固定化葡萄糖氧化酶生产葡萄糖酸钠的研究

山东轻工业学院

硕士学位论文

固定化葡萄糖氧化酶生产葡萄糖酸钠的研究

姓名:张岳勋

申请学位级别:硕士

专业:发酵工程

指导教师:王瑞明

2011-06-15

摘 要

本论文利用酶法生产葡萄糖酸钠,研究内容包括葡萄糖氧化酶提取条件的确定、固定化葡萄糖氧化酶的制备、固定化酶性质的研究、固定化酶生产葡萄糖酸钠的工艺条件研究。

本文以产葡萄糖酸钠黑曲霉废菌丝为原料提取葡萄糖氧化酶。由于葡萄糖氧化酶是胞内酶,需要先将菌丝破壁,使其中的葡萄糖氧化酶释放出来,而且要采取措施保证酶的活力损失最小。获得的粗酶液,再经过初步纯化,即可制成酶制剂。确定了破壁的方法为超声破壁,超声破壁的最优条件为:超声时间50min,超声温度60℃,超声功率200W。破壁后选取70%乙醇一次沉淀葡萄糖氧化酶,然后用16%的PEG二次沉淀酶。

本研究首先对三种固定化载体的固定化效果进行考察,通过比较三种固定化酶的制作难易程度、酶活回收率,最终选取了羟基磷灰石作为载体。确定了最佳固定化最优条件为:给酶量为0.07g/mL,温度为30℃,pH 6.5,固定时间15h。

利用新型纳米材料羟基磷灰石固定化葡萄糖氧化酶,研究了固定化酶的酶学性质。研究了温度、pH、金属离子、储存时间对游离酶和固定化酶活力的影响。固定化酶的最适反应温度40℃,最适pH值为6.5,较游离酶分别提高了4℃和0.9。固定化酶的平均酶活回收率为61.85%。此外,固定化后的酶储存稳定性有所提高,可重复使用七次,酶剩余活力仍在62.1%。

本文对底物浓度、温度、pH、通气量与反应时间等因素对酶法生产葡萄糖酸钠工艺进行了优化。结果表明:底物浓度对糖酸物质的量转化率影响不显著,最适温度40℃,最适pH 6.5,通气量10L/min,反应时间80h。正交试验对葡萄糖酸钠制取工艺优化,最优结果为:底物浓度400g/L,温度40℃,pH 6.5,通气量10L/min,反应时间80h。

关键词:葡萄糖酸钠;葡萄糖氧化酶;提取;固定化;酶学性质;工艺

ABSTRACT

This thesis is based on production of sodium gluconate with enzyme.The main

research contents include the determination of GOD’s extraction conditions, preparation

of immobilization of GOD, properties of immobilized enzyme, process conditions of

sodium gluconate production by immobilized enzyme.

In this paper, waste mycelium of sodium gluconate’s production is used in the

extraction of GOD. As GOD is intracellular enzyme, first mycelium need to be broken,

then glucose oxidase can be released from intracellular, at the same time I should take

steps to ensure minimal loss of enzyme activity. After the initial enzyme solution is

obtained, it is futher to be purificated and be made into enzymes. Finally the method of

waste mycelia broken can be determined, the optimal conditions are: ultrasonic time is

50min, ultrasound temperatures is 60℃, the ultrasonic power is 200W. After waste

mycelia is broken, 65% ethanol is used to precipite GOD, and then 16% PEG is used to

precipite GOD for the second time.

The effects of three carriers for enzyme immobilization were firstly researched, by

comparing ease of production of the three immobilized enzyme and activity recovery, at

last hydroxyapatite is selected as a carrier. The optimum conditions for immobilization

is: the amount of enzyme was 0.07g/mL, temperature 30℃, pH6.5, fixed time 15h.

GOD is immobilized with a new nano-materials Hydroxyapatite, then study the

enzymatic properties of immobilized enzyme. The effects of temperature, pH, metal

ions, storage time on the free enzyme and immobilized enzyme activity are researched .

The optimum temperature and pH of immobilized enzyme is 40℃ and 6.5, increased

℃ compared with free enzyme. The average enzyme activity recovery of by 4 and 0.9

the immobilized enzyme was 61.32%. In addition, storage stability of the immobilized

enzyme is increased. It can be reused for seven times, the remaining enzyme activity

was still 62.1%。

In this paper, the enzymatic production of sodium gluconate on substrate

concentration, temperature, pH, aeration rate and reaction time was optimized. The

results showed that: substrate concentration have little effect conversion on the amount

of sugar and acid substances;optimum temperature is 40, optimum pH

℃ is 6.5,

ventilation is 10L/min, reaction time is 80h. Orthogonal Preparation of sodium

gluconate process optimization, optimal results are: substrate concentration is 400g/L,

ABSTRACT

℃ is 6.5, ventilation is 10L/min, reaction time is 80h. temperature is 40, pH

Keywords: sodium gluconate, GOD, extract, immobilized, enzymatic property, technology

学位论文独创性声明

本人声明,所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文中引用他人的成果,均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的任何形式的研究成果,也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果,与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。

论文作者签名: 日期: 年 月 日

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第1章 绪论

1.1 引言

目前全世界主要使用四种方法来生产葡萄糖酸钠,分别为生物发酵法、均相化学氧化法、电解氧化法和多相催化氧化法,这四种方法在中国均有着广泛的研究 [1],应用于工业生产的主要为生物发酵法和均相化学氧化法,近几年生物发酵法的应用越来越广泛。

生物发酵法生产葡萄糖酸钠使用的菌种大多是黑曲霉,该方法是在240-300g/L的葡萄糖溶液中加入少量的硫酸镁、玉米浆等营养物质,经过121℃灭菌20min后,待培养基冷却,接种体积分数为10%的种子液,同时开动搅拌和通气,发酵温度维持在35℃,pH为6.5左右,pH通过流加NaOH来调节。当残糖降至1g/L时可以认为发酵结束。发酵液经过过滤、真空浓缩、结晶、喷雾干燥后可得葡萄糖酸钠粉状产品。发酵法生产葡萄糖酸钠具有发酵速度快、发酵过程易于控制、产品易提取等优点,但同时也有一定缺陷,如产品色泽不易控制等。

多相催化氧化法是在60℃以下,通过催化剂的反复催化使用来制备葡萄糖酸钠。该方法的优点是反应时间短、转化率高、工艺过程简单、三废少且易处理等,但由于贵金属价格昂贵和催化剂易失活,只要能克服这两个缺点,同样拥有较大的优越性和应用潜力。

20世纪80年代起,许多学者开始研究使用固定化酶法生产葡萄糖酸钠,其中包括固定化细胞和固定化酶,但都遇到同样难以解决的问题,即反应过程中耗氧量极大,传氧速率慢。许多学者预计:今后生产葡萄糖酸钠的方法极有可能朝着固定化细胞或固定化酶的方向发展 [2]。

1.2 葡萄糖酸钠的用途

葡萄糖酸钠(sodium gluconate),又称五羟基己酸钠,是一种用途极为广泛的多羟基有机酸盐,它的性质是易溶于水,在醇中溶解度略低,完全不溶于醚。其分子式为C6H11NaO7,相对分子质量为218.14[3]。在建筑工业、食品、水质稳定剂、钢铁表面清洗剂、医药、玻璃瓶专用清洗剂等方面有着广泛的用途。

1.2.1 建筑工业

随着我国城市化进程的加快,混凝土利用率越来越高,相对于其他化工原料,如木质素衍生物与烷基芳香磺酸盐、顺丁烯二酸衍生共聚物、芳香族氨基磺酸系

第1章绪论

高分子化合物等,葡萄糖酸钠在减水缓凝效果上具有明显的优势[4]。

由于葡萄糖酸钠在结构上只有一个羧基,是多羧酸系高性能减水剂中的一类,其减水率、含气量、保水性、坍落度保持性和水泥强度贡献率等指标均优于其它减水剂[5],在作为缓凝剂上有很大的优势。在水和水泥的量不变的情况下,加入葡萄糖酸钠能起到增塑剂的作用。在葡萄糖酸钠掺量在0.1%以下时,其改进和易性的程度与掺量成正比;在葡萄糖酸钠掺量为0.1%时,减水率为10%,能够有效增加混凝土强度,同时能够降低水泥含量,可以作为水泥减水剂使用[6]。

作为缓凝剂时,添加葡萄糖酸钠能够显著延缓混凝土的初凝和终凝时间。当葡萄糖酸钠的掺量在0.15%以下时,初凝时间的对数与掺量成正比,这就能大大延长了工作时间,尤其是在夏季和需要放置的时间较长时,在建筑行业用途越来越显著[7]。

1.2.2 食品

葡萄糖酸钠由于其结构特点和味质上的优点,在食品行业具有以下功能:①可取代食盐的加工功能;②能够改善呈味;③有屏蔽异味的作用;④可以调节pH 等。

1.2.3 水质稳定剂

葡萄糖酸钠具有优异的缓蚀阻垢作用,被广泛用做水质稳定剂应用于水质的检测中,其优越性主要表现在:①具有明显的协调效应,适用于钼、钨、磷、硅、亚硝酸盐等各种配方;②缓蚀率随温度升高而逐渐增加,阻垢能力强,对钙、铁、镁盐具有很强的络合能力;③能作为循环冷却水缓蚀阻垢剂达到灭公害的作用[8]。

1.2.4 钢铁表面清洗剂

葡萄糖酸钠作为钢铁表面清洗剂,应用于需要镀钵、镀铬、镀锡、镀镍以适应特殊用途时,其钢坯表面均可以使用葡萄糖酸钠进行严格的清洗,这样就可以使镀层物与钢铁表面牢固结合 [9]。

1.2.5 医药

葡萄糖酸钠也可以用于医药方面,主要的方面有[10]:通过注射葡萄糖酸钠,可以调节人体内的酸碱平衡,在发挥神经肌肉的正常功能方面具有重要的作用;添加到食品中,有效地防止低纳综合症的发生。

1.2.6 玻璃瓶专业清洗剂

将葡萄糖酸钠添加到清洗剂中,专门用于玻璃瓶的清洗有以下优点:去垢能力强,不易堵塞洗瓶机的喷咀及管路;对瓶贴及瓶颈铁锈去染力理想;不会对食用安全性造成影响。

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1.3 葡萄糖氧化酶

葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,简称GOD),其系统命名为β-D-葡萄糖氧化还原酶( EC 1.1.3.4),它能高度专一性地催化β-D-葡萄糖与空气中的氧反应,使葡萄糖氧化成为葡萄糖酸和过氧化氢[11]。GOD是酶技术领域中一种非常重要的酶,由于GOD与生命重要物质葡萄糖和氧的密切关系,导致了它在科研、食品和医药工业生产上广泛的应用。

1.3.1 GOD的来源

GOD广泛地分布于动物、植物和微生物体内,其中由于微生物具有生长繁殖速度快,来源广等特点使之成为GOD的主要来源。微生物中的主要生产菌株为黑曲霉和青霉[12]。部分细菌也能生产GOD,主要有弱氧化醋酸菌等。日本主要采用尼崎青霉(P.anagasakiense)来生产,我国主要采用点青霉(Penicillium notatum)、产黄青霉(P. chrysogenum) [13]来生产。在深层培养中,青霉属表现为趋向于呈非牛顿力学状态的菌丝态,因此,高度集中的菌体限制了内部物质的转移。另一方面,曲霉属会形成导致较少粘性流体形成的小球状菌体。因此,曲霉生产过程比青霉有一个明显的优势,因为如果曲霉菌体球保持在一个临界值以下,那么GOD的生产就可能被动态的控制。有报道表明,GOD的酶活62%与菌体有关,分别以34%、12% 和16%的比例分布于细胞壁、细胞质和粘液之中,其余38%的活力分布在胞外液。酶在胞内液和细胞壁中的定位点已通过免疫细胞化学标记法确定。在非活细胞中,菌体连接酶分布在这些位置,但是在活细胞中,酶主要和细胞壁相关。酶活力的分布表明如果从菌体中获得酶将导致38%的活力丧失,而如果在胞外液中获取会失去62%的活力[14]。

1.3.2 GOD的发展史

20世纪初期,Maximou在黑曲霉培养物中发现了吸氧酶系统。1924年Malliard 发现了葡萄糖酸。1928年,Muller用黑曲霉菌丝体压制进行葡萄糖酸形成的酶学研究,探明在葡萄糖存在时能消耗氧,并命名为GOD,把它归入脱氢酶。以后许多研究者对该酶的性质作了大量的研究工作,尤其对GOD的辅基—黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作了深入的研究。BentleyNeubergar 应用同位素18O2·H218O明确了在有过氧化氢酶存在下的一系列试验。Keilin等对黑曲霉的GOD的动力学及其作用形式也作了较详细的研究。1961年国际生化协会酶委员会将该酶的系统名称叫做β-D-萄萄糖-氧化还原酶(EC1.1.3.4)[15]。

第1章绪论

1.3.3 GOD的结构和酶学性质

1.3.3.1 酶的结构

GOD是一个同型二聚体分子,含有两个FAD结合位点。每个单体含有两个完全不同的区域:一个区域与部分FAD非共价但紧密结合,该区域主要为β折叠,另一区域与底物β-D-葡萄糖结合,该区域由四个α-螺旋支撑一个反平行的β折叠[16]。

Kellin等通过实验证明GOD的辅基为黄素腺嘌呤二核苷酸——FAD,实际上是通过FAD的氧化还原作用表现出来酶的氧化作用。如图1.1所示,抗甲氧苯青霉素葡萄球菌(MRSA),可产生一种特殊的青霉素结合蛋白变体,图为从青霉素结合蛋白变体中清楚的观察到的GOD,结合在GOD较深处的FAD是此氧化反应的辅助因子,即图中的红色部位,葡萄糖结合的活性位点在FAD的上面,处于较深的立体结构中,如图中星号位置所示,GOD像很多在细胞外发挥作用的蛋白质一样,表面被糖链覆盖,图中用绿色表示糖链[17]。

图1.1 葡萄糖氧化酶的结构

1.3.3.2 酶学性质

高纯度的GOD为淡黄色粉末,易溶于水,完全不溶于乙醚、丁醇、氯仿、甘油、吡啶、乙二醇等。50%丙酮、66%甲醇都能使其沉淀,一般产品中都含有过氧化氢酶。GOD的分子量为15.4万左右。GOD的最大光吸收波长为377nm 和455nm。在紫外光下无荧光,但是经过热、酸或碱处理后具有特殊的绿色。固体酶制剂在0℃下可以稳定保存至少两年,在-15℃下稳定8年。GOD稳定的pH值范围为3~8,最适pH值为5,如果没有葡萄糖等保护剂的存在,pH值大于8或小于3,GOD 将迅速失活。GOD的作用温度为30~60℃,EDTA、KCN 及NaF对该酶没有阻抑作用,但HgCl2、AgCl、对氯汞苯甲酸和苯肼对酶有阻抑作用[18]。

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1.3.3.3 酶的作用机理

GOD通常与过氧化氢酶组成一个氧化还原酶系统。GOD在氧气存在下能氧化葡萄糖生成D-葡萄糖酸内酯,同时消耗氧生成过氧化氢。过氧化氢酶能够将过氧化氢分解生成水和1/2氧,而后水又与葡萄糖酸内酯结合产生葡萄糖酸(如图1.2)。在此过程中,GOD的特点是能够消耗氧气催化葡萄糖氧化;每摩尔GOD在有过氧化氢酶存在下消耗1摩尔原子氧,没有过氧化氢酶存在下消耗1摩尔分子氧,在有乙醇和过氧化氢酶存在下,也消耗1摩尔分子氧。

图1.2 GOD的反应机理图[19]

GOD的催化反应,根据条件不同有如下3种形式:

(1)在有过氧化氢酶存在下,每摩尔GOD氧化时消耗0.5摩尔分子氧,生成1摩尔葡萄糖酸。

C6H12O6+1/2O2→C6H12O7

(2)在没有过氧化氢酶存在下,每摩尔GOD氧化时消耗1摩尔分子氧,生成1摩尔葡萄糖酸和1摩尔过氧化氢。

C6H12O6+O2 →C6H12O7+H2O2

(3)在有乙醇和过氧化氢酶存在下,过氧化氢同时被用于乙醇的氧化作用,此时,每摩尔GOD氧化时消耗1摩尔分子氧,生成1摩尔葡萄糖酸、1摩尔乙醛和1摩尔水。

C6H12O6+C2H5OH+O2→C6H12O7+CH3CHO+H2O

此外,GOD催化β-D-葡萄糖的速度要比催化α-D-葡萄糖的速度快150倍。

第1章绪论

1.3.4 GOD的应用

由于GOD能够利用氧气将葡萄糖氧化成葡萄糖酸而有效去除氧,因而被广泛用作抗氧化剂、葡萄糖酸、尿糖试纸和生物传感器的生产而应用于食品工业、畜牧业和医药行业。

1.3.4.1 GOD在食品工业中的应用

由于GOD具有对人体无毒、无副作用的优点,因而被广泛地用做食品添加剂应用于食品工业,主要有四个方面的应用:去葡萄糖、脱氧、杀菌、测定葡萄糖含量。

(1)去除食品中残留的葡萄糖

如果食品中残留有葡萄糖,葡萄糖就会与蛋白质中的氨基酸发生美拉德反应,使食品中出现小黑点,导致食品变质。如果在食品中添加GOD,就可以把残留的葡萄糖氧化,延长食品的保质期。由于GOD无毒,可以放心作为食品添加剂。目前GOD主要用于脱水制品如蛋粉、蛋白片、脱水蔬菜、土豆制品中 [20]。

(2)脱氧

有类食品,如啤酒、葡萄酒、果汁、果酱等中,如果有氧气的存在,会使还原物质氧化,导致沉淀、变身、浑浊等现象的出现。在啤酒的生产过程中加入GOD,由于它有专一性,不会对啤酒中其它物质产生影响,可以有效地去除啤酒中的溶解氧和瓶颈氧,若在其中加入适量的GOD,它可以催化氧与啤酒中的葡萄糖生成葡萄糖酸内酯而消耗溶解氧可以有效地去除氧气,有效地保护食品中的还原性物质。葡萄糖酸内酯较稳定,没有酸味、无毒副作用,对啤酒的质量没有影响[21]。(3)杀菌

GOD还能起到杀菌消毒的作用,它经常与过氧化氢酶配合使用,可以延长食品的保质期。鲜奶的生产过程中,经常采用H2O2-GOD-HPD体系组成的保鲜剂对鲜奶进行消毒。在生产鲜奶时,开始时加入H2O2,由于在70℃过氧化物酶已失去活性,H2O2就可以完全发挥其杀菌消毒的功能,再加入GOD-HPD,就可以去除残留的H2O2,这样既延长了牛乳的保质期又不会影响其品质和风味[22]。

(4)食品中葡萄糖的定量分析

GOD还可以被制成GOD分析仪用于食品、医疗等行业中。这是由于GOD能专一性地氧化葡萄糖,因此制成的分析仪能准确测量出含量量,真正起到指导生产、方便生活的作用 [23]。

1.3.4.2 GOD在畜牧业中的应用

GOD与普通的酶制剂不同,作为一种新型的绿色添加剂有其独特的作用方式,它并不是通过改善营养素的消化利用和减轻抗营养因子的方式来改善对动物生产性能的影响。其影响方式可能是一方面通过与饲料中葡萄糖作用而产生葡萄糖酸

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来发挥作用,另一方面,GOD在与葡萄糖作用过程中消耗O2,使消化道更易形成厌氧环境,促使厌氧有益菌的增殖。综合起来,GOD通过在肠道中的作用而可能起到酸化剂和益生菌的作用[24]。

由于GOD本身的特性,在饲料中添加能够起到抗氧化的作用。GOD能够消除牲畜在应急时细胞产生的自由基,还能不断氧化葡萄糖生成葡萄糖酸,降低肠道的pH,这样有利于饲料的消化,提高牲畜的免疫力,起到了高产的效果,因此GOD 被越来越多的饲养员所使用。GOD因此成为科研机构研究的一种热门饲料。李焰[25]对GOD饲养肉鸡效果进行了试验,结果表明GOD对改善养殖环境,特别是对大型肉鸡养殖是有很大帮助的。另外,GOD还有抑菌的作用,能够抑制多种霉菌,对黄曲霉毒素B中毒有很好的预防效果,因此在饲料中添加GOD,还能预防疾病。目前随着GOD的制备和提纯工艺的不断发展完善,使用成本的不断降低,GOD将在畜牧行业中发挥越来越重要的作用。

1.3.4.3 GOD在医药中的应用

目前,我国医院普遍采用GOD电极法、GOD-过氧化物酶偶联法等检测血液、血清中葡萄糖含量。虽然检测手段不同,但基本上都采用了一个相同的反应机理,即葡萄糖在GOD的作用下被氧化为葡萄糖酸,并释放出H2O2,然后通过检测O2浓度的降低或者H2O2浓度的升高间接测定葡萄糖的含量[26]。

1.4 GOD的提纯

由于黑曲霉或青霉在产生GOD的同时还伴有过氧化氢酶、α-淀粉酶、蔗糖酶和其他蛋白质的产生,因此有必要对GOD进行提纯处理,以除去杂蛋白。提纯GOD有以下几种方法,分别为:沉淀法、吸附法、离子交换法等[27]。

1.4.1 沉淀法

用沉淀法提纯GOD,可以使GOD和其他蛋白质初步分开,沉淀法分为分级沉淀和一步沉淀。需要注意的是,沉淀操作需要在低温下进行,因为GOD在室温下对某些沉淀剂不稳定,导致酶失活。沉淀GOD所用的沉淀剂种类、浓度及沉淀温度见表1.1。

第1章绪论

表1.1 常用沉淀剂的种类、浓度及沉淀温度

种类甲醇 乙醇 丙酮 单宁亚铁氰化

硫酸铵 硫酸铜

浓度(%) 56-58 60-65 60 0.025 90 0.05

沉淀温度(℃) 20 ﹣10 ﹣10 25 25 25 25

沉淀法单独使用时,一般提纯效果较差,比活性仅能提高1倍左右,因此它

通常和其他提纯方法联合使用,产率按活力计为60~95%。同时,用该法沉淀出GOD后必须首先除去沉淀剂才能进行下一步的操作。

1.4.2 吸附法

使用吸附法提纯GOD,主要是利用吸附材料的吸附能力,GOD通过与吸附材

料的活性基团疏水相互作用而被吸附,吸附后再通过改变缓冲液的浓度和pH值,

使GOD与吸附剂解吸。例如高岭土在pH4.0-4.3和pH3.4-3.5的条件下分别对过氧

化氢酶和GOD有吸附作用。表1.2中列举了文献中报道的吸附剂的种类、吸附浓度、吸附pH和解吸条件。

表1.2 吸附剂的种类、浓度及吸附和解吸条件

吸附剂 高岭土 皂土 氧化铝 110树脂

吸附剂

浓度(%)

7.5 5-15

吸附pH 3.4-3.5 3.8 6.8-7.0 3.5-4.6

解吸条

件 0.2mol/LpH7.0的

醋酸-磷酸盐缓

冲液

0.3mol/LKH2PO4、

9%NH4Cl

0.7mol/LpH5.0醋

酸盐缓冲液

吸附法的优点是使用材料的价格便宜,且经过适当处理后可反复使用,缺点是对GOD的吸附能力较差,吸附后GOD酶活不高,同沉淀法一样,经过吸附法提纯的GOD比活性提高一般为1~1.5倍。因此,吸附法一般也是和别的提纯方法共同使用,已达到最佳的提纯效果。

1.4.3 离子交换法

离子交换法提纯GOD主要是由于GOD和过氧化氢酶的等电点不同而达到提纯的目的。GOD的等电点(PI)在4.2左右,而过氧化氢酶的等电点在6.5附近,因此在提纯GOD时应选用阴离子交换剂,且选择在pH值大于4.2时上样,此时GOD带负电荷,可被阴离子交换剂吸附留在柱中,由于过氧化氢酶带正电荷随淋

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洗液流下,从而使二者得到分离,最后用pH小于4.2的缓冲液洗柱,因GOD带正电荷而从柱上被洗脱下来。表1.3中列举了上述离子交换剂的操作条件。

表1.3 两种离子交换剂的操作条件

操作条件

上样 0.05mol/L,pH4.5的醋酸盐缓冲液

淋洗 0.07mol/L,pH4.5的醋酸盐缓冲液

洗脱 0.1mol/L,pH3.7的醋酸盐缓冲液

使用离子交换法进行提纯后的GOD的比活性较沉淀法和吸附法高,产率为30%~60%。但GOD溶液在上柱前一般需要先用沉淀法或吸附法进行初步提纯,除去部分杂蛋白,否则可能对离子交换柱有影响,使得提纯后比活性不高。若GOD 溶液的离子强度较大(大于0.1mol/L)时,还必须首先通过透析、超滤或葡聚糖凝胶G-25过滤脱盐后才能上样,否则可能由于样品离子强度太高而使离子交换剂失去对GOD的吸附能力。

1.5 GOD的固定化研究进展

在分子氧存在的情况下,GOD催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢,同时反应体系的pH值会降低,且有过氧化氢的氧化破坏,游离酶将会很快失去活性,不能很好地起到催化的作用;若将游离酶固定化,固定化酶就与过氧化氢的接触时间相对较短、pH值相对稳定,就能较好的避免酶活的损失,并且固定化酶能够重复使用,从而会提高经济效益。

自从有固定化技术以来,GOD的固定化载体、方法就有很多种。早期所用的载体有DEAE-Sephdex A-25,硅酸CNBR-Sepharose等;固定化的方法有吸附法、共价法、包埋法等。

1.5.1 固定化酶载体材料简介

目前国内外对GOD进行固定化研究所选用的载体材料很多,简介如下:

1.5.1.1 纤维素

纤维素是由多个葡萄糖分子构成,单个葡萄糖分子的残基中含有多个羟基,李旭祥等用氧化剂将其部分羟基氧化为醛基,与GOD中的氨基反应,将GOD成功固定在经过氧化的纤维素上,酶活回收率达到60%[28]。

1.5.1.2 氨基硅胶

氨基化硅胶可以由四甲氧基硅烷(TMOS)和γ-氨丙基甲基二甲氧基硅烷

第1章绪论

(APMDMOS)为前体制成,然后以戊二醛为交联剂,以氨基硅胶为载体,对GOD 进行固定化,表现出良好的稳定性 [29]。

1.5.1.3 壳聚糖凝胶

冉均国[30]等人发现壳聚糖所含的氨基可与交联剂戊二醛的醛基作用形成schiff碱而构成凝胶,酶就可以被包埋在其中。以壳聚糖为固定化载体,价格低廉,原料易得,机械性能良好,且可生物降解,固定化酶效率高,但是与壳聚糖交联使用的醛可能会导致酶的失活,而且壳聚糖容易被酶降解。

1.5.1.4 金纳米微粒

最早的固定化应用起始于1983年,Horisberger Googhegan[31]等用金溶胶固定化生物分子,结果发现固定化的生物分子仍然能保持活性。使用金纳米颗粒固定化GOD,固定化酶能保持较高的活性。1994年,Crumbliss等[32]报道了对此研究进行了报道。2002年,孟宪伟等[33]使用小于10nm金颗粒对GOD进行固定化研究,并应用于检测葡萄糖的电极。经过研究表明,使用金纳米颗粒固定化GOD制成的电极可以显著其响应灵敏度,金纳米颗粒可以作为电极表面与GOD分子间的电子传递媒质,改善电极的电子传递过程。

1.5.1.5 海藻酸钙凝胶

肖志方等[34]使用海藻酸钠和氯化钙的混合物固定化GOD,确定了固定化条件,操作简便易行,反应条件温和。固定化酶的平均酶活回收率达到61.69%,储存稳定性也有所提高,而且可重复使用。

1.5.2 国内外固定化GOD技术的研究

国内,早期对于酶的固定化技术研究,主要选择醋酸纤维素膜、壳聚糖膜等来制备固定化酶[35-37],制备开管柱固定化酶反应器等。近年来,固定化技术应用越来越多,酶的固定化技术涉及用高分子材料物理的包埋法[38],导电高分子共聚法[39]和无机凝胶包埋法[40]。有研究者采用丙烯酸的微粒凝胶和三价金来固定GOD,表现出很好的效果,还有报道关于利用戊二醛交联作用把GOD固定在竹子的内膜上[41-43],并取得了一定的成果。目前对于GOD电极的研究最多,最热门,且最具商品价值[44-46],并且不断有新的电子媒介体、新的固定化材料和方法用于葡萄糖安培电极的研究。研究者通过引入了新的电子传递媒介体,如二茂铁及其衍生物、亚铁氰化铜等,来降低检测电极电位。

进入到九十年代,固定化GOD的载体和方法更加丰富,也更加成熟,固定化GOD主要应用于葡萄糖安培电极,用来快速地测定葡萄糖。聚乙烯醇(PVA)具有无毒、廉价、强度高、稳定性好、抗微生物分解能力强等优点,王顺光等[47]利用它作为载体,来固定化GOD,酶活回收率可达40%,但由于其微生物相容性较

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差,还有待进一步研究解决此问题。Liu等[48]用蟹壳甲壳素来固定化GOD,选取蟹壳甲壳素用质量分数2.5%的戊二醛溶液处理3h,然后加入酶溶液,利用戊二醛的交联作用,达到固定化的效果。固定化酶活力保持98%,在40℃时还有70%的活力,而溶液酶在该温度下的活力已经很小,因此用此材料来固定化GOD有很高的应用价值。γ-甲基-谷氨酸-多聚物膜是一种经过合成的高分子材料,它的优点是抗微生物分解性转化、化学稳定性好、机械强度高,Akon[49]采用它为载体来固定GOD。但由于此聚合物网格的形成条件比较剧烈,且成型的多样性和可控性不好,因此要规模使用还是有待于进一步研究。Hsiue等[50]采用γ射线照射的方法,以碳化二亚胺为交联剂将GOD固定在聚丙烯-丙酸混合膜上,制成葡萄糖快速测定传感器,测定葡萄糖200次仅丢失4%的酶活,有很大的实用价值,但这种固定化方法所需要的外部条件比较高。曹国民[51]等用蚕丝作为载体来固定化GOD,过程使用对-β-硫酸酯乙砜茎苯胺(SESA)作为交联活化剂,方法是采用共价法,固定化酶的酶活回收率大于40%,固定化酶使用21天后酶活仍在60%以上。邰宁文等[52]用蛹皮壳聚糖固定化GOD,将壳聚糖制成球状,酶活回收率为25.14%,相对活力为54.50%。虽然酶活回收率不高,但壳聚糖对蛋白质有极高的亲和性,且生物相容性好、无毒、可生物降解,近年来常用于固定化GOD,制成酶电极或传感器[53-57],用于检测葡萄糖的含量。

1999年,中国农业科学院棉花研究所巩万奎等人从黑曲霉中提取出GOD的基因,并将其在棉花中得到高效转化,具有较大的应用价值[58]。山东农业大学园艺学院在番茄中转化了GOD基因[59]。中国科学院武汉病毒研究所周亚凤等人,于2001年把黑曲霉GOD基因提取出来,并在在酵母中得到高效表达[60]。2001年,内蒙古大学生命科学院生物系使GOD基因在抗晚免疫马铃薯中得到表达,并且进行培育,具有较大的实际价值[61]。 2003年,中国科学院植物研究所利用根瘤农杆菌为介导将GOD基因转入水稻中,得到了高效表达[62]。2005年,中国农科院生物技术研究所贾士荣博士把GOD基因转入香蕉并对其枯萎病抗性进行了鉴定[63]。2005年,叶国兴研究员转化GOD基因入小麦中[64]。

国外,早在上世纪八十年代,科学家们就对GOD表现出极高的兴趣,将其领域拓展到基因克隆、重组表达等方面。1980年有科学家将GOD基因克隆到果蝇中,得到高效表达;M Hodgkins,D Mead等人把GOD的基因克隆到汉森酵母中,并得到高效表达[65];1990年H Whittington,EH Park(2000年)及2002年JH Ko等人先后在酵母中表达了GOD[66-68],并用于啤酒的酿造工业中[69];随后2004年A.Szynol又在大肠杆菌中表达了GOD[70]。

近年来,对GOD的研究还在继续升温,其中生物传感器及生物芯片又引起科学家的极大关注,关于葡萄糖传感器的研究不断有新的进展[71-72],如活体测试用的过氧化聚吡啶膜固定GOD针状微电极[73]、普鲁士兰硅酸盐媒介的二氧化硅凝胶

第1章绪论

葡萄糖生物传感器和皮下植入式葡萄糖传感器等[74-76]。

1.6论文立题背景及主要研究内容

1.6.1立题背景

进入二十一世纪,随着葡萄糖酸钠在建筑、医药、化工等方面应用的不断开拓,市场需求量的不断增加,尤其是在建筑行业,伴随着我国城市化进程的加快,作为减水剂和缓凝剂的优势得到充分体现,市场需求量不断扩大。

传统发酵法生产葡萄糖酸钠,产生大量的废菌丝。这些菌丝往往得不到充分利用,或者被当做饲料卖掉,或者直接当废物处理,其中的葡萄糖氧化酶得不到充分利用。本论文立足实验,为了使工厂的废菌丝得到充分利用,将其中的葡萄糖氧化酶提取出来,然后将葡萄糖氧化酶固定化,使用固定化酶生产葡萄糖酸钠。酶法生产葡萄糖酸钠具有不需要菌种,节约能源,简化工艺,操作方便,底物浓度高,底物纯度高,便于提取精制等优点,为生产葡萄糖酸钠提供了一个新思路。

1.6.2主要研究内容

(1)确定从发酵法生产葡萄糖钠的废菌丝中提取葡萄糖氧化酶的条件。

(2)研究固定化葡萄糖氧化酶的制备,包括固定化载体的选择和固定化方法的选择。

(3)选择一种最优固定化载体,研究固定化酶的性质。

(4)研究固定化酶生产葡萄糖酸钠的工艺条件。

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第2章 黑曲霉菌体中葡萄糖氧化酶提取条件的研究2.1引言

发酵法生产葡萄糖酸钠的工厂,每年可以产生大量的废菌丝,这些菌丝往往得不到充分利用。废菌丝中的葡萄糖氧化酶若能提取出来,并选择合适方法将其固定化,就可以将这些废菌丝变废为宝。

本章主要研究葡萄糖氧化酶的提取方法。从产葡萄糖酸钠的废菌丝中提取葡萄糖氧化酶,由于葡萄糖氧化酶是胞内酶,需要先将菌丝破壁,使其中的葡萄糖氧化酶释放出来,而且要采取措施保证酶的活力损失最小。获得到的粗酶液,再经过初步纯化,为后续的固定化做好准备。

2.2实验材料

2.2.1 原料

山东福洋生物科技有限公司的废菌丝。

2.2.2 主要试剂

葡萄糖分析纯山东西王生化科技有限公司磷酸氢二钠分析纯天津市广成化学试剂有限公司磷酸二氢钾分析纯天津市广成化学试剂有限公司氢氧化钠分析纯天津市广成化学试剂有限公司盐酸分析纯莱阳市康德化学有限公司甲基橙分析纯天津市广成化学试剂有限公司酚酞分析纯天津市广成化学试剂有限公司Tris 分析纯上海基星生物科技有限公司氧化乐果分析纯南通润鸿生物化学有限公司钼酸铵分析纯上海胶体化工厂亚硫酸钠分析纯山东淄博桓台大明化工厂对苯二酚分析纯济南凯骏化工有限公司邻苯二甲酸氢钾分析纯天津市广成化学试剂有限公司无水碳酸钠分析纯天津市广成化学试剂有限公司PEG 分析纯浙江东越化工有限公司无水乙醇分析纯莱阳市康德化学有限公司

第2章 黑曲霉菌体中葡萄糖氧化酶提取条件的研究

2.2.3 主要仪器

离心机 TDL-5-A 上海安亭科学仪器厂托盘天平 3924 北京大栅栏天平厂分光光度计 7200 尤尼柯上海仪器有限公司恒温加热器 DJL-100 COD 青岛得加利电子有限公司洁净工作台 SW-59-278 上海博迅实业有限公司恒温振荡器 DHZ-DA 太仓市实验设备厂电子分析天平 MP-200-1 北京赛多利斯仪器系统有限公司可调式电热板 ML-15-4 北京市永光明医疗仪器厂立式压力蒸汽灭菌锅 LDZX-SOKB 上海申安医疗器械厂电热恒温水浴锅 H.H.S 216 江苏常熟医疗器械厂超声波细胞破碎机 JY92-2D 宁波新芝生物科技股份有限公司电热恒温鼓风干燥箱 DHG-9140A 上海精宏实验设备有限公司手提式压力蒸汽灭菌锅 YXQG03 山东新华安得医疗用品有限公司循环水式多用真空泵 SHB-B95A 郑州长城科工贸有限公司

2.3 实验方法

2.3.1 0.5%酚酞指示剂的配制方法

用电子天平准确称取0.5g 酚酞,用乙醇溶解,并稀释至100mL,即得。变色

范围pH8.3~10.0。

2.3.2 0.066mol/LpH5.6的磷酸缓冲液配制方法

称取Na 2HPO 4 0.89g 溶于水中,加入KH 2PO 4 8.4g ,溶于水中,调至pH5.6,

用蒸馏水稀释至1000mL 。

2.3.3 葡萄糖氧化酶酶活力测定方法

取250mL 三角瓶,加入20g/L 葡萄糖溶液25mL ,取稀释酶液1mL ,立即放

在振荡器上于30℃振荡1h ,然后加入0.1 mol/L NaOH 标准溶液20mL 终止反应。混匀后加入酚酞指示剂2滴,用0.1 mol/L HCl 标准溶液滴定剩余的NaOH ,滴定至红色恰好消失为终点,记录所消耗的盐酸体积(V 1)。对照样在加酶之前先加入20mL0.1 mol/L NaOH 标准溶液,不必振荡,其他操作与样品相同,记录对照样所消耗的盐酸体积数(V 2)。

酶活单位定义:在上述反应条件下,1min 催化葡萄糖氧化,生成1μmol 葡萄

糖酸所需的酶量为一个酶活力单位。

葡萄糖氧化酶酶活力(u/g )=n c V V ××

××?60

11000)(12 (2.1)

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式中V2—空白消耗HCl标准溶液体积(mL);

V1—样品消耗HCl标准溶液体积(mL);

c—HCl标准溶液浓度(mol/L);

n—酶液稀释倍数;

60—反应60min,以1min计;

1000—由mmol换算为umol。

2.3.4 粗酶液制备方法

取等量菌丝体,采用几种不同的破壁方法,提取胞内葡萄糖氧化酶。采取以下菌丝体破壁的方法:

2.3.4.1 研磨法

在研钵中加入定量黑曲霉菌丝体,加入1:1的石英砂,对黑曲霉菌丝体进行研磨,用0.066mol/LpH5.6的磷酸缓冲液浸提酶,所得提取液即为胞内葡萄糖氧化酶的粗酶液。

2.3.4.2 超声波破碎法

将定量黑曲霉菌丝体放入小烧杯中,按每克菌丝2.5mL的比例,加0.066mol/ LpH5.6的磷酸缓冲液,调整超声功率为100~600W,超声时间5~30min,间歇4 s,工作2s,进行超声破壁。在超声波破壁时,用冰袋保护,防止局部温度过高,使酶失活。

2.3.4.3 温差破碎法

将定量黑曲霉菌丝体放入小烧杯中,按每克菌丝 2.5mL的比例,加0.066mol/LpH5.6的磷酸缓冲液,放置于–20℃冰箱中冰冻,室温融解,反复三次,由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎,从而获得葡萄糖氧化酶粗酶液。

2.3.5 黑曲霉细胞破壁效果检测方法[77]

取0.2 mL 2%氧化乐果溶液、1.6 mL 0.066 mol/ L pH5.6 磷酸缓冲液、0.2 mL 酶液,分别置于10 mL贝塞试管中,再依次加入2 mL钼酸铵溶液,1mL亚硫酸钠溶液,1 mL对苯二酚溶液摇匀,加水至刻度,混匀,40℃条件下反应30min后,用0.02 mol/ L NaOH终止反应,在660nm波长下以蒸馏水为空白测定吸光度A660。

2.3.6 超声波破壁条件的优化

2.3.6.1超声功率的优化

取等量的菌丝体放到小烧杯中,按每克菌丝2.5mL的比例,加0.066mol/LpH5.6的磷酸缓冲液,调整超声时间为20min,间歇4s,工作2s,改变超声功率,分别

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