高效液相色谱思考题试卷及答案

高效液相色谱法的习题和参考答案

思考题与练习题

1.高效液相色谱是如何实现高效、快速、灵敏的？

解：

气相色谱理论和技术上的成就为液相色谱的发展创造条件，从它的高效、高速和高灵敏度得到启发，采用5-10μm微粒固定相以提高柱效，采用高压泵加快液体流动相的流速；设计高灵敏度、死体积小的紫外、荧光等检测器，提高检测灵敏度，克服经典液相色谱的缺点，从而达到高效、快速、灵敏。

2.简述液相色谱中引起色谱峰扩展的主要因素，如何减少谱带扩张，提高柱效？

解：

液相色谱中引起色谱峰扩展的主要因素为涡流扩散、流动相传质、停留流动相传质及柱外效应。

在液相色谱中要减少谱带扩张，提高柱效，要减少填料颗粒直径，减小填料孔穴深度，提高装填的均匀性，采用低黏度溶剂作流动相，流速尽可能低，同时要尽可能采用死体积较小的进样器、检测器、接头和传输管线等。

3.色谱柱A柱长为15cm，载体粒度为5μm。另一B柱长为30cm，载体粒度为10μm。两

柱的柱效相等吗？

解：

∵l=L/dp

∴lA=15/0.0005=30000

lB= 30/0.0010=30000

A柱的折合柱长为30000，B柱的折合柱长也为30000，表明组分在两根柱内从柱入口到出口都经过30000个载体颗粒，两柱的柱效相等。

4.流动相为什么要脱气？常用的脱气方法有拿几种？

解：

流动相中溶解气体存在以下几个方面的害处

（1）气泡进入检测器，引起光吸收或电信号的变化，基线突然跳动，干扰检测；

（2）溶解在溶剂中的气体进入色谱柱时，可能与流动相或固定相发生化学反应；

（3）溶解气体还会引起某些样品的氧化降解，对分离和分析结果带来误差。因此，使用前必须进行脱气处理。

常用的脱气法有以下几种:

（1）加热脱气法；

（2）抽吸脱气法

（3）吹氦脱气法；

（4）超声波振荡脱气法。

5.在液相色谱中。常用作固定相，又可用作键合相基体的物质是

A. 分子筛

B. 硅胶

C. 氧化铝

D. 活性炭

解：

B硅胶

要形成化学键合固定相，所用的基质材料应有某种化学反应活性，在四种固体固定相中只有硅胶含有硅醇基，是能进行键合的活性官能团。

6.在150×Φ2mm硅胶柱流动相为己烷/甲醇（150:2），紫外检测器色谱条件下分离丙烯

酰胺，判断以下组分的出峰次序，为什么？

解：

在给定的色谱条件下，组分B先出峰，组分A后出峰。以硅胶为固定相，己烷/甲醇（150:2）为流动相，该体系为正相色谱，样品的极性A>B，在正相色谱体系极性小的组分先出峰，极性大的组分后出峰，所以出峰次序为B先出，A后出。

7.在硅胶柱上，用甲苯为流动相，某组分的保留时间为30min，如果改用四氯化碳或乙醚

为流动相，试指出选用哪中溶剂能减少该组分的保留时间？为什么？

解：

该体系为正向色谱体系。在该体系中流动相的极性增大保留值减少。流动相甲苯、四氯化碳及乙醚的溶剂强度参数分别是0.29、0.18、0.38，因此选用溶剂强度参数

大于甲苯的乙醚，可缩短该化合物的保留时间。

8.为什么体积排阻色谱中任何组分的分配系数必须符合0≤K≤1？如果K>1说明什么问

题?

解：

因为组分的分配系数为K=Cs/Cm,Cs与Cm分别为组分在固定相和流动相中的浓度,当分子直径大于孔径时,此时Cm=0,∴K=0.当分子直径小于固定相孔径时,组分向空隙内流动相扩散,达到平衡时,一半组分在空隙内,一半组分在空隙外,此时K=1.0,若分子直径介于以上两种极限情况之间,K一定介于0与1之间,可见体积排阻色谱中,任何祖父呢的分配系数为0≤K≤1,如果K>1说明此时的分离方式已不是纯粹的体积排阻色谱,其分离过程受到其他作用力(如吸附)的支配.

9.为了测定邻氨基苯酚中微量杂质苯胺,现有下列固定相:硅胶,ODS键合相,流动相有:水-

甲醇,异丙醚-己烷,应选用哪种固定相,流动相?为什么?

解：

邻氨基苯酚中微量杂质苯胺测定,为了良好分离,应让苯胺先出峰,由于苯胺的极性小于邻氨基苯酚,因此应采用正相色谱法,选用硅胶为固定相,异丙醚-己烷为流动相.

10.在ODS键合相固定相,甲醇-水为流动相时试判断四种苯并二氮杂苯的出现峰顺序.为什

么?

3. 4.

解：

色谱条件为反相键合相色谱体系,在反相色谱体系中极性大的组分k小,首先出峰,按四

种苯并二氮杂苯的结构,出峰顺序为4-3-2-1.

自测题

1.在GC和LC中, 影响柱选择性的不同的因素是

A.固定相的种类；

B. 柱温；

C．流动相

的种类；

D．分配比。

2.在液相色谱中, 范氏方程中的哪一项对柱效能的影响可以忽略不计?

A．涡流扩散项；B．分子扩散项；

C．固定相传质阻力项；D．流动相中的传质阻力。

3.在液相色谱中, 某组分的保留值大小实际反映了哪些部分的分子间作用力？

A．组分与流动相；B．组分与固定相；

C．组分与流动相和固定相；D．组分与组分。

4.在液-固色谱法中, 以硅胶为固定相, 对以下四组分, 最后流出色谱柱的组分可能是

A.苯酚；

B. 苯胺；

C．邻

羟基苯胺；

D．对

羟基苯胺。

5.在液-固色谱法中, 以硅胶为固定相, 对以下四组分, 最后流出色谱柱的组分可能是

A.苯酚；

B. 苯胺；

C．邻

羟基苯胺；

D．对

羟基苯胺。

6.用液相色谱法分离长链饱和烷烃的混合物, 应采用下述哪一种检测器?

A．紫外吸收检测器；B．示差折光检测器；

C．荧光检测器；D．电化学检测器。

7.液－液色谱法中的反相液相色谱法，其固定相、流动相和分离化合物的性质分别为：

A．非极性、极性和非极性；

B．极性、非极性和非极性；

C．极性、非极性和极性；

D．非极性、极性和离子化合物。

8.若在一个 1m 长的色谱柱上测得两组分的分离度为 0.68，若要使它们完全分离，

则柱长 (m) 至少应为：

0.5；

2；

．5；

．9。

9.在液相色谱中，梯度洗脱最宜于分离：

A．几何异构体；

B．沸点相近，官能团相同的试样；

C．沸点相差大的试样；

D．分配比变化范围宽的试样。

10.液－液色谱法中的反相液相色谱法，其固定相、流动相和分离化合物的性质分别为：

B. 极性、非极性和非极

A. 非极性、极性和非极性；

性；

D. 非极性、极性和离子化合

C. 极性、非极性和极性；

物。

正确答案：

1：(C)、2：(B)、3：(C)、4：(D)、5：（D）

6：(B)、7：(A)、8：(C)、9：(D)、10：（A） !

高效液相色谱(HPLC)法测定邻苯二甲酸酯

实验七高效液相色谱(HPLC)法测定邻苯二甲酸酯一.实验目的 1、学习高效液相色谱仪的基本操作方法。 2、了解高效液相色谱仪原理和条件设定方法。 3、了解高效液相色谱法在日常分析中的应用。二.实验原理高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。反之，则称为正相色谱分离系统。反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R）的计算公式为： R＝ 2[t (R2)-t (R1) ] /1.7*(W 1 ＋W 2 ) 式中 t (R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间； t (R1) 为相邻两峰中前一峰的保留时间； W 1及W 2 为此相邻两峰的半峰宽。除另外有规定外，分离度应大于1.5。本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE，常被用作塑料增塑剂。它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。待测物性质见表1。表1色谱柱测试条件如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶液，在不同条件下进行HPLC分离检测。

三.仪器与试剂 1、仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul微量注射器。 2、试剂甲醇（色谱专用），高纯水四.实验步骤 1、色谱条件色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶（C8）柱温：室温流动相：初始为高纯水：30％，甲醇：70％检测器：DAD检测器; 检测波长：220nm；进样体积：100μl定量环，实际注射每次可控制在200μl。 2、待测溶液的配制首先用甲醇做溶剂配制储备液：邻苯二甲酸二甲酯（0.3880g/L），邻苯二甲酸二乙酯（0.2770g/L），邻苯二甲酸二丁酯（0.3776g/L）。然后各取1mL储备液用水和甲醇（20：80）稀释至10mL，作为待测溶液。 3、色谱测定 (1) 按操作规程开启电脑，开启脱气机、泵、检测器等的电源，启动Agilent 1100在线工作软件，设定操作条件。流量为1.000ml/min。 (2) 待仪器稳定后，开始进样。将进样阀柄置于“LOAD”位置，用微量注射器吸取混合物溶液50ul，注入仪器进样口，顺时针方向扳动进样阀至“INJECT”位置，此时显示屏显示进样标志。 (3) 记下各组分色谱峰的保留时间及峰面积及分离比。 (4) 实验完毕，清洗系统及色谱柱。依次用甲醇-水（60：40）、甲醇-水（70：30）……直到纯甲醇作流动相清洗，每次清洗至基线走稳，至少清洗15min。五.实验结果

高效液相色谱仪(HPLC)校正方法

高效液相色谱仪（HPLC）校正方法 0.1输液系统： 0.1.1梯度误差G C不超过±3% 0.1.2泵流量设定值误差 S s＜±2% 0.1.3流量稳定性误差 S R＜±2% 0.2紫外检测器性能 0.2.1基线噪声不超过5×10-4AU，基线漂移不超过5×10-3AU 0.2.2定量测量重复性误差（6次进样）RSD≤1.5% 0.2.3最小检测浓度不超过1×10-7g/ml萘/甲醇溶液 0.2.4可调波长紫外可见光检测器波长示值不超过±2nm(HP1100高效液相色谱仪可由仪器自身完成) 1校正条件 1.1环境温度10-30℃，相对湿度低于65% 1.2校正设备 1.2.1秒表分度值小于0.1 s 1.2.2分析天平最大称量200g,最小分度值0.1mg 1.2.3容量瓶 1.2.4微量注射器 1.3标准物质和试剂 1.3.1HPLC用甲醇、纯水，分析纯的丙酮 1.3.21×10-4g/ml，1×10-7g/ml的萘甲醇溶液 1.3.3紫外波长标准溶液 2校正方法 2.1梯度误差G C的校正 2.1.1进行梯度洗脱程序，A溶剂为水，B溶剂为0.1%丙酮的水溶液，B经5个阶段从0变到100%， 20%—40%—60%—80%—100%，重复测量两次，取平均值，求各段梯度误差Gci，取最大作为仪器梯度误差，公式：Gci=（Li—Lm）/Lm×100% Li：第i段信号值的平均值； Lm ：各段输出信号平均值的平均值可接受标准： -3%≤Gci≤3% 2.2泵流量设定值误差Ss、流量稳定性误差S R的校正 2.2.1将仪器的输液系统、进样器、色谱柱和检测器联接好，以甲醇为流动相，按表一设定流量，待流速稳定后，在流动相排出口用事先清洗称重过的容量瓶收集流动相，同时用秒表计时，准确的收集10-25

实验一高效液相色谱柱效能的评价

高效液相色谱柱效能的评定 1. 实验目的和要求 1.1了解高效液相色谱仪的基本结构。 1.2初步掌握高效液相色谱仪的基本操作方法。 1.3学习高效液相色谱柱效能的评定及分离度的测定方法。 2. 实验原理苯、萘、联苯分子非极性部分的总表面积不同，缔合能力不同，其保留时间也不同。通过计算色谱峰的理论塔板数以及各个化学物质间的分离度评价色谱柱的效能。 3. 实验仪器与试剂 3.1 仪器高效液相色谱仪（带自动进样器，或配置微量进样器）分析天平 3.2 试剂苯、萘、联苯（均为分析纯）甲醇（色谱纯）纯净水 4. 实验步骤 4.1 色谱条件色谱柱：C18，4.6×150mm，5μm 流动相：甲醇-水（80：20，v/v）流速：1mL·min-1 检测波长：254nm 柱温：30℃ 进样量：10μL 4.2 操作步骤分别精密配制含苯、萘、联苯浓度均为约1mg·mL-1的3份对照品溶液各10mL。

● 分别精密吸取上述对照品溶液各2mL 置于10mL 容量瓶中，加流动相稀释，并定容至刻度，摇匀，得到含苯、萘、联苯的混合对照品溶液。 ● 按照上述色谱条件操作，进样，记录色谱图。 ● 计算各色谱峰的理论塔板数及各峰间分离度。 4.3 实验数据处理 ● 记录实验条件，测试各试样后记录苯、萘、联苯的保留时间、峰宽、半峰宽，计算出各物质对应的理论塔板数。根据保留时间与峰宽信息，计算相邻物质对间的分离度。 ● 柱效计算式中：t R 为峰值保留时间（min ），W 1/2为半峰宽（min ），W 为峰宽（min ） ● 式中：t R1和t R2分别为相邻两组分的峰值保留时间（min ） W 1和W 2分别为相邻两组分色谱峰的峰宽（min ） 5. 问题与讨论 2 2 1 2) (54.5)(16W t W t n R R ==

高效液相色谱方法的验证

高效液相色谱方法的验证 ?方法验证的目的 ?方法验证的内容 ?方法验证的项目及测定方法

方法验证的目的目的：证明采用的方法适合相应检测的要求。方法验证是实验室针对特定方法的研究过程，通过设计方案，有步骤、系统地收集、处理实验数据，最终形成文件，以证明所用试验方法准确、灵敏、专属并重现。同一分析方法用于不同的检测项目会有不同的验证要求。

方法验证的内容 ?准确度 ?精密度 ?专属性 ?检测限 ?定量限 ?线性和范围 ?耐用性

准确度定义：方法测定结果与真实值或参考值的接近程度。一般用回收率%表示。 1. 主成分含量测定原料药：对照品或方法比对 2. 制剂、中药：标准加样回收杂质定量测定：加样回收（n 3 9）杂质对照品方法比对回收率 C-A %=′ B 100% 杂质与主成分的相对含量 A:试验供试品中被测成分的量（通常为含量测定量的50%） B: 试验供试品中加入的对照品的量（通常为±20%） C:试验测定值

精密度定义：在规定测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。一般用偏差，相对偏差和相对标准偏差 1. 重复性（n 9） 3 2. 中间精密度 3. 重复性测定：HPLC方法的精密度测试，应从样品制备开始，设计3个浓度，分别平行制备3份，以测定含量计算相对标准偏差；或同一样品平行制备6份供试品，分别进样，以峰面积计算相对标准偏差。同一份供试品连续进样6次，计算得到的相对标准偏差只能表征进样精密度，不能作为方法精密度。

专属性定义：在其它成分可能存在下，方法能正确测定出被测物的特性。 1. 鉴别反应 2. 含量测定杂质测定测定：限量检查空白制剂，模拟复方加速破坏试样测试 DAD峰纯度检查

实验高效液相色谱分离甲苯和乙苯

实验高效液相色谱分离甲苯和乙苯目的和要求 1.熟悉高效液相色谱仪的结构，理解反相HPLC的原理和应用； 2.掌握高效液相色谱法定性分析的原理。基本原理高效液相色谱法（HPLC）是以液体作为流动相的一种色谱分析方法。高效液相色谱采用细颗粒固定相，使流动相在色谱柱上渗透性大大减小，流动阻力增大，必须借助高压泵输送流动相。同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。所以分离最终效果则是热力学与动力学两方面的综合效益。本实验中，采用化合物的保留值进行定性分析。仪器高压泵紫外光度检测器六通进样阀色谱工作站柱温箱试剂甲苯、乙苯均为分析纯甲醇为色谱纯纯水为重蒸水标准溶液的配制配制含甲苯、乙苯为4‰（体积比）的甲醇溶液及混合溶液。实验条件色谱柱：C18 柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm) 流动相：甲醇：水（9：1或8：2，v/v），流量：1.0 ml·min-1 紫外分光检测器：测定波长254 nm

进样量：20μl 实验步骤 1.将配制好的流动相于超声波清洗器上脱气15 min 。 2.根据实验条件，将仪器按照仪器的操作步骤调节至进样状态，待仪器液路和电路系统达到平衡，基线平直时，即可进样。 3.吸取20μl标准溶液进样，记录色谱图，重复进样。数据及处理思考题 1.紫外光度检测器是否适用于检测所有的有机化合物，为什么？ 2.若实验中的色谱峰无法完全分离，应如何改善实验条件？

高效液相色谱法习题

第12章高效液相色谱法习题（一）选择题单选题 1. 在高效液相色谱中影响柱效的主要因素是( ) A 涡流扩散 B 分子扩散 C 传质阻力 D 输液压力 2. 在高效液相色谱中，提高柱效能的有效途径是( ) A 提高流动相流速 B 采用小颗粒固定相 C 提高柱温 D 采用更灵敏的检测器 3. 高效液相色谱法的分离效果比经典液相色谱法高，主要原因是( ) A 流动相种类多 B 操作仪器化 C 采用高效固定相 D 采用高灵敏检测器 4. 在高效液相色谱中，通用型检测器是( ) A 紫外检测器 B 荧光检测器 C 示差折光检测器 D 电导检测器 5. HPLC与GC的比较，可忽略纵向扩散项，这主要是因为( ) A 柱前压力高 B 流速比GC的快 C 流动相黏度较小 D 柱温低 6．液相色谱定量分析时，要求混合物中每一个组分都出峰的是( ) A 外标标准曲线法 B 内标法 C 面积归一化法 D 外标法 7．下述四种方法中最适宜分离异构体的是是( ) A 吸附色谱 B 反离子对色谱 C 亲和色谱 D 空间排阻色谱 8．在液相色谱中，梯度洗脱适用于分离( ) A 异构体 B 沸点相近，官能团相同的化合物 C 沸点相差大的试样 D 极性变化范围宽的试样 9．在HPLC中，范氏方程中对柱效影响可以忽略不计的因素是( ) A 涡流扩散 B 纵向扩散 C 固定相传质阻力 D 流动相传质阻力 10．当用硅胶为基质的填料作固定相时，流动相的pH范围应为( ) A 在中性区域 B 5一8 C 1一14 D 2一8

11．高效液相色谱法中，常用的流动相有水、乙腈、甲醇、正己烷，其极性大小顺序为( ) A 乙腈>水>甲醇>正己烷 B 乙腈>甲醇 >水>正己烷 C 水> 乙腈>甲醇>正己烷 D 水>甲醇> 乙腈>正己烷 12．高效液相色谱法中,使用高压泵主要是由于( ) A 可加快流速，缩短分析时间 B 高压可使分离效率显著提高 C 采用了细粒度固定相所致 D 采用了填充毛细管柱 13．液相色谱的H-u曲线（）。 A 与气相色谱的一样，存在着H min B H随流动相的流速增加而下降 C H随流动相的流速增加而上升 D H受u影响很小 14. 与气相色谱相比，在液相色谱中（）。 A 分子扩散项很小，可忽略不计，速率方程式由两项构成 B 涡流扩散项很小，可忽略不计，速率方程式由两项构成 C 传质阻力项很小，可忽略不计，速率方程式由两项构成 D 速率方程式同样由三项构成，两者相同 15．液相色谱中不影响色谱峰扩展的因素是（）。 A 涡流扩散项 B 分子扩散项 C 传质扩散项 D 柱压效应 16．在液相色谱中，常用作固定相又可用作键合相基体的物质是（）。 A 分子筛 B 硅胶 C 氧化铝 D 活性炭 17．样品中各组分的出柱顺序与流动相的性质无关的色谱是（）。 A 离子交换色谱 B 环糊精色谱 C 亲和色谱 D 凝胶色谱18．高效液相色谱法中，对于极性成分，当增大流动相的极性，可使其保留值（）。 A 不变 B 增大 C 减小 D 不一定 19．在反相色谱法中，若以甲醇-水为流动相，增加甲醇的比例时，组分的容量因子k与保留时间t R的变化为（）。 A k与t R增大 B k与t R减小 C k与t R不变 D k增大，t R减小多选题 20．下列检测器中，不属于高效液相色谱中的检测器是（） A 紫外检测器 B 氢火焰离子化检测器 C 荧光检测器 D 氮磷检测器 E 示差折光检测器 21．化学键合固定相具备下列何种特点（） A 固定液不易流失 B 选择性好 C 不适用于梯度洗脱 D 柱效高 E 易和组分形成氢键吸附

高效液相色谱法测定含量示例的方法再确证

高效液相色谱法测定含量示例的方法再确证作者：张建芝冯顺来源：《维吾尔医药》2013年第07期摘要：目的：确证用反相高效液相色谱法测定头孢氨苄含量的方法有效性和准确性。方法：以Diamonsil CLC-ODS（150mm x 6mm，10 lm）为色谱柱，水-甲醇- 3.89% 醋酸钠溶液- 4% 醋酸溶液（700：300：15：3）为流动相，检测波长为254 nm，外标法定量。结果：头孢氨苄浓度线性范围为0.02～0.20mg / ml，相关系数r= 0.9991，方法重复性试验 RSD为 1.42%。结论：该方法可简单高效地完成，结果准确性好、稳定可靠，确证高效液相色谱依然为头孢氨苄制剂的质量控制中有效可靠的方法。关键词：头孢氨苄高效液相色谱法头孢氨芐（Cefalexin，又译先锋霉素Ⅳ、头孢力新等）是一种半合成的第一代口服头孢霉素类类抗生素药物，化学名（6R，7R）-3-甲基-7-[（R）-2-氨基-2-苯乙酰氨基]-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸，化学式C16H17N3O4S，在临床上广为使用。其含量测定在旧版的中国药典（ 1995年版）采用碘量法○1。但此法不仅操作步骤繁多，费工费时，干扰因素多；然后人们发明采用高效液相色谱法内标法测定的方法，但内标物保留时间过长，依然存在问题。最后人们又发现采用高效液相色谱法，用外标法测定其含量，方法操作简单方便、数据准确可靠，灵敏度较高，重复性好，最终获得了较为满意的结果○2。现在本文对这个方法进行确证，以确定该方法的有效性和准确性。 1.仪器与试药分析天平（precisa instrument ltd switzer land xs 225a precisa ），高效液相色谱柱（diamonsic C18 250 * 46mm），检测器（UVD 170v），泵（P680 HPLC pump），头孢氨苄胶囊（广州白云山制药总厂批号：2110102） 2. 色谱条件用十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂：水-甲醇- 3.89% 醋酸钠溶液 - 4% 醋酸溶液（700：300：15：3）为流动相；检测波长为254nm；理论塔板数按头孢氨苄峰计算不低于1500。 3. 实验试剂制备 3.1 对照品储备液的制备：对照品储备液的制备：取头孢氨苄对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，为对照品储备液。 3.2 供试品溶液的制备：去装量差异项下的内容物，混合均匀，精密量取适量（约相当于头孢氨苄0.1g），置于 100ml 容量瓶里，加流动相适量，充分振摇使溶解，再加流动相稀释至

高效液相色谱质谱联用技术的应用

高效液相色谱质谱联用技术的应用高效液相色谱(HPLC或LC)是以液体溶剂作为流动相的色谱技术，一般在室温下操作，可以直接分析不挥发性化合物、极性化合物和大分子化合物（包括蛋白、多肽、多糖、多聚物等)，分析范围广，而且不需衍生化步骤。质谱是强有力的结构解析工具，能为结构定性提供较多的信息，是理想的色谱检测器，不仅特异，而且具有极高的检测灵敏度。串联质谱（MS/MS）是将一个质量选择的操作接到另一个质量选择的后面，在单极质谱给出化合物相对分子量的信息后，对准分子离子进行多极裂解，进而获得丰富的化合物碎片信息，确认目标化合物，对目标化合物定量等。［1］高效液相色谱一质谱(HPLC—MS)联用技术是近几年来发展起来的一项新的分离分析技术，将HPLC 对复杂样品的高分离能力，与MS具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，在药物分析、环境分析等许多领域得到了广泛的应用。［2］本文着重讲述液相色谱质谱联用仪在药物分析、环境分析上的应用。 1液相色谱质谱联用在药学分析上的应用 1.1LC/MS在药物代谢中的应用 Lee等［3］总结了利用LC／MS鉴定药物代谢产物的方法，主要包括以下几个步骤：测定原形药物的质谱；选择准分子离子、加合离子和主要的碎片离子进行多级质谱分析；选择原形药物的主要中性丢失，测定生物样品的中性丢失谱，图谱中的离子即为原形药物和可能的代谢物的分子离子；选择主要的子离子测定生物样品的母离子谱，所得母离子即为各个代谢物；测定生物样品中所有可能代谢物的子离子谱，解谱得到代谢物的结构。王宁生等［4］以LC／MS联用技术及标准品对照法，分离检测健康志愿者口服复方丹参滴丸后，血清中水溶性成分及代谢产物，从一级质谱的分子离子峰推测，丹参素及原儿茶醛在体内分别与硫酸及葡萄糖醛酸结合，产生丹参素硫酸结合物及原儿茶醛的葡糖醛酸结合物。 Hsiu SL等［5］研究芍药苷在小鼠体内药代动力学，用LC／MS方法检测体内药物浓度，未检测到芍药苷原形药物；但在血浆及各种排泄物中，均可检测其代谢物，经液相色谱一质谱分析，结合核磁共振(NMR)，确定其为芍药苷的脱糖基代谢物，提示芍药苷给药后，在肠道经细菌转化为PG后，被吸收进入血液循环中发挥作用。 Chen SJ等［6］用LC／DAD／MS／MS联用技术，对山豆根碱在小鼠体内的代谢进行了研究，用ESI ／MSn技术检测山豆根碱的代谢物，并鉴定其主要代谢物为N一去甲基山豆根碱。 1.2LC/MS在药学浓度上的应用 M．Brolis等［7］采用I-IPLC—DAD—MS法从贯叶金丝桃Hyoericum performm中分离鉴定出槲皮素、异槲皮素、金丝桃苷等成分。 Gerthard Brillgma等［8］采用HPLC—NMR和HPLC—ESI—MS—MS法对Habropetalum dawei进行分析，分离鉴定出dioneopeltine、N-methyldioncophylline、N-methyl-7-epi-dioncophylline、tetralone、(1R，3R)和(1S，3R)-N-formyl-8-hydroxy-6-methoxy-l,3-dimthyltetra-hydroisoquinoline等7个已知化合物，以及5’-O-methydioncopeltine、isoquinoline phylline 2个新化合物。徐智秀等［9］以反相高效液相色谱法分离了9种人参皂苷（I）, 利用三级四级杆质谱研究了9种I的一级质谱（主要给出相对分子质量信息）和二级质谱（提供碎片结构信息），通过它们的质谱图差异对其进行了鉴别, 并将方法用于实际样品中的9种I的定性。郭继芬等［10］选用Discovery C18柱，以甲醇-水-甲酸(40:60:0.025)为流动相，经紫外检测后，在ESI- 扫描方式下，对HPLC—UV图谱中各色谱峰进行一级和二级质谱分析，与对照品比较鉴定了提取物中4个已知的黄酮类化合物，推断出3个未知黄酮苷类化合物可能的结构。 2液相色谱质谱联用在环境分析上的应用 1

高效液相色谱法测定甲硝唑的含量

实验二高效液相色谱法测定甲硝唑的含量一、实验目的 1.熟悉高效液相色谱仪主要结构组成及功能。 2.了解反相色谱法的原理、优点和应用。 3.了解流动相的选择依据及配制方法。 4.掌握高效液相色谱法进行定性和定量分析的基本方法。二、实验原理高效液相色谱法是采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并依次进入检测器，由数据处理系统记录色谱信号。本实验以甲硝唑为测定对象，以反相HPLC来分离检测未知样中甲硝唑的含量。以甲硝唑标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度进行线性回归，再根据样品中甲硝唑的峰面积，由线性方程计算其浓度。三、实验内容（一）实验仪器与材料 1.实验仪器：高效液相色谱仪、精密天平、50mL烧杯、玻璃棒、称量纸、10mL容量瓶、50mL 容量瓶、注射器、洗瓶。 2.实验材料：甲硝唑原料、蒸馏水、HCl（0.1mol/L）、乙腈、三氟乙酸、超纯水。（二）实验内容 1、色谱操作条件的制定：色谱柱：C18柱（250×4.6mm,5μm）；流动相：乙腈：0.02%三氟乙酸水溶液（20：80）流速：1mL/min 检测波长：277nm 柱温：35℃ 进样量：20μL 2、标准溶液配制精密称取在105℃条件下干燥至恒重的甲硝唑对照品10mg，置于50mL容量瓶中，用0.1mol/L的HCl溶液溶解并定容至刻度，即得浓度为0.2mg/mL的甲硝唑标准储备液，备用。 3、标准曲线的建立（1）精密量取甲硝唑标准储备液分别为0.3mL、0.5 mL、0.7 mL、0.9 mL、1.1 mL置于10 mL的容量瓶中，然后用0.1mol/L的HCl溶液定容至刻度，得到浓度梯度为6μg/mL、10μg/mL、14μg/mL、18μg/mL和22μg/mL的标准溶液，分别过0.22μm的微孔滤膜过滤，滤

高效液相色谱法测定手册

高效液相色谱法测定手册一目的：制定高效液相色谱法，规范高效液相色谱法的测定操作。二适用范围：适用于高效液相色谱法的测定。三责任者：品控部。四正文 1 简述高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液，作为流动相，用泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高，分析速度快的特点。高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需在色谱分离前或后经过衍生化反应方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱；离子交换填料，用于离子交换色谱；具一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。高效液相色谱仪基本由泵，进样器，色谱柱，检测器和色谱数据处理系统组成。检测器最常用的为可变波长紫外可见光检测器，其他检测器有如示差折光检测器和蒸发光散射检测器等。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。 2 高效液相色谱仪的使用要求 2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程（JJG705—90）”的规定作定期检定，应符合规定。 2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。

高效液相色谱测定法标准操作规程

标准操作规程 1目的：建立高效液相色谱测定法操作规程，以使检验操作规化。 2适用围：适用于高效液相色谱测定法检验操作全过程。 3责任：QC人员对本SOP实施负责。 4容高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入色谱柱，各组分在柱被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。 4.1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。色谱柱径一般为3.9~4.6mm，填充剂粒径为3~10μm。超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。 4.1.1.色谱柱反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。色谱柱的径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分

离物质的性质来选择合适的色谱柱。温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在 2?8之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH 值小于2或大于8 的流动相。 4.1.2.检测器最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与被测物质的量有关，还与其结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用检测器，对所有物质均有响应。结构相似的物质在蒸发光散射检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一定围呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转换。不同的检测器，对流动相的要求不同。紫外-可见分光检测器所用流动相应符合紫外-可见分光光度法（通则0401）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相。 4.1.3.流动相反相色谱系统的流动相常用甲醇-水系统和乙腈-水系统，用紫外末端波长检测时，宜选用乙腈-水系统。流动相中应尽可能不用缓冲盐，如需用时，应尽可能使用低浓度缓冲盐。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动相中有机溶剂一般不低于5％，否则易导致柱效下降、色谱系统不稳定。正相色谱系统的流动相常用两种或两种以上的有机溶剂，如二氯甲烷和正己烷等。品种正文项下规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等，均可适当改变，以达到系统适用性试验的要求。调整流动相组分比例时，当小比例组分的百分比例X小于等于33%时，允许改变围为0.7X?1.3X；当X大于33%时，允许改变围为X—10%?X+10% 。

反相制备型高效液相色谱法分离纯化过程中的共性问题

成也萧何，败也萧何？！ ——反相制备型高效液相色谱法分离纯化过程中的共性问题内容概览：本文拟通过一个具体实例来介绍制备型高效液相色谱法的特点、影响制备型高效液相色谱分离纯化的因素，及其在合成药物、中药化学对照品研究中的实际应用，并对制备HPLC分离纯化过程中的共性问题做了总结并提出解决方案。实际应用：某合成药物最终产品的纯化，对其纯度的要求——HPLC-UV法，210 nm & 254 nm 下，以峰面积归一化法，≥98.0%，同时需提供MS、NMR数据。具体问题：某特定化合物系强极性有机小分子，极性大、难挥发，采用硅胶柱层析不易提纯，需用其他分离技术来纯化。解决方法：终极目的是提纯该物质。总体策略——“先看，后想，再行动”——“看化学结构，想理化性质，定纯化方法”。由于该化合物及相关杂质的理化性质决定了难以用常规的重结晶、蒸馏（精馏）、硅胶柱层析来分离纯化。结合实验室的具体条件，考虑采用反相制备型高效液相色谱法（Preparative HPLC）来分离纯化之。方法步骤：1.了解样品及有关组分的情况→2.样品预处理→3.建立Analytical HPLC Method→4.优化Preparative HPLC条件→5.检查出现的问题→6.回收纯化的物质。更细致地来讲，开始Preparative HPLC之前须明白：待分离样品及有关组分的信息——所含化合物的结构信息（重点关注酸、碱性等极性基团）、UV光谱图（涉及到后续试验检测波长设定）、分子量（分离后目标化合物LC-MS检测确认）、待分离体系的复杂程度（所含化合物的数目，preparative HPLC之前是否须经flash column粗分）；样品预处理——最主要的是样品的溶解度（将尽量多的样品溶于体积相对较小的溶液中）以及待分离体系里是否含强酸、强碱性物质（潜在的“柱杀手”），样品溶液是否需要中和等；建立Analytical HPLC Method——这一步，跟平常的HPLC相似，重点关注待分离的目标化合物，使该物质与其前、后组分分离得尽量相隔远些（起码得基线分离，利于后续制备时放大），

高效液相色谱法测定有机化合物的含量

实验四高效液相色谱法测定有机化合物的含量 [目的要求] 1、了解仪器各部分的构造及功能。 2、掌握样品、流动相的处理，仪器维护等基本知识。 3、学会简单样品的分析操作过程。 [基本原理] 高效液相色谱仪液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的主色谱分离技术，在基本理论方面与气相色谱没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质差别。与气相色谱相比，高效液相色谱对样品的适用性强，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，可以弥补气相色谱法的不足。液相色谱根据固定向的性质可分为吸附色谱、键合相色谱、离子交换色谱和大小排阻色谱。其中反相键合相色谱应用最广，键合相色谱法是将类似于气相色谱中固定液的液体通过化学反应键合到硅胶表面，从而形成固定相。若采用极性键合相、非极性流动相，则称为正相色谱；采用非极性键合相，极性流动相，则称为反相色谱。这种分离的保留值大小，主要决定于组分分子与键合固定液分子间作用力的大小。反相键合相色谱采用醇-水或腈-水体系作为流动相，纯水廉价易得，紫外吸收小，在纯水中添加各种物质可改变流动相选择性。使用最广泛的反相键合相是十八烷基键合相，即让十八烷基（C18H37―）键合到硅胶表面，这也就是我们通常所说的碳十八柱。 [仪器试剂] 高效液相色谱仪（包括储液器、高压泵、自动进样器、色谱柱、柱温箱、检测器、工作站）、过滤装置待测样品（浓度约100 ppm）、甲醇、二次水 [实验步骤] 1、仪器使用前的准备工作（1）样品与流动相的处理配好的溶液需要用0.45 μm的一次性过滤膜过滤。纯有机相或含一定比便例有机相的就要用有机系的滤膜，水相或缓冲盐的就要用水系滤膜。水、甲醇等过滤后即可使用；水放置一天以上需重新过滤或换新鲜的水。含稳定剂的流动相需经过特殊处理，或使用色谱纯的流动相。（2）更换泵头里清洗瓶中的清洗液流动相不同，清洗液也不同，如果流动相为甲醇-水体系，可以用50%的甲醇；如果流动相含有电解质，通常用95%去离子水甚至高纯水。如果仪器经常使用建议每周更换两次，如果仪器很少使用则每次使用前必须更换。（3）更换托盘里洗针瓶中的洗液洗液一般为：50%的甲醇。

高效液相色谱速率理论

高效液相色谱速率理论 1956年荷兰学者van Deemter 等在研究气液色谱时，提出了色谱过程动力学理论— 速率理论。他们吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素。该理论模型对气相、液相色谱都适用。式中：u 为流动相的线速度； A ， B ， C 为常数，分别代表涡流扩散项、分子扩散系数、传质阻力系数。该式从动力学角度很好地解释了影响板高（柱效）的各种因素！任何减少方程右边三项数值的方法，都可降低 H ，从而提高柱效。 1、涡流扩散项A 在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似“ 涡流” 的流动，故称涡流扩散。 Cu u B A H ++=

从图中可见，因填充物颗粒大小及填充的不均匀性，同一组分运行路线长短不同，流出时间不同，峰形展宽。 A ＝2 λdp dp：填充物平均颗粒的直径 ; λ：填充不均匀性因子展宽程度以A表示固定相颗粒越小 ( dp↓) ，填充的越均匀，A↓，H↓，柱效n↑。则由涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。对于空心毛细管柱，无涡流扩散，即A=0。 2、分子扩散项B /u（纵向扩散项）纵向扩散是由浓度梯度造成的。

组分从柱口加入，其浓度分布的构型呈“塞子”状，如图所示。它随着流动相向前推进，由于存在浓度梯度，“塞子”必然自发地向前和向后扩散，造成谱带展宽。分子扩散项系数为： B=2γD g B：分子扩散项系数 γ：阻碍因子（扩散阻止系数） , 因载体填充在柱内而引起气体扩散路径弯曲的因素 - 弯曲因子 D ：组分在流动相中扩散系数 3、传质阻力项C u 由于气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，它们的传质过程不完全相同，现分别讨论之。（l）对于气液色谱，传质阻力系数C包括气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数Cl两项，即： C＝Cg＋Cl 气相传质过程是指试样组分从气相移动到固定相表面的过程。这一过程中试样组分将在两相间进行质量交换，即进行浓度分配。有的分子还来不及进入两相界面，就被气相带走；有的则进人两相界面又来不及返回气相。这样，使得试样在两相界面上

游离色氨酸的测定(高效液相色谱测定方法)

八．饮料中游离色氨酸的测定(高效液相色谱测定方法) 本方法适合饮料中游离色氨酸的测定本方法检测限：饮料中游离色氨酸为30μg/100ml。（一）方法提要试样的游离色氨酸经处理后，在高效反相色谱C18柱上分离，紫外检测器或二极管阵列检测器检测，外标法定量游离色氨酸的含量。（二）仪器 1. 高效液相色谱仪带紫外检测器或二极管阵列检测器。 2. 超声清洗仪（溶剂脱气用）。 3. 天平（精确到0.0001g）。 4. 微孔滤膜（HF 0.45 μm）。（三）试剂 1. 1.0mol/L氢氧化钠溶液：称取4.0g氢氧化钠（分析纯），加适量去离子水并稀释到100ml。 2. 甲醇（色谱纯）。 3. 0.1%(m/V)磷酸溶液：1.0g磷酸（分析纯）加水至1000mL，溶解混匀，过微孔滤膜0.45μm，待用。 4. 色氨酸对照品，Fluka公司(纯度≥99.5%)。 5. 色氨酸标准溶液：精密称取色氨酸对照品约0.0300g，移入100ml容量瓶中，加入少许水，再加入50μL1.0mol/L氢氧化钠溶液，超声溶解并用水定容到100mL，成浓度为300μg/mL的标准储备液。取标准储备液5.0mL用去离子水定容到50mL，成为浓度为30μg/mL的标准溶液。（四）测定步骤 1. 样品处理： ①汽水、可乐型饮料：取均匀试样置于小烧杯中，微温除去二氧化碳（或超声脱气10min），经0.45μm微孔滤膜过滤后供进样用。 ②果汁类：取均匀试样置于离心管中，5000rpm/min离心20min，上清液经0.45μm微孔滤膜过滤后供进样用。 2. 标准工作曲线制作。精密吸取色氨酸标准溶液1.0，5.0，10.0ml，分别置于100mL容量瓶中，用水定容到100mL，摇匀。分别取10μL标准工作系列溶液进样

高效液相色谱习题及答案 (2)

高效液相色谱法习题一、思考题 1．从分离原理、仪器构造及应用范围上简要比较气相色谱及液相色谱的异同点。2．液相色谱中影响色谱峰展宽的因素有哪些与气相色谱相比较, 有哪些主要不同之处 3．在液相色谱中, 提高柱效的途径有哪些其中最有效的途径是什么 4．液相色谱有几种类型 5．液-液分配色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？6．液-固分配色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？ 7．化学键合色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？ 8．离子交换色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？ 9．离子对色谱的保留机理是什么这种类型的色谱在分析应用中,最适宜分离的物质是什么 10．空间排阻色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？ 11．在液-液分配色谱中，为什么可分为正相色谱及反相色谱？ 12．何谓化学键合固定相？它有什么突出的优点？ 13．何谓化学抑制型离子色谱及非抑制型离子色谱？试述它们的基本原理 14．何谓梯度洗提？它与气相色谱中的程序升温有何异同之处？15．高效液相色谱进样技术与气相色谱进样技术有和不同之处？ 16．以液相色谱进行制备有什么优点？二、选择题 1．液相色谱适宜的分析对象是（）。 A 低沸点小分子有机化合物 B 高沸点大分子有机化合物 C 所有有机化合物 D 所有化合物 2．HPLC与GC的比较，可忽略纵向扩散项，这主要是因为（）。 A 柱前压力高 B 流速比GC的快 C 流动相粘度较大 D 柱温低 3．组分在固定相中的质量为MA(g)，在流动相中的质量为MB（g），而该组分在固定相中的浓度为CA（g·mL－1），在流动相中浓度为CB（g·mL－1），则此组分的分配系数是( )。 A mA/m B B mB/mA C CB/CA D CA/CB。 4．液相色谱定量分析时，不要求混合物中每一个组分都出峰的是＿。 A 外标标准曲线法 B 内标法 C 面积归一化法 D 外标法 5．在液相色谱中，为了改善分离的选择性，下列措施（）是有效的？ A 改变流动相种类 B 改变固定相类型 C 增加流速 D 改变填料的粒度 6．在分配色谱法与化学键合相色谱法中，选择不同类别的溶剂（分子间作用力不同），以改善分离度，主要是（）。 A 提高分配系数比 B 容量因子增大 C 保留时间增长 D 色谱柱柱效提高 7．分离结构异构体，在下述四种方法中最适当的选择是（）。 A 吸附色谱 B 反离子对色谱 C 亲和色谱 D 空间排阻色谱 8．分离糖类化合物，选以下的柱子（）最合适。 A ODS柱 B 硅胶柱 C 氨基键合相柱 D 氰基键合相柱 9．在液相色谱中，梯度洗脱适用于分离（）。 A 异构体 B 沸点相近，官能团相同的化合物 C 沸点相差大的试样 D 极性变化范围宽的试样

高效液相色谱质谱联用 HPLC-MS 实验含思考题

液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）的各种模式探索一、实验目的 1、了解LC-MS的主要构造和基本原理； 2、学习LC-MS的基本操作方法； 3、掌握LC-MS的六种操作模式的特点及应用。二、实验原理 1、液质基本原理及模式介绍液相色谱-质谱法（Liquid Chromatography/Mass Spectrometry，LC-MS）将应用范围极广的分离方法——液相色谱法与灵敏、专属、能提供分子量和结构信息的质谱法结合起来，必然成为一种重要的现代分离分析技术。但是，LC是液相分离技术，而MS是在真空条件下工作的方法，因而难以相互匹配。LC-MS经过了约30年的发展，直至采用了大气压离子化技术（Atmospheric pressure ionization，API）之后，才发展成为可常规应用的重要分离分析方法。现在，在生物、医药、化工、农业和环境等各个领域中均得到了广泛的应用，在组合化学、蛋白质组学和代谢组学的研究工作中，LC-MS 已经成为最重要研究方法之一。质谱仪作为整套仪器中最重要的部分，其常规分析模式有全扫描模式（Scan）、选择离子监测模式（SIM）。（一）全扫描模式方式（Scan）：最常用的扫描方式之一，扫描的质量范围覆盖被测化合物的分子离子和碎片离子的质量，得到的是化合物的全谱，可以用来进行谱库检索，一般用于未知化合物的定性分析。实例：（Q1 = 100-259m/z）（二）选择离子监测模式（Selective Ion Monitoring，SIM）：不是连续扫描某一质量范围，而是跳跃式地扫描某几个选定的质量，得到的不是化合物的全谱。主要用于目标化合物检测和复杂混合物中杂质的定量分析。实例：（Q1 = 259m/z）本实验采用三重四极杆质谱仪（Q1：质量分析器；Q2：碰撞活化室；Q3：

高效液相色谱技术(HPLC)

140 7 高效液相色谱技术（HPLC ）高效液相色谱（HPLC ：High Performance Liquid Chromatography ）是化学、生物化学与分子生物学、医药学、农业、环保、商检、药检、法检等学科领域与专业最为重要的分离分析技术，是分析化学家、生物化学家等用以解决他们面临的各种实际分离分析课题必不可缺少的工具。国际市场调查表明，高效液相色谱仪在分析仪器销售市场中占有最大的份额，增长速度最快。高效液相色谱的优点是：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精度高，应用范围广。适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物。其缺点是：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大分子和无机离子困难，流动相消耗大且有毒性的居多。目前的发展趋势是向生物化学和药物分析及制备型倾斜。 7.1 基本原理固定相流动相 A B C C B A 固定相 —— 柱内填料，流动相 —— 洗脱剂。 HPLC 是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达到分离的过程。通常，按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质可以作如下的分类：分配色谱：—— 分配系数亲和色谱：—— 亲和力吸附色谱：—— 吸附力离子交换色谱：—— 离子交换能力凝胶色谱（体积排阻色谱）：—— 分子大小而引起的体积排阻分配色谱又可分为：

正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。用的最多，约占60～70％。固定相（柱填料）：固定相又分为两类，一类是使用最多的微粒硅胶，另一类是使用较少的高分子微球。后者的优点是强度大、化学惰性，使用pH范围大，pH=1～14，缺点是柱效较小，常用于离子交换色谱和凝胶色谱。最常使用的全孔微粒硅胶（3～10μm）是化学键合相硅胶，这种固定相要占所有柱填料的80％。它是通过化学反应把某种适当的化学官能团（例如各种有机硅烷），键合到硅胶表面上，取代了羟基（－OH）而成。它是近代高效液相色谱技术中最重要的柱填料类型。使用微粒硅胶要特别注意它的使用pH范围是2～7.5，若过碱（＞pH7.5），硅胶会粉碎或溶解；若过酸（＜pH2），键合相的化学键会断裂。键合相使用硅胶作基质的优点是：①硅胶的强度大；②微粒硅胶的了孔结构和表面积易人为控制。③化学稳定性好。硅胶( SiO2?n H2O) ：OH OH —Si—O—Si— 重要的键合相是：硅烷化键合相，它是硅胶与有机硅烷反应的产物。最常用的键合相键型是： —Si—O—Si—C R1R1 —Si—OH + X—Si—R —Si—O—Si—R + HX R2R2 硅胶有机硅烷键合相 X ━Cl，CH3O，C2H5O等。 R ━烷：C8H17（即C8填料），C10H21，C18H37等。 R1、R2 ━X、CH3等。最常用的“万能柱”填料为“C18”，简称“ODS”柱，即十八烷基硅烷键合硅胶填料（Octadecylsilyl，简称ODS）。这种填料在反相色谱中发挥着极为重要的作用，它可完成高效液相色谱70～80％的分析任务。由于C18(ODS)是长链烷基键合相，有较高的碳含量和更好的疏水性，对各种类型的生物大分子有更强的适应能力，因此在生物化学分析工作中应用的最为广泛，近年来，为适应氨基酸、小肽等生物分子的分析任务，又发展了 141