贝克曼库尔特P ACE MDQ操作手册 Operational Manual for MDQ with 32 Karat Software(part-2)

图31 冲洗对话框

包含以下参数：

Pressure Type：选择冲洗方式

Tray Positions：和分离事件中的功能相同

V alues：冲洗强度参数（压力和时间）

Pressure Direction：压力或真空的方向

At Time：参看分离事件中的描述。

Inject：进样事件用于加载样品，一般为在分离事件之前的无时间限制的事件。图32 进样对话框

包含以下参数：

Injection Type：可以采用压力、真空或电动进样

Polarity：电进样时电极的电流方向

Pressure Direction：压力和真空的加载方向

V alues：进样的强度（压力和时间）

Tray Positions：参看分离事件中的描述

Sequence Table：如果用序列表，选中该项可以在序列表中修改进样参数。

可以使用多次进样。

Autozero

图33 自动调零对话框

将检测器的输出调零，限制时间可有可无。

Stop Data

图34 停止数据对话框

数据采集从0.00分钟开始，一直到Stop Data 事件发生。这是一个有限制时间的事件。

End

图35 结束对话框

结束事件是有限制时间的事件。

按照以下步骤建立时间程序。该程序包括：

．多溶液再生毛细管

．装载缓冲液

．进样

．分离

．运行后冲洗

所需的试剂和摆放位置见下表

点击时间程序表，点击事件框和向下箭，从下拉菜单选择Rinse，点击Trays 按钮，选择进口（左）为D1，出口（右）为B1，点击OK回到冲洗对话框，使用默认的参数并点击OK回到时间程序表。主要的参数已自动输入到表格中，这是无限制时间的事件，所以时刻窗口中没有值。

在下一行建立新的冲洗事件，选择从BI：E1到BO：B1；持续时间为0.5分钟。

再建立一行冲洗事件加载缓冲液，选择从BI：A1到BO：B1，压力为25psi，持续1分钟。

点击事件栏，选择进样事件。进样从BI：C1到BO：A1，压力为0.4psi，时间为3秒。

下面可进入分离事件。点击事件栏选择Separate事件。位置为BI：A2和BO：A1；选择电压分离；电压为30KV，ramp time为0.2分钟，持续时间为6分钟。选中At time按钮，设定时刻为0.00分钟。点击OK回到时间程序表。在时间

程序中有后冲洗步骤，固此需要Stop Data事件。点击事件栏选择Stop Data，在时刻中输入6.00；使采集数据在6分钟的时候停止。

最后一个事件是冲洗。从BI：E1到BO：B1，压力为20psi，持续1分钟，在6分钟时开始。

可以在分离事件开始以后进行调零事件，在新的事件栏选择Autozero，时间为1.00。在输入完成后它会自动移到正确的时间位置。

到此，时间程序设置如图36。

图36 仪器设置—时间程序

仪器设置的参数可进行修改，只要鼠标点击响应的区域就可实现。

重要的是：参数设置完成后要保存你所编辑的方法。选择FILE / METHOD /SA VE AS，并按给方法予命名。

默认的目录路径是d：\32 Karat \ Projects \Default \Methods。

方法现在已可以运行了。

第六章系统运行

Single Run单个运行

在上一节中我们建立了一个仪器方法，在这个练习中我们将以单独运行的模式运行方法。在这个模式下；方法必须手工地被用户在每次运行前启动。单个运行的模式在方法建立中是有用的。可根据运行的结果对方法或另外的过程进行修正。在这节的第二部分我们将创建序列做多个样品的运行。必须在联机的状态下进行样品运行和数据采集。如果不是联机的，会在仪器窗口的标题栏出现“（Offline）”。在继续前关闭任何离机的窗户。从32 Karat软件的主屏幕，双击仪器图标进入联机状态。

注意

检测器的光源或激光光源必须在开始一个方法运行以前打开。灯或激光光源的状态可从直接控制屏幕看到。UV灯可以在那里打开。如果激光光源部件的电源开关已经打开，并且所有的安全联锁已经关闭，激光光源可以从直接控制屏幕打开。

所需材料：

在直接的控制练习中准备的毛细管卡盘，毛细管规格为直径75 urn，总长度为60cm（到检测器的长度为50cm）。（请参看安装和维护手册关于新装卡盘和毛细管的介绍。）

．毛细管再生液A （1M氢氧化钠P／N 33842 4）

．运行缓冲液A （P/N 338426）

．重蒸水（HPLC级）

．2 mL小瓶和红瓶塞

．36位缓冲液托盘

．UV或PDA检测器：混合标样B（P/N 501333）

．LIF 488 nrn氩离子激光：LIF检测器混合标样（P／N 477615）

．LIF 635 nrn 半导体激光：LIF检测器混合标样（P/N 726022）

按下表放置试剂：

从菜单选择Control / Single Run或点击图标打开单个运行对话框：

图37 单个运行采集对话框

你必须提供：Sample ID, Method和Data file。数据文件将保存在数据路径指定的目录下。Sample ID用于内部标识样品。这个标识将在以后的报告中出现。

可以点击打开图标选择正确的方法。在本统习中选择方法编辑中建立的

方法。数据路径和方法的选择一样；不过选择的是文件夹而不是文件。数据文件可在方框中直接输入。但不能与数据路径中的文件重名，如果这样，方法将不会运行。其它的项目在方法运行中无需输入。

至此点去Start；系统会先检查方法是否和仪器设置相符，然后将方法传输到P／ACE MDQ主机，经仪器自检，然后再执行方法。

如果方法不能被执行，或是所得谱图和范例中不一致时，请检查以下几点：

．·缓冲液瓶中的液体是否正确。

．·缓冲液小瓶的位置是否和方法一致。

．·选择的方法是否正确。

．·方法和仪器设置是否一致

．·方法是否正确

．·托盘的设置是否一致

这一方法将用于以后的其它练习，请在得到正确的结果后再进行后面的练习。

Programming a Sequence 设计一个序列

应用序列表可以自动运行成批的样品,能用于采集数据和数据处理。在这一练习中将建立序列采集多次的数据。必须在“online”状态下进行。

建立新的序列，从仪器窗口选择File / Sequence / New，打开序列向导，共有5个屏幕，不同的序列会用到不同的屏幕，这一练习不需要用到所有的细节。

图38 序列向导—方法对话框

第一屏幕需要选择方法，点击图标找到在上一练习中建立的方法。由Data file type 中选择For acquisition，点击Next。

图39 序列向导—未知样品对话框

这一屏幕需要输入Sample ID 和Data File ID。在Sample ID 栏中直接输入文本信息，点击右边的蓝色箭头会打开下面的菜单。

图40 样品ID选项菜单

选择其中的一项会在Sample ID栏中插入栏中符号，在这一练习中选择Line Number，该参数会在序列表中自动加入。

Data Path 点击图标指定数据文件存放的位置。

在Data File 栏中输入数据文件名，点击右边的蓝色箭头会打开下面的菜单。

图41 数据文件选项菜单

如同上面样品ID选项菜单中的描述一样，选中的参数会加在Date File栏中。在这一练习中选择Date and Time。

Number of Unknown Runs in Sequence序列表中的行数，输入3。

Repetitions per Run每一行重复运行的次数。系统会在教据文件名加入重复标识。在这一练习输入1。

图42 序列向导—瓶位置对话框

如果在方法中选择允许改变瓶子位置，可以输入起始的位置。如果未选择或选择自动增加，可以忽略。系列的校准样品位置也可以输入。关于校准信息的细节请参看附录l。

图43 序列向导—标准对话框

这一练习不需要输入校准信息，点击Next 继续。图44 序列向导—报告对话框

可以选择在序列完成后自动进行的报告，这一练习不需要选择。点击Finish 出现新建的序列表。

图45序列表

这一屏幕有许多列组成，大部分的信息都能修改。并不是所有的列都会在本练习中使用，其中的几个要点如下：

Run Type：由于我们选择了Summary Report，所有的运行都是Summary类型，Begin和End标记指出报告中包括的运行行数。

Reps：告诉系统每一行重复运行的次数．点中Reps（重复次数）框，将第二行Reps改为2，则第二行会运行2次，这样总计三行的序列共运行四次。

拖动下部滚动条将窗口移到右边位置。

图46序列表

Sample ID：这一栏中的文字由在向导中输入的文字决定。将运行二的Sample ID 改为“Test Mix 002 Twice”。

Method：显示在向导中选择的方法。可以点击右边的绿色图标改变方法。Filename：显示在向导中输入的名称，文件名还显示日期和时间的象征符号＜D ＞，因为日期和时间只有在序列运行的时候才知道。

完成编辑后，选择File / Sequence / Save As将序列表保存并命名。

Running the Sequence运行这个序列

在运行序列前，检查仪器的状态：检测器配置是否正确；灯是否点着；样品

和缓冲液放置是否放置正确。

必须在“online”状态下才能进行序列运行。

在仪器窗口的工具条上点击绿色的双箭头打开以下对话拒。

图47 运行序列对话框

点击打开图标选择刚刚建立的序列表。

Run Range：允许选择只运行序列表的部分，在这一练习中选择“All”。Printing：允许系统在结束后自动打印报告。

确认输入无误后点击Start运行序列表。

系统运行时会检查方法的设置，如果有错误则会出现相应的信息，自动停止运行序列表。在改正错误后需要重新运行。

经检查无误后，第一行的方法会传给P/ACE MDQ，然后开始运行。

在运行过程中可以打开直接控制窗口查看仪器的实时状态。

在每一次运行结束后，系统重新将方法传给P/ACE MDQ主机，然后开始新的运行。因此可以在运行过程中修改方法，下一次运行时将会采用经保存过的

最新方法。同样也可修改序列表，但正在运行和已经运行过的行不能修改。序列运行结束后，产生四个文件，第二行的两个文件在名称后增加了“rep1”和“rep 2”。

第七章积分

Description简介

积分是为了正确计算峰面积，从而计算出待测组分的含量。其中的几个要点是峰的开始和结束，基线的形状和位置，如果峰未能完全分开，还需决定怎样分隔两峰的面积。下图是一张示例图。

图48 典型的色谱图

在该例中两个组分完全分离，其他两个仅仅部分分离。四个峰的面积不一样，这表明四种组分的浓度不同，或是他们对检测器的响应不同。定量计算将在下一章中讨论，这一章将着重讨论峰的检测和基线的构造。

Integrating Data积分数据

峰的积分需要两个必需的参数：峰宽和峰阈。复杂的电泳图需要其他复杂的参数。在这一章中将用上一章中的test mix图谱进行积分计算。对于不同的检测器积分步骤都是相同的。配置一台UV检测器进行离机积分计算。

在仪器窗口选择File / Method / New出现仪器设置窗口时将它关闭，在这一练习中不需进行设置。

从仪器窗口选择File / Data / Open，找到示例文件Sample l.dat，在打开的仪器窗口选择通道A。按键Ctrl－Z使图像最大。

辅助数据（电流、电压、功率、压力）不能积分。在电泳图上单击鼠标右键并选择

Annotations (注释), 出现以下对话框。

图49 图谱注释对话框

对话框中选择的注解项目将在电泳图中显示。单台左面的Peak＃（峰号）、Area（面积）、and Migration Time（迁移时间）和绿色的箭头将它们加入到右面。选中Baseline（基线）和Show undetected Peaks（显示未检测峰）。使对话框和上图一致点击OK （其中一些项目将在积分后才显示）。

从方法案单选择积分事件（Integration Events）。打开的数据表中有两个项目的默认值。Width（宽度）=0.2和Threshold（峰阀）＝50。

可使用默认的参数进行最初的计算。从菜单条上选择Analysis / Analyze或

点击分析按钮。积分过程需要几秒钟的时间，大的数据文件和多个的峰需要的时间会更多一些。在积分过程中分析按钮变为停止。点击停止后会放弃分析。

积分结束后，大约有26个峰出现，在峰的上下会显示峰号、面积和迁移时间。默认的参数在确认主要的峰同时，也将基线漂移进行积分（可按住鼠标左键并拖动箭头将局部放大，按Ctrl－Z将图像缩小）。此外3.0到3.4分之间表示即使负峰也被检测。

Optimizing Integration优化积分

选择Window / Tile Horizontally，电泳图和积分参数表将并列排在一起显示。将电泳图调节到最小化，进入积分参数表，将Threshold调为100，重新分析。这次将会剩下10个峰。仔细察看14到15分钟的谱图会发现这些峰和真实的峰很相似。虽然这些峰是相当地小。

峰阈值决定一个峰必须高于背景噪音后由积分软件被确认为是峰。增加峰阈值可过滤背景漂移。如果增加过多也会将真实的峰忽略不计。将峰阈值改为1000重新进行积分，主要的峰也不会被积分，峰的基线会发生巨大的改变。

在尝试峰宽的效果时，将峰阈值改回100。点击分析，将主要的峰放大。再把峰宽改为0.l后分析。第二个峰的尾部被分为单独的面积，把峰宽改为0.5。分析后尾部也被分裂，但位置和前面有所不同。

Integration Parameters积分参数

除了峰宽和峰阈值外还有其他的积分参数，在附录中有详细说明。在下个练习中我们将用其他一些参数进行复杂的积分计算。

将峰宽改为0.2，峰阈值改为50。打开Sample 2.dat，这是一张较为复杂的电泳图谱，先用系统默认的参数进行分析。会有很多的峰被积分，但末尾的大峰却未被积分。注意观察27到28分钟的图谱，有许多小峰，最后一个的峰号为150。由于软件最多能对进行150个峰积分，所以末尾的大峰被忽略了。

我们对这150个峰并不是都感兴趣，因此需要对积分参数进行调整。

Width峰宽

先将图谱缩小；再将9.5分钟时的第一个主要的峰放大。该峰峰宽大约为0.5

分钟，比周围的峰都要宽。在电泳图上单击鼠标右键，选择Graphical Programming，打开积分参数菜单。选择Width（峰宽），在状态栏上会出现提示：“Click on the start of the peak”，将鼠标箭头移至第一个主要的峰起点点击左键，系统会提示在峰的终点再点击一次。在峰的起点和终点输入后，会出现以下的对话框，由于点击的地方不相同，所以你的值会有细微的差别。

图50 决定峰宽

对话框中有许多有用的选项。Start和Stop times是你点击的两个点。Width 的参数值就是两点的差。请注意Insert into Integration Events table和Insert into Manual Integration Fixes table，这两者有很大的差别，选择前者，峰宽参数值会成为方法的一部分，会对任何以该方法积分的数据起作用；而后者则称为数据的一部分，仅对该数据目前分析起作用。在Add to Table出按键后选，参数被加入积分事件表中，Analyze Now则会用新的参数进行积分。请选择Add to Table。

新的峰宽值会在积分事件表中出现，则一参数只会影响开始和结束时间间隔以内的积分，将新加入参数的开始和结束时间都设为0, 则该参数值会对整张图谱有效。为了使你的积分结果和手册一致请将峰宽值设为0.5（你设定峰宽值应该和0.5非常接近）。

由于在整个分析操作过程中，我们对同一参数使用了不同的值，因此需要将旧的参数删除, 或采取另一种更为简便的方法：点击相应行左边的红色标记（√）, 将标记去除，这一参数将会被忽略。您的积分事件表看起来应和下图一致。

图51 积分事件表

Threshold 峰阈值

将图像缩小, 点击分析。积分发生了很小的改变。依旧有许多小峰被积分。在电泳图上单击右键，选择Graphical Programming（色谱参数）/ Threshold（峰阈值），按照状态栏的提示在起点（大约为0对分钟）和终点8.0分钟处单击鼠标。出现对话框时点击Analyze按钮,新的峰阈值大约为850时就会将0－8分钟的小峰过滤掉。和峰宽一样将峰阈值的开始和结束时间改为0, 将值设为850, 并将原有旧的阈值忽略后再进行分析。新的参数值把几乎所有的小峰过滤掉了，末尾的大峰也被积分，但对24－26分钟的积分仍旧有问题。将该区域放大，可以看到积分基线从峰开始的半峰高处开始。这说明整个图谱范围内采用一组参数并不会对每一个峰的积分都合适。我们需要对特殊的区域设置特定的积分参数。

Integrating a Peak Cluster积分一组峰

回想使用系统默认参数时，这一段的积分较为合理，或许其中一个参数或两者同时使用能得到满意的结果。将图像缩小，从Graphical Programming （色谱参数）菜单选择Width（峰宽），按照提示分别点击24和25分钟。这一次我们用图谱功能定义开始和结束时间，而不是峰宽。对话框出现后将峰宽值改为0.2，点击Analyze按钮。得到的结果和下图相仿。