关系的远近，而遗传一致度（或称为遗传相似系数）和遗传距离的度

量则可以说明每两个居群间彼此关系的密切程度。为了确定连香树11个居群间的遗传关系，计算了各居群间的遗传一致度和遗传距离，结果见表3。

表3

连香树居群间的遗传一致度和遗传距离

Table 3

Nei's evolution of genetic identity and genetic distance among populations of C．japonicum

居群pop 12

3

4

5

6

7

8

9

10

11

1—0．9560．9490．9170．9500．9280．8920．8920．8580．8160．739

20．045—0．9610．9380．9520．9250．9110．9030．8790．8310．76130．0530．040—0．9340．9410．9170．9140．9010．8640．8240．74640．0870．0640．069—0．9320．8990．8840．8900．8510．8030．73150．0520．0490．0610．071—0．9150．9020．9010．8710．8320．74860．0750．0780．0870．1060．089—0．8730．8760．8900．8070．71970．1150．0930．0900．1230．1040．136—0．9220．8960．8610．78680．1150．1020．1040．1170．1040．1330．081—0．8790．8410．74890．1540．1300．1470．1610．1380．1630．1100．129—0．8660．810100．2030．1850．1930．2200．1840．2150．1500．1730．144—0．78611

0．302

0．2730．2930．3130．2910．3300．2410．2900．2110．241—

注：右上为遗传相似度，左下为遗传距离。居群中，

1．湖北巴东；2．四川赶羊沟；3．四川鹿井沟；4．湖南新宁；5．湖北长阳；6．河南济源；7．四川峨嵋；8．安徽金寨；9．浙江天目山；10．陕西户县；11．安徽歙县。

7

6

南京林业大学学报（自然科学版）第35卷

表3表明，连香树各居群间遗传相似系数以四川宝兴赶羊沟居群与四川宝兴鹿井沟居群间的最高，为0．961，以安徽歙县居群与河南济源居群间的最低，为0.719。各居群间的遗传距离则在0．04和0．33之间变动，即安徽歙县居群和河南济源居群间的遗传距离最大，四川宝兴赶羊沟居群和四川宝兴鹿井沟居群间的遗传距离最小。2．4

连香树居群的UPGMA 聚类分析

为直观地表示连香树11个天然居群间的相互

关系，利用UPGMA 聚类分析方法所得出的结果，

绘制了各居群间的系统聚类图（图2）

。

图2连香树11个天然居群UPGMA 聚类树状图Fig．2

Dendrogram among eleven populations of C．japonicum by using UPGMA cluster analysis

根据图2中各居群的聚类结果，四川宝兴赶羊沟居群与四川宝兴鹿井沟居群间的关系最近

（0.04），安徽金寨居群与四川峨嵋居群的关系也较近（0.08），湖北巴东居群和陕西户县居群的距离较远（0.20），而安徽歙县居群与河南济源居群的关系最远（0.33）。

3讨论

对珍稀濒危物种居群遗传多样性和居群遗传结构的研究，是了解其生物学特性、探讨濒危原因的基础，同时也为制定科学保护和利用措施提供重要理论依据

［27］

。物种遗传多样性的保持受其生物

学特性、生态条件、进化过程及历史事件等诸多因素的共同影响，不同类型的珍稀濒危物种可能具有不同的遗传意义

［28］

，因此不同物种具有不同程度

的遗传多样性水平。对连香树的RAPD 扩增结果

表明，

连香树物种水平的多态位点百分率为47.50%，在低于中华水韭（58.06%）［21］

，高于水杉（38.60%）

［22］

等濒危植物水平。AMOVA 分析表明，连香树的基因分化系数G st 为0.4797，低于

濒危植物矮牡丹（0.5200）［29］

、山红树（0.7865）［30］、三棱栎（0.5320）［31］

等，但高于双

子叶植物基因分化系数的平均值（G st =0.2730），

也高于濒危植物冷杉（0.4550）

［32］

、望天树（0.4448）［33］、金钱槭（0.4470）和云南金钱槭（0.4267）［28］等的值。连香树的基因分化系数G st

表明很大部分遗传变异存在于居群间，导致这种结果的原因可能是生境破碎化导致的遗传漂变。由于第四纪冰川的影响导致连香树现今的残遗和间断分布，雌雄异株的生物学特性加上随后小居群的相互隔离和随之而来的遗传漂变，导致其遗传变

异大幅度下降，

居群间遗传分化加大。居群间缺乏有效的基因流也是产生连香树特殊居群遗传结构

的重要原因。

UPGMA 聚类分析表明，安徽歙县居群与河南济源居群的关系最远。不同居群之间明显的地理隔离，部分阻止了居群间的基因交流。在所研究的居群中，由Nei 基因分化系数估计的基因流仅为0.5424，表明居群间基因交流困难。因此，各居群在各自的生境岛屿中进行既有共性又各具特点的成种作用，使得居群内变异占了总变异的大部分，

达52.03%。遗传变异大部分存在于居群内的个体间，所以在迁地保护时应在各居群内大量采样。连香树具有低水平遗传多样性的原因，首先是小居群中的遗传漂变；其次，可能第四纪冰期时形成的连香树“避难所”

数目较少，初始居群间的遗传差异较小，

导致现有居群的遗传多样性较低。因此，对连香树而言，保护现有生境、通过培育实生苗并扩大繁殖栽培的范围可能是目前比较好的保护

措施。

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（责任编辑郑琰琰）

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