普鲁兰酶性质的研究
一如何获得目的菌株
( 1) 普鲁兰酶产生菌的初筛。取10g 土样加入到装有90mL 无菌水和玻璃珠的三角瓶中, 振荡30min, 使样品充分打散后, 吸取1.0mL 于富集培养基中, 在35℃下振荡培养48h。取培养液稀释涂布于以普鲁兰糖为唯一碳源的平板分离培养基上, 35℃温箱中培养48h。将平板倒置, 注入10mL无水乙醇, 室温放置24h, 观察菌落并挑出周围出现透明圈的菌落, 于斜面培养基上进行培养。
( 2) 菌种纯化。用接种环从斜面培养基上挑取少量菌株接入平板固体培养基, 采用平板划线分离法对菌株进行纯化, 将产生透明圈的单菌落接入斜面培养基, 供菌种复筛用。
( 3) 摇瓶培养法复筛。将斜面保存的菌种接入种子培养基中, 35℃振荡培养24h 后, 制得菌悬液, 将菌悬液以4%接种量接入菌种筛选摇瓶培养基, 35℃振荡培养48h 后, 测定发酵液中普鲁兰酶活力。
二目的产物的检测方法三目的菌产酶条件的优化
四纯酶的获得以及酶学性质研究方案酶的初步纯化
酶的部分纯化
普鲁兰酶的部分酶学性质。
( 1) 最适温度及热稳定性。
将普鲁兰酶液分别于不同温度下测其活力, 以活力最高者为100%对照, 测试其最适反应温度。在不同温度下, 将普鲁兰酶液分别保温1h 后, 测定残余酶活力, 以活力最高者为100%对照, 试验温度对普鲁兰酶稳定性的影响。
( 2) 最适pH 值及pH 值稳定性。
将普鲁兰酶液分别于不同pH 值下测其活力, 以活力最高者为100%对照, 测试其最适反应pH 值。将普鲁兰酶液在不同pH 值缓冲液中于室温保持24h 后, 测定残余酶活力, 以活力最高者为100%对照, 试验pH 值对普鲁兰酶稳定性的影响。
( 3) 金属离子对普鲁兰酶活性的影响。将不同的无机盐溶液与等量普鲁兰酶液混合, 并使混合液中的无机盐最终浓度达到0.5mmoL/ L, 按1.2.3 的方法测定酶活力, 设不加金属离子组为对照组, 测定金属离子对普鲁兰酶活力的影响。
五对该酶的改性方案（基因工程手段，酶分子修饰，固定化）
基因工程手段
六酶的产业化（酶反应器，产业化生产中需要注意的问题）
菊芋基因组方面的研究进展
菊芋基因组方面的研究进展 摘要：当今社会经济飞速发展，人们的生活越来越好，但同时也引起了地球上各种严重的能源问题，因此人类急需探索出新的能源来维持经济的发展及人类自身的生存。因此越来越多的能源植物被提上研究的日程，而菊芋就是其中的一种比较有发展前景的能源植物。本文主要介绍了近些年来能源植物菊芋的基本概述、特点、用途及研究价值、进展，包括凝集素基因、金属硫蛋白htMT2基因、Na+／H+逆向转运蛋白基因等，并对菊芋今后的发展进行了展望。 关键词：菊芋能源凝集素 Na+／H+逆向转运蛋白金属硫蛋白htMT2 展望 Jerusalem artichoke genome research progress Abstract：Rapid economic development in today's society，people's lives were better，but it also caused the earth with serious energy problems，so human being need to explore a new energy to sustain economic development and the survival of human beings。Thus more and more energy plants is put on the agenda，and Jerusalem artichoke is one of a more promising energy plants。This paper introduces the energy plants in recent years，a basic overview of Jerusale m artichoke’s characteristics， uses and research value，progress，including the lectin gene， metallothionein htMT2 gene，Na+／H+ antiporter genes，and the future development of the Jerusalem artichoke Prospect。 Key words：Jerusalem artichoke Energy Lectin Na+／H+ antiporter Metallothionein htMT2 Prospect。 随着世界经济持续快速的发展，各国对能源的需求日益剧增，而化石燃料资源毕竟有限，因此能源危机成为人类逐渐面临的巨大危机。据统计，以目前世界已探明的矿物能源，煤炭资源尚可开采100年，天然气50～60年，地球上石油的存量已不足2 000亿吨，在100多年后将被消耗完。科学家们预测，能源消费将在未来20年内还将以平均2%的速度增长[1]。同时因煤炭、石油、天然气等石化能源燃料燃烧时所产生的有害物质导致一系列诸多的生态问题，严重影响着国家的资源安全，社会经济持续发展和威胁着人类的生存。在巨大的能源危机和环境污染的压力下，世界各国开始将目光聚焦到洁净的可再生能源的开发上[2]。这时全世界的目光开始落在菊芋的身上：能源植物是可再生能源开发的重要资源对象，是最有前景的生物质能源之一[3]。因此，研究开发能源植物具有相当重要的意义。 1、菊芋的概述：
酶学性质研究
1.6 酶学性质研究 （1）pH 的影响：分别测定粗酶液在pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0下的酶活力，确定其最适反应pH 值；将粗酶液用上述pH 缓冲液稀释后，45℃水浴保温4小时后，测定其剩余酶活力。 （2）温度的影响：分别在40~95℃下测定酶活力，确定其最适反应温度；将酶液在40～90℃范围内的不同温度下保温60 min 后，测定其剩余酶活力。 （3）金属离子的影响：在酶液中分别添加各种金属离子，使其浓度为4 mmol ／L ，然后测定酶活力。 2.5 纤维素酶粗酶液酶学性质 2.5.1酶反应的最适pH 值和酶的pH 稳定性 粗酶液在不同pH 值下测得的酶活及在不同pH 值下处理4小时后测得的相对酶活示于图11。结果表明，CMCase 在pH 3.5～4.5有较高的酶活力，最适反应pH 值为4.0；β-Gluase 在pH 4.5～5.5酶活力较高，最适反应pH 值为5.0，同样方法测得FPA 最适反应pH 为5.0。可见，该菌株所产的各组分纤维素酶是酸性酶。 图11表明，该菌产CMCase 在pH3.0～6.0的范围内，β-Gluase 在pH3.5～5.5的范围内，酶活力均可保持在80％以上，说明该菌株所产酸性纤维素酶可在较宽的pH 值范围内保持其酶活力的稳定性。2.5.2 酶反应的最适温度和酶的热稳定性 在不同温度下直接进行酶促反应测得的酶活及在不同温度下热处理60 min 后于最适反应温度和最适pH 下测得的相对酶活(以4℃保存的酶液活力为100%)示于图12。结果表明，CMCase 、β-Gluase 及FPA 最适反应温度均为65℃。 c e l l u l a s e a c t i v i t y ( U .m l -1) pH r e l a t i v e y a c t i v i t y （%） c e l l u l a s e a c t i v i t y ( U .m l -1) temperature ( o C ) r e l a t i v e y a c t i v i t y （%） 图11 pH 值对酶活力及酶稳定性的影响 Fig.10 Effects of pH value on Cellulase activity and stability 图12 温度对酶活力及酶稳定性的影响 Fig.11 Effects of temperature on activity and stability of cellulase
植酸酶在饲料中的应用及其研究进展(精)
植酸酶在饲料中的应用及其研究进展 植酸酶是一种新型的、可作为动物饲料添加剂的重要酶制剂。它对提高饲料中磷利用率，提高动物的生产性能，以及减轻高磷粪便对环境水域的磷污染有重要意义。本文综述了植酸酶在饲料中的应用现状及工业化生产方法，讨论了其进一步的研究发展方向。 植酸酶是一种水解酶，它能将植酸磷（六磷酸肌醇）降解为肌醇和无机磷酸。此酶分两类：3-植酸酶和6-植酸酶。植酸酶广泛存在于植物和微生物中。磷在植物中的主要存在形式为植酸磷，由于植酸磷不能被单胃动物直接利用，从而造成磷源浪费和形成高磷粪便污染环境。另外，植酸磷还是一种抗营养因子，它在动物胃肠道的消化吸收过程中会与多种金属离子如Zn2+、Ca2+、Cu2+、Fe2+等以及蛋白质螯合成不溶性复合物，降低了动物对这些营养物质的利用。因此，开展饲用植酸酶的研究，对提高畜禽业生产效益及降低磷对环境的污染有重要意义。１植酸酶的来源及酶学性质 早在1907年Suzuki等就在谷粮中发现了具有植酸酶活性的磷酸酶。第一个纯化的植酸来源于麸皮，研究发现它虽具有植酸酶活性，但植酸并不是它特异性底物。来源于植物的植酸酶均属于６－植酸酶，最适pH范围在5.0~7.5，在单胃动物酸性的胃环境中不起作用。60年代末植酸酶的研究转向最适pH为酸性、酶含量较高的微生物来源的植酸酶。 许多微生物都能产生植酸酶，尤其在曲霉属中。1968年Shien等从68个土样中对2000个菌株进行考察发现，在所用的22株黑霉菌中有21株能产生植酸酶。第一个被分离纯化的植酸酶来源于Aspergillus terreus NO.9A-1,它的最适pH为 ４.5，最适反应温度为70℃,此酶在pH1.2~9.0均能稳定维持活性。从此以后，陆续从十几种微生物中分离得到植酸酶，其中来源于Ａ.ficcum NR-RL3135(A.niger var.awamori)的植酸酶phyA具有较好的耐热性，在酸性的条件下有较高酶活性，被认为是目前最具应用前景的饲用植酸梅，其酶学性质的研究也较为深入。 植酸酶phyA属于３－植酸酶，是一种糖基化蛋白，表观分子量为85KD。它的最适pH为2.5和5.5,最适反应温度为55℃。在37℃、pH2.5的条件下，以植酸为底物的Ｋm值为50mmol,Ca2+、Fe2+对酶活性无影响,Mn2+、Co2+有激活作用，能使酶活性分别提高30%和13%。Cu2+、Zn2+、Fe2+、Cu+对酶活性有抑制作用，其中前两种为非竞争性抑制，后两种为竞争性抑制。对酸性磷酸酶有抑制作用的抑制剂如Ｌ（＋）－酒石酸对它却没有抑制作用。它是目前发现的比活性最高的植酸酶之一，它降解植酸磷形成的终产物是单磷酸肌醇和无机正磷酸。 ２植酸酶在饲料中的应用效果
菊粉低聚糖的水解工艺研究
文章编号：1673-2995（2011）05-0289-02·论著·菊粉低聚糖的水解工艺研究 陈昱，王丽娜，李妍，李晓光*（吉林医药学院药学院，吉林吉林132013） 摘要：目的研究确立菊粉低聚糖的最佳水解工艺条件。方法采用酸法、酶法两种方式，分别设计单因素实验对菊糖提取液进行水解。结果酸法水解最佳工艺条件为水解温度80?、水解时间30min、pH=2．0；酶法最佳工艺条件为水解温度65?、水解时间18h、底物浓缩比1?1、酶用量0．4g。结论酸法水解优于酶法，转化率高且操作条件简单易行。 关键词：菊粉低聚糖；酸水解；酶水解；优化 中图分类号：TS24文献标识码：A Study on the hydrolysis process of oligosaccharides from Inulin CHEN Yu，Wang Li-na，Li Yan，LI Xiao-guang*（College of Pharmacy，Jilin Medical College，Jilin City，Jilin Prov-ince，132013，China） Abstract：Objective To find the optimum condition of the hydrolysis process of oligosaccharides from Inulin．Methods Inulin is hydrolyzed via acid and enzymatic means respectively．Single factor experiments were set to get the best method．Results As for acid hydrolysis，the best method is undertaken under the condition of80?（pH= 2．0）for30min．With regard to the enzymatic hydrolysis approach，the best one is as follows：substrate concentration ratio is1?1，reacting at60?with0．4g enzyme for18h．Conclusion The acid hydrolysis，with higher convert rate and simpler working condition，is better than the enzymatic one． Key words：Inulin oligosaccharides；acid hydrolysis；enzymatic hydrolysis；optimization 菊粉低聚糖，又称寡糖，是由2 10个单糖分子通过糖苷键构成的聚合物［1］。它具有良好的食品加工特性及优良的生理功能，尤其是降脂净血、调节肠道菌群平衡、增强人体免疫力方面功效显著［2-4］。 本课题主要对菊芋多糖酸法、酶法两种水解制备低聚糖的工艺进行了比较，并确定了适合产业化生产的较佳工艺操作条件。 1材料与方法 1．1主要原料与仪器 采收后低温干燥并于阴凉处放置1年的菊芋（购自吉林市）；菊粉酶（购自韩国）；ZTC1+1天然澄清剂（天津正天成澄清技术有限公司）；磷酸（北京红星化工厂）。 基金项目：吉林省教育厅“十一五”科技研究计划（2010252）． 作者简介：陈昱（1990－），女（汉族），本科． 通讯作者：李晓光（1962－），女（汉族），教授，本科． DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司），RE-3000型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），DF-I集热式磁力加热搅拌器（江苏金坛市环宇科学仪器厂）。 1．2 实验流程 2结果 2．1酸法水解工艺 酸法水解工艺向ZTC1+1天然澄清法纯化所得的菊芋多糖纯化液中加入磷酸［5］至一定pH值，于恒 — 982 — 第32卷第5期2011年10月吉林医药学院学报 Journal of Jilin Medical College Vol．32No．5 Oct．2011
酶的化学修饰基本原理及修饰酶的基本性质
酶的化学修饰基本原理及修饰酶的性质特点 【摘要】酶是高效生物催化剂，在工业、医学、科研等领域有着非常广泛的应用，尤其在工业生产中创造出巨大的经济效益。但由于酶是蛋白质，稳定性差且在生物体内具有较大的免疫原性，因而严重制约了其应用。对酶分子进行化学修饰是提高其稳定性的方法并且能够降低在生物体内的免疫原性，能够扩大其应用范围，极大地改善酶本质的不足。简要介绍酶的化学修饰基本原理及修饰酶的性质特点。 1 酶的化学修饰的基本原理 酶分子的化学修饰就是在分子水平上对酶进行改造，包括对酶分子主链结构的改变和对其侧链基团的改变。前者是分子生物学层次上的修饰，即在己知酶的结构与功能盖系的基础上，有目的地改变酶的某个活性基团或氨基酸残基，从而使酶产生新的性状，又称理性分子设计，理性分子设计主要应用于改造酶的底物特异性．催化特性以及热稳定性,Shaffer等通过将天冬氨酸转氨酶的Val39、 Lys41、Thr47、Ash69、Thrl09和Ash297突变为酪氨酸转氨酶所对应的Lcu、Tyr、Ile、Leu、Set和Ser，修饰酶对Phe的活性增加3个数量级，而对Asp的活件没有影响，然而，由于酶的结构、功能和作用机制没自完全了解，而且仅仅把氨基酸序列的同源性作为氨基酸取代的标准，加上氨基酸取代后有可能导致没构想的改变，所以，并非所有理性分子设计都能取得预期效果，这就严重制约了理性分子设计的应用。 1. 1功能基团的修饰 酶分子可离解的基团如氨基(NH2)、羧基(～COOH)、羟基（OH)、巯基(sH)、咪锉基等都可用来修饰。脱氨基作用可改善酶的稳定性，消除酶分子表面的氨基酸的电荷，酰化反应，可改变侧链羟基性质。这些修饰反应，可稳定酶分子有利的催化活性现象，提高抗变性的能力。 1.2用表面活性剂对酶进行化学修饰 除糖基修饰外，也有人用表面活性剂对酶进行化学修饰。表面活性剂的亲水部分与酶连在一起，而亲油部分伸向有机溶剂，从而提高了酶在有机溶剂中的溶
酶的本质和特性
酶 一、酶的本质：酶是由活细胞产生的具有催化活性和高度选择性的特殊蛋白质。按其组成的不同，将酶分成单纯蛋白质和结合蛋白质两大类。例如，大多数水解酶属单纯由蛋白质组成的酶; 黄素单核苷酸酶则属由酶蛋白和辅助因子组成的结合蛋白酶。结合蛋白质中的酶蛋白为蛋白质部分，辅助因子为非蛋白质部分，两者结合成全酶，只有全酶才有催化活性 二、酶的形态结构 所有的酶都含有C、H、O、N四种元素。按照酶的化学组成可将酶分为单纯酶和复合酶两类。 单纯酶分子中只有氨基酸残基组成的肽链。 结合酶分子中则除了多肽链组成的蛋白质，还有非蛋白成分，如金属离子、铁卟啉或含B 族维生素的小分子有机物。结合酶的蛋白质部分称为酶蛋白，非蛋白质部分统称为辅助因子（cofactor），两者一起组成全酶；只有全酶才有催化活性，如果两者分开则酶活力消失。非蛋白质部分如铁卟啉或含B族维生素的化合物若与酶蛋白以共价键相连的称为辅基（prosthetic group），用透析或超滤等方法不能使它们与酶蛋白分开；反之两者以非共价键相连的称为辅酶（coenzyme），可用上述方法把两者分开。辅助因子有两大类，一类是金属离子，且常为辅基，起传递电子的作用；另一类是小分子有机化合物，主要起传递氢原子、电子或某些化学基团的作用。 结合酶中的金属离子有多方面功能，它们可能是酶活性中心的组成成分；有的可能在稳定酶分子的构象上起作用；有的可能作为桥梁使酶与底物相连接。辅酶与辅基在催化反应中作为氢（H+和e）或某些化学基团的载体，起传递氢或化学基团的作用。体内酶的种类很多，但酶的辅助因子种类并不多，常见到几种酶均用某种相同的金属离子作为辅助因子的例子，同样的情况亦见于辅酶与辅基，如3-磷酸甘油醛脱氢酶和乳酸脱氢酶均以NAD+作为辅酶。酶催化反应的特异性决定于酶蛋白部分，而辅酶与辅基的作用是参与具体的反应过程中氢（H+和e）及一些特殊化学基团的运载。 酶属生物大分子，分子质量至少在1万以上，大的可达百万。酶的催化作用有赖于酶分子的一级结构及空间结构的完整。若酶分子变性或亚基解聚均可导致酶活性丧失。一个值得注意的问题是酶所催化的反应物即底物（substrate），却大多为小分物质它们的分子质量比酶要小几个数量级。 酶的活性中心（active center）只是酶分子中的很小部分，酶蛋白的大部分氨基酸残基并不与底物接触。组成酶活性中心的氨基酸残基的侧链存在不同的功能基团，如-NH2。-COOH、-SH、-OH和咪唑基等，它们来自酶分子多肽链的不同部位。有的基团在与底物结合时起结合基团（binding group）的作用，有的在催化反应中起催化基团（catalytic group）的作用。但有的基团既在结合中起作用，又在催化中起作用，所以常将活性部位的功能基团统称为必需基团（essential group）。它们通过多肽链的盘曲折叠，组成一个在酶分子表面、具有三维空间结构的孔穴或裂隙，以容纳进入的底物与之结合并催化底物转变为产物，这个区域即称为酶的活性中心。 而酶活性中心以外的功能集团则在形成并维持酶的空间构象上也是必需的，故称为活性中心以外的必需基团。对需要辅助因子的酶来说，辅助因子也是活性中心的组成部分。酶催化反应的特异性实际上决定于酶活性中心的结合基团、催化基团及其空间结构。
实验五 酶的基本性质
实验一酶的性质研究 酶是生物体内具有催化功能的蛋白质，因此也叫生物催化剂。生物体内存在多种多样的酶，从而使生物体在温和的条件下能够迅速完成复杂的生物化学反应。 酶有的是单纯蛋白质，有的是结合蛋白质。因此，凡是能够引起蛋白质变性的因素，都可以使酶丧失活性，结合蛋白质的非蛋白部分叫做辅酶或辅基。习惯上，将与蛋白质结合的紧而不易分离的非蛋白部分称为辅基，辅基不能通过透析的方法从酶分子中除去；而将与蛋白质结合的不紧而易分离的非蛋白质部分称为辅酶，辅酶可以通过透析的方法从酶分子中除去。目前许多酶已经能够制成结晶。 酶具有高度的专一性（特异性）。温度和pH对酶的活性有显著的影响。能使酶的活性增加的作用称为酶的激活作用，使酶的活性增加的一些物质称为酶激活剂；能使酶的活性减弱的作用称为酶的抑制作用，使酶的活性减弱的一些物质称为酶的抑制剂。激活剂与抑制剂常表现某种程度的特异性。， 物质代谢是生命现象的基本特征。在机体中了解温度对没活性的影不断进行着的同化作用和异化作用，绝大多数都是在酶的影响下进行的。所以，生活机能在某种程度内可以说是由机体内酶类的含量及活性决定的。食品、发酵、制药、制革、造纸、纺织等工业部门以及临床检验等都和酶有密切关系。因此，酶的研究在生物化学理论上及生产实践上都占有极其重要的位置。 温度对酶活性的影响 一目的和要求 通过检验不同温度下唾液淀粉酶的活性，了解温度对酶活性的影响。进一步明确最适温度的概念。 二原理 酶的催化作用受温度的影响很大，一方面与一般化学反应一样，提高温度可以增加酶促反应的速度。通常温度每升高10℃，反应速度就加快一倍左右，通常用温度系数表示，一般情况下的温度系数约等于2，最后反应速度达到最大值。另一方面，酶是一种蛋白质，温度过高可引起蛋白质变性，导致酶的失活。因此，反应速度达到最大值以后，随着温度的升高，反应速度反而逐渐下降，以至完全停止反应。反应速度达到最大值时的温度称为某种酶的最适温度。高于或低于最适温度时，反映速度逐渐降低。大多数动物酶的最适温度为37℃-40℃，植物酶的最适温度为50℃-60℃。但是，一种酶的最适温度不是完全固定的，它与作用时间的长短有关，反应时间增长时，最适温度向数值较低的方向移动。通常测定酶的活性时，，在酶反应的最适温度下进行，测定酶促反应的初速度。为了维持反应过程中温度的恒定，一般利用恒温水浴等恒温装置。 酶对温度的稳定性与其存在的形式有关。大多数酶在干燥的固体状态下比较稳定能在室温下保持数月以至一年，在低温下保存的时间更长，因此，酶制剂一般以冻干粉状在低温下冷冻保存。溶液中的酶，一般不如固体的酶稳定，且易为微生物所污染，通常很难长期保存而不丧失其活性，溶液状态的酶，在保存时都要加入等体积的甘油，并贮存在4℃冰箱中，酶活性可保持两周至几个月。酶在高温下就更不稳定了。 酶的活性通常是用测定酶作用基质在酶作用前后的变化来进行观察的。
植酸酶活性测定方法的研究进展
中国饲料2010年第20期 植酸酶广泛存在于动物、植物和微生物中，能将植酸分解为肌醇和无机磷的一类磷酸单脂水解酶。文章介绍了植酸酶活性的测定方法，除了以前的传统方法外，近10多年植酸酶活性检测出现了许多新的方法，如近红外光谱法、琼脂平板法、酶联免疫吸附法、生物传感器法、高效液相色谱法等，这些新方法为植酸酶活性测定开辟了新的检测途径。 1植酸酶活性测定方法的发展及意义 1.1植酸酶活性测定方法的发展植酸酶发现至今已经有100余年，植酸酶的研究已经取得了丰硕的成果。回顾植酸酶活性的测定方法：1925年Fiske-SubbaRow法，即钼黄法，因由Fiske和SubbaRow两人发现，所以早期钼黄法也叫Fiske-SubbaRow法；1943年Holman等发现了硫酸亚铁-钼蓝法，曾在国外许多国家发展为植酸酶测定的标准方法，至今还在许多研究中采用（Fu等，2008；Huang等，2008）；1981年Heinonen和Lahti 建立了丙酮-磷钼酸铵法。植酸酶活性的测定方法除了这些传统的方法外，近10多年来随着科学技术和检测手段的提高，植酸酶活性分析检测及标准化方面出现了许多新的方法，并颁布了新的标准，如近红外光谱法（NIR）、琼脂平板法、酶联免疫吸附法（ELISA）、生物传感器法、反相高效液相色谱法（RP-HPLC）等。 1.2植酸酶活性测定意义植酸酶没有特定光吸收波和鉴定试剂，所以植酸酶的分析和活性测定比较困难（Lasztity等，1990）。动、植物植酸酶的提取、分离纯化，微生物植酸酶菌株的筛选，基因工程植酸酶表达产物等研究中都需要测定植酸酶活性。随着植酸酶在饲料中的广泛应用，饲料管理部门、饲料质检机构、科研部门以及生产企业均面临植酸酶定量测定的工作。目前存在着植酸酶酶活单位混乱、检测手段落后，测定结果误差大等一些问题，所以规范植酸酶酶活性定义和检测方法势在必行。 植酸酶活性的定义方法主要有以下几种：（1）酶活定义为每分钟从一定浓度的植酸钠溶液中释放1μmol的无机磷为一个酶活单位。（2）酶活定义为每分钟从一定浓度的植酸钠溶液中释放1 nmol的无机磷为一个酶活单位。（3）酶活定义为每秒钟从一定浓度的植酸钠溶液中释放1nmol 的无机磷为一个酶活单位。（4）酶活定义为每小时从一定浓度的植酸钠溶液中释放1mg的无机磷为一个酶活单位。这四种定义中第一种的酶活单位最大，国外采用此种单位较多，我们称之为国际单位；第二种酶活单位是第一种的1000倍；第三种为第一种酶活单位的17倍；第四种与第一种酶活单位大小相近。 目前，植酸酶活性单位大多用FTU（fytase u-nit）表示。植酸酶样品在植酸钠浓度为5.0mmol/L、温度37℃、pH值5.50的条件下，每分钟从植酸钠中释放1μmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。1994年该标准被AOAC（美国公定 植酸酶活性测定方法的研究进展 陕西理工学院陈琛 [摘要]本文综述了植酸酶的分析测定方法，包括传统的分光光度法及近年来新发展起来的近红外光谱法、琼脂平板法、酶联免疫吸附法、生物传感器法、反相高效液相色谱法等。 [关键词]植酸酶；测定方法；活性 [中图分类号]S816.17[文献标识码]A[文章编号]1004-3314（2010）20-0016-03 [Abstract]This article gave a review on determination methods of phytase activity.These methods include traditional spectrophotometry，near infrared spectroscopy，enzyme-linked immunosorbent assay，agar plate assay，biosensor method re-versed-phase high performance liquid chromatography. [Key words]phytase；method for determining enzyme activity；activity 16
菊粉的原生素作用研究进展
菊粉的原生素作用研究进展 张名涛 1,2 ,顾宪红1 ,杨 琳 2 (1.中国农业科学院畜牧所,北京100094;2.华南农业大学动物科技学院,广东广州510642) 摘要:本文综述了菊粉的原生素作用及机理,主要包括菊粉的微生物发酵、营养、免疫和抗癌作用等。 关键词:菊粉;双歧杆菌;微生物发酵;短链脂肪酸;营养物质代谢中图分类号:Q 539 文献标识码:A AD VANCES IN INUL IN’S P REBIOTIC FUNCTIO N ZHANG Min g -tao 1,2 ,GU Xian -hon g 1,YANG L in 2 (1.I nstit ute o f A ni m al S cience ,CA A S ,Bei j i n g 100094,Chi na ;2.Colle g e o f A ni m al S cience an d Tech nolo gy ,S out h Chi na A g ricult u re U ni versit y ,Guan g z hou 510642,Chi na ) ABSTRACT :The p a p er reviewed recent advances in inulin’s p rebiotic f unction ,which mainl y consisted of microbial fermentation ,nut rition ,res p onse to stimulate immunit y and p rohibit carcino g enesis.At last t he p ros p ect of it s a pp lication in feed indust r y was p ointed out. K e y word :inulin ;bi f i dobacteri u m s p p ;microbial fermentation ;SCFA ;nut rient metabolism 菊粉(inulin )的主要成分是一类结构相似的果聚糖,这类果聚糖是由果糖残基(F )之间以β-2,1-糖苷键连接且末端连有一个葡萄糖残基(G )的直链多糖,结构式是G -1,(2-F -1)n -1,2-F ,简写为GF n (Edelman 等,1968)。此外,菊粉还含有少量另一类果聚糖(inulonose ),即末端没有连G 的果聚糖,结构式是F -1,(2-F -1)n -2,2-F ,简写为 F m (Ernst 等,1995)。菊粉广泛存在于各种植物,菊 芋和菊苣含量最高,鲜重可高达20%(干重80%)。Gibson (1995) 首次提出菊粉是一种原生素 (p rebiotics ),随后许多学者通过对菊粉深入研究都取得了同样结构,还发现它有其它一些生理作用。现在已开发出菊粉系列保健品,但菊粉作为一种原生素应用于饲料中的报道较少。本文主要综述了国外对菊粉的益生素作用及机理方面的研究成果,为菊粉在动物饲料中开发应用提供一些必要的理论依据。 1 菊粉的微生物发酵 1.1 胃、小肠消化 Graham 等(1986)、Nilsson 等(1988)先后发现,猪、小鼠和人不能分泌水解菊粉的β—果糖苷酶,菊粉在胃、小肠里不能被自身酶消化。Nilsson 等(1988)体外试验表明,胃液或其它酸性溶液可水解菊粉,生成果糖。Knudsen 等(1995)、Elle g ard 等 (1996)进行人体内消化试验,发现菊粉能被胃酸水 解成果糖。在胃内酸性条件下菊粉可被水解成果糖,胃内酸度是影响菊粉水解程度的一个重要因素,p H 值越小,水解程度大,反之亦然,菊粉被水解程度约为1%～15%(Nilsson 等,1988)。人和动物胃、小肠里可发酵菊粉的微生物很少,菊粉在胃、小肠不能被微生物利用。可见,菊粉在人和动物胃、小肠里极少被消化。 1.2 大肠微生物发酵 上述试验表明菊粉大部分以完整形式到达大肠,Levrat 等(1991)、Hubert 等(2000)研究发现菊粉主要以完整形式到小鼠盲肠,Elle g ard 等(1996)发现菊粉主要在人的结肠发酵。Nilsson 等(1988)用 含4.7%和9.4%菊粉的日粮分别饲喂小鼠,菊粉在 收稿日期:2002-03-24 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30170687) 作者简介:张名涛(1976),男(汉),籍贯湖北,主攻方向饲料资源开发与利用,硕士。 15卷4期动物营养学报 Vol.15,No.4,12～18 2003年12月 AC TA ZOON U TR IM EN TA SIN ICA Dec.2003 文章编号:1006-267X (2003)04-0012-07
实验 酶学性质研究
实验四酶学性质研究 一、实验目的 1、了解pH、温度、金属离子对酶的活性的影响机理； 2、掌握如何选择酶催化反应的最适pH、温度和获得最适pH条件的确定、以及Km常数的测定。 二、实验原理 酶促反应速度受介质pH的影响，一种酶在几种pH介质中测其活力，可看到在某一pH时酶促效率最高，这个pH称为该酶的最适pH。pH影响酶分子的活性部位的解离，另外，也影响底物的解离状态，从而影响酶活性中心的结合与底物或催化。其次，有关基团解离状态的改变影响酶的空间构象，甚至会使酶变性。酶的最适pH不是酶的特征性常数，如缓冲液的种类与浓度，底物浓度等均可改变酶作用的最适pH。 在一定温度范围内，酶促反应速率随温度的升高而加快；但当温度高到一定限度时，酶促反应速率不仅不再加快反而随着温度的升高而下降，最终，酶因高温变性失去活性，失去了催化能力。在一定条件下，每一种酶在某一温度时活力最大，这个温度称为这种酶的最适温度 在进行酶学研究时一般都要制作一条pH与酶活性的关系曲线，即保持其他条件恒定，在不同pH条件下测定酶促反应速度，以pH值为横坐标，反应速度为纵坐标作图。由此曲线，不仅可以了解反应速度随pH值变化的情况，而且可以求得酶的最适pH。最适温度的实验方法和pH类似。 酶促动力学研究酶促反应的速度及影响速度的各种因素，而米氏常数K m值等于酶促反应速度为最大速度一般时所对应的底物浓度，其值大小与酶的浓度无关，是酶促反应的特征常数。不同酶的K m值不同，同一种酶与不同的底物反应
时，其Km值也不同，Km值反映了酶和底物亲和力的强弱程度，Km值越大，表明酶和底物的亲和力越弱；Km值越小，表明酶与底物的亲和力越强。 酶的活力就是酶所催活的反应速度，通常用单位时间内底物的减少或产物的增加来表示。酶反应过程中产物的生成和时间的关系可以用进程曲线来说明，曲线的斜率就是酶反应过程中的反应速度。从进程曲线来看，在一定时间内反应速度维持恒定，但随着时间的延长，反应速度逐渐降低，这是由多种因素造成的。所以，为了准确表示酶的反应速度必须采用初速度，即保持恒定时的速度。同样，不同酶浓度下的反应进程曲线也可以说明这个问题。V=Vmax[S]/Km+[S]，Vmax 指该酶促反应的最大速度，[S]为底物浓度，Km是米氏常数，V是在某一底物浓度时相应的反应速度。双倒数作图（将米氏方程两边取倒数，可转化为下列形式：1／V=Km／Vmax.1／[S]+1／Vmax，可知，1/V对1/[S]的作图得一直线，其斜率是Km/V，在纵轴上的截距为1/Vmax，横轴上的截距为-1/Km。此作图除用来求Km和Vmax值外，在研究酶的抑制作用方面还有重要价值 三、实验器材与试剂 1、试剂：磷酸二氢钠、柠檬酸、ABTS、酸性靛蓝。 2、器材：可见分光光度计、恒温水浴锅、试管、酸度计 四、操作步骤 1、配置缓冲溶液 按下表配置缓冲溶液，其溶液pH值以酸度计测定值为准。
参考文献
参考文献 [1]?ngen-Baysal G, Sukan S S, Vassilev N. Production and properties of inulinase from Aspergillus niger[J]. Biotechnology letters, 1994, 16(3): 275-280. [2]Chen H Q, Chen X M, Li Y, et al. Purification and characterisation of exo- and endo-inulinase from Aspergillus ficuum JNSP5-06[J]. Food chemistry, 2009, 115: 1206-1212. [3]Sheng J, Chi Z M, Li J, et al. Inulinase production by the marine yeast Cryptococcus aureus G7a and inulin hydrolysis by the crude inulinase[J]. Process Biochemistry, 2007, 42: 805-811. [4]苏豫梅，李清清，李秉超．不同固定化菊粉酶方法的比较及条件优化[J]．现代食品科 技，2008，24(12)：1296-1299． [5]邓建珍，韦红群，陈燕珍．黑曲霉(Aspergillus niger)产菊粉酶菌株的筛选及培养条件的 研究[J]．生物学杂志，2007，24(6)：62-65． [6]Sergio D G, Gordon G B, Sneha A P, et al. Studies on the physiochemical properties of inulin and inulin oligomers[J]. Food chemistry, 2000, 68: 179-183. [7]Catana R, Ferreira B S, Cabral J M S, et al. Immobilization of inulinase for sucrose hydrolysis[J]. Food chemistry, 2005, 91: 517-520. [8]De G S, Birch G G, Parke S A, et al. Studies on the physiochemical properties of inulin and inulin oligomers[J]. Food chemistry, 2000, 68: 179-183. [9]黄秋婷，黄慧华．酶技术在功能性低聚糖生产中的应用[J]．中国食品添加剂，2005， (4)：72-76． [10]包怡红，生庆海．低聚糖的种类及其应用[J]．粮油食品科技，2002，10(6)：14-17． [11]Skowronek M, Fiedurek J. Inulinase biosynthesis using immobilized mycelium of Aspergillus niger[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2006, 38: 162-167. [12]曹泽虹，董玉玮，苗敬芝等．菊粉酶产酶菌株筛选与鉴定[J]．徐州工程学院学报(自 然科学版)，2009，24(3)：6-8． [13]林晨，顾宪红．菊粉酶研究进展及应用[J]．当代畜禽养殖业，2004，(1)：37-39． [14]王静，金征宇．微生物菊粉酶的研究进展[J]．生物技术，2002，12(2)：42-45． [15]周帼萍，沙涛，程立忠等．菊粉酶的研究及应用[J]．食品与发酵工业，2007，27(7)： 54-58． [16]Pessoa J A, Hartmann R, Vitolo M, et al. Recovery of extracellular inulinase by expanded bed adsorption[J]. Journal of Biotechnology, 1996, 51(1) : 89-95.
第三章 酶
第三章酶 思考题： 1、什么是酶？酶与化学催化剂有哪些相同点和不同点？ 2、何谓酶作用的专一性？举例说明有哪几种类型？ 3、解释单体酶、寡聚酶和多酶复合体。 4、什么是单纯酶和结合酶？ 5、酶的辅助因子有哪些？什么是辅酶、辅基？二者是如何区分的？ 6、什么叫全酶？全酶中酶蛋白和辅酶在催化反应中各有何作用？ 7、什么是维生物？维生素与辅酶有何联系？ 8、掌握TPP+辅酶、FMN和FAD辅酶、NAD+和NADP+辅酶、辅酶A的结构与功能。 9、何谓酶的活性中心？什么是酶的必需基团？必需基团有几类？它们的功能有哪些？ 10、什么是酶原和酶原的激活？简述胰凝乳蛋白酶原的激活过程。 11、什么是过渡态和活化能？ 12、中间产物学说和诱导契合学说的基本观点如何？ 13、酶作用的高效性的机理有哪些？ 14、什么是酶活力？测定酶活力的基本过程是什么？ 15、什么是酶活力单位？什么是比活力？ 16、影响酶促反应速度的因素有哪些？ 15、底物浓度与酶促反应速度的关系如何？表示其关系的数学表达式是什么？ 16、何谓Km？有何意义？怎样进行测定？ 17、何谓抑制作用？抑制作用有几类？各有何特点？ 18、何谓可逆抑制作用？可逆抑制作用有几类？各有何特点？ 19、举例说明何谓竞争性抑制作用和非竞争性抑制作用？其动力学曲线有哪些特点？ 20、温度和pH对酶反应速度有何影响？ 21、何谓变构酶？何谓变构效应？变构酶动力学曲线有何特点？ 22、以糖原磷酸化酶为例，说明何谓共价调节酶。 23、以哺乳动物乳酸脱氢酶为例，说明何谓同工酶。 24、酶命名的方式有几种？命名的原则是什么？ 25、酶可分为几大类？分类的依据是什么？ 练习题 一、名词解释 1、酶 2、酶作用的专一性 3、全酶 4、辅酶 5、辅基 6、单体酶 7、寡聚酶 8、多酶复合体 9、激活剂10、抑制剂11、别构酶12、同工酶13、酶的活性中心14、酶原及酶原激活15、酶活力16、酶的比活力17、米氏常数(K m值) 18、酶的抑制作用19、可逆抑制作用和不可逆抑制作用20、竞争抑制作用和非竞争性抑制作用21、核酶22、共价调节酶23、维生素 二、英文缩写符号 1、NAD+ 2、NADP+ 3、FAD 4、FMN 5、CoA 6、TPP 三、填空题 1、酶是产生的，具有催化活性的。 2、酶具有和两个最重要特征。 3、影响酶促反应速度的因素有、、、、
植酸酶在水产饲料中的研究进展样本
植酸酶在水产饲料中的研究进展 摘要文章从植酸酶的酶学性质、影响因素、对鱼类的营养及能量代谢等方面探讨其在水产饲料中的研究进展, 并从国内外研究例证中初步分析了植酸酶提高饲料中磷利用率以及降低水体污染的作用, 并为植酸酶制剂在渔用配合饲料中的应用提供参考。 关键词植酸; 植酸酶; 磷 磷是水产动物必须的矿物元素之一, 饲粮磷缺乏 或不足会显著影响水产动物体内的生理生化反应, 进 而阻碍水产动物的生长、骨骼发育和繁殖等活动。然 而, 在植物性饲料中, 磷主要以植酸及其盐的形式存 在, 占植物总磷量的 60%~80%, 植酸具有极强的螯合 能力, 能够与钙、镁、钾、锌、铜、锰等物质形成不溶性 的盐类。同时, 植酸还能够络合蛋白质, 抑制消化酶如 胰蛋白酶、胃蛋白酶和α-淀粉酶的活性。单胃动物 ( 如鱼类) 缺乏分解植酸及其盐的植酸酶, 植酸磷基本 上不能被单胃动物所利用, 因此水产动物饲料中需要 添加无机磷酸盐来满足水产动物对磷的需要。可是, 磷元素价格昂贵, 添加无机磷无疑提高饲料成本, 而 未被消化利用的植酸磷排出, 在一定程度上又造成了 磷资源的浪费而且污染了水体养殖环境。解决饲料污 染的有效途径之一是在饲料中添加植酸酶, 分解植酸 磷及其络合物, 提高植物性饲料中磷的利用率, 从而 减少无机磷在配合饲料中的添加量。 1 植酸酶的理化特性 Suzuki 等( 1907) 最早发现植酸酶 , 其一般是指催
化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸( 盐) 的一类酶的 总称, 按照国际生物化学和生物分子联合委员会的命 名, 植酸酶能够分为两种: 一种是肌醇六磷酸－3－磷酸 酯酶( EC3.1.3.8) , 另一种是肌醇六磷酸－6－磷酸酯酶 ( EC3.1.3.26) 。 植酸酶是一种新型的饲料添加剂, 研究表明, 将 植酸酶添加到植物性饲料中, 释放植酸中的磷, 不但 能提高水产动物对磷的吸收利用率, 而且能够降解植 酸盐蛋白质络和物, 减少植酸盐对微量元素的螯合, 提高动物对植物蛋白的利用率以及植物饲料的营养 价值, 并减少其粪便中磷的含量。 2 植酸酶的作用机理 植酸酶能够将植酸分子上的磷酸基团逐个切下, 形成中间产物 IP5、 IP4、 IP3、 IP2、 IP, 终产物为肌醇和磷酸。不同来源植酸酶作用机理有所不同。微生物产 的 3-植酸酶作用于植酸时, 首先从植酸的第 3 碳位 点开始水解酯键而释放出无机磷, 然后再依次释放出 其它碳位点的磷, 最终酯解整个植酸分子, 此酶需要 2 价镁离子(Mg 2+ )参与催化过程。来源于植物的 6-植 酸酶, 它首先在植酸的第 6 碳位点开始催化而释放出 无机磷。 1 g 植酸完全分解理论上可释放出无机磷 281.6 mg。大多数微生物来源的植酸酶的作用机理如 下( 见图1) 。 P P
提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量的研究进展
提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量的研究进展 肖生科1,2 王磊2 陈毓荃1 (1西北农林科技大学生命科学学院,杨凌 712100;2中国农业科学院生物技术研究所,北京 100081) 摘 要: 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是基因工程研究中广泛使用的真核表达系统,与现有的其它表达系统相比,巴斯德毕赤酵母在表达产物的糖基化修饰、折叠、加工、外分泌及表达量等方面有明显的优势。外源基因在该系统中表达时,由于受基因内部的结构、分泌信号、甲醇诱导的浓度及诱导时间、培养温度、启动子、表达环境的p H值等诸多因素的影响,一些外源蛋白的表达也存在着表达不够稳定、表达量较低,甚至不表达的情况。对影响巴斯德毕赤酵母表达的各种可能因素进行了分析,结合具体实践经验,就如何提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量的问题进行了综述。 关键词: 巴斯德毕赤酵母 酵母表达系统 基因表达 The Study on Improving Expression Levels of H eterologous G ene in Pichia pastoris Xiao Shengke1,2 Wang Lei2 Chen Yuquan1 (1College of L if e Sciences,Northwest Sci2Tech U niversity of A gricult ure and Forest ry,Yangli ng 712100; 2Biotechnology Research Instit ute,Chi nese Academy of A gricult ural Sciences,Beiji ng 100081) Abstract: As a eukaryote expression system,Pichia pastoris has been widely used in genetic engineering,which has many merits in the gene expression,protein process and secretion.The gene expression is influenced by a number of factors,such as the structure of gene,secretion signal peptides,methanol concentration,induction phase,temperature, PH,and promoter etc.These factors make some heterologous genes express unstably or express a little.This article ana2 lyzes these factors and reviews how to im prove expression levels of heterologous genes in Pichia pastoris. K ey words: Pichia pastoris Y east expression system G ene expression 动物、植物、微生物作为生物反应器为外源基因的表达提供了理想的环境,是基因工程及生物制药研究和应用的重要内容,也是生命科学研究领域的热点之一[1]。大肠杆菌被誉为是外源蛋白质表达的“工厂”,其具有易操作性,生长速度快,培养条件简单等优势。但是,大肠杆菌是低等的原核生物,不具有真核生物中mRNA翻译后修饰、加工的场所———内质网和高尔基体。虽然许多真核生物基因在大肠杆菌中可以表达,但有些表达的产物缺乏天然的生物活性或结构。哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统虽然能够表达结构复杂的真核细胞蛋白,但操作复杂,表达水平低,产业化生产造价昂贵,不易普遍推广使用[2]。酵母是单细胞低等真核生物,它既具有原核生物易于培养、繁殖快、便于基因工程操作和高密度发酵等特性,同时又具有真核生物基因产物正确折叠所需的细胞内环境和糖链加工系统,还能分泌外源蛋白到培养液中,利于纯化[3]。 1 利用巴斯德毕赤酵母表达外源基因的优缺点 酿酒酵母(S.cerevisiae)是首先被用来作为外源基因表达的宿主菌,然而其表达重组蛋白有一定的局限性,使其产业化应用受到了限制[1]。出芽酵母(Kl uyverom yces lactis)表达外源基因时与酿酒酵母相似,但表达量偏低,也不利于推广应用和规模化生产。 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是甲基营养型酵母,其乙醇氧化酶启动子(AOX)已被分离、克隆,这种酵母已经发展成为外源蛋白表达非常成功的宿主[4]。人们已在巴斯德毕赤酵母中已成功表达了多种外源蛋白,如IGF21和人血清蛋白已通过临 生物技术通报 ?综述与专论? B IO TECHNOL O G Y BULL ETIN 2004年第2期