淀粉酶活力的测定

淀粉酶活力的测定
测定淀粉酶活力的方法有4类，一是测定底物淀粉的消耗量，有粘度法、浊度法和碘-淀粉比色法等；二为生糖法，测定产物葡萄糖的生成量；三为色原底物分解法，四是酶偶联法。其中碘-淀粉比色法测淀粉酶活力操作简便迅速、实用。
2.1 原理
碘-淀粉比色法淀粉经α-淀粉酶催化水解，生成产物为葡萄糖、麦芽糖及糊精，在底物淀粉浓度已知且过量的条件下，反应后加入碘液与末被催化水解的淀粉结合成蓝色复合物。其蓝色的深浅与未经酶促反应的空白管比较成比例，从而计算出淀粉的量，推算肘淀粉酶活力。
2.2 试剂
2.21 底物缓冲液
精确称，取9.0g；氯化钠；22。6g无水磷酸二钠和12.5g无水磷酸二氢钾，置于约500mL去离子水中力口热至沸腾溶解。称取0.4g可溶性淀粉于一小烧杯中，加入10mL去离子水，使其混悬后加人上述沸腾溶液中，冷却至室温后加入5mL37%甲醛溶液，用去离子水稀释至1000mL。此即为pH7.0、酶底物淀粉浓度为0.4g/L的缓冲液。
2.2.2 碘贮存液(0.1mol/L)
称取1.7835g碘酸钾和22.5g碘化钾，溶于去离子水中，再缓慢加人4.5mL浓盐酸，用去离子水稀释至500mL，充分混匀，贮棕色瓶中，每月配制新鲜溶液，置冰箱中保存。
2.2.3 碘稀释液(0.lmol/L) 取碘贮备液用去离子水稀释10倍，贮棕色瓶中，现用现配。
2.3 操作步骤
称取酶粉1.0g充分碾细，加去离子水100mL,在40℃水中搅拌30min，充分溶出酶蛋白，过滤，滤液备用。按表2分别加入底物缓冲液、酶滤液、碘稀释液和去离子水，混匀，于660nm波长处(lcm光径)，以去离子水调吸光度为零，读各管吸光度。
试剂用量
加入物 测定管（Ｕ）（３支平行样）空白管（Ｂ）
底物缓冲液(40℃预温５min,mL) 1.0 1.0
酶滤液（mL）混匀，40℃水浴7.5min 0.2 -
碘稀释液（mL） 1.0 1.0
去离子水（mL） 6.0 6.2
2.4 淀粉酶活力计算
淀粉酶活力= 式中:AB:空白管吸光度；AU:测试管吸光度；淀粉酶活性定义:lmL酶滤液中(1g酶粉)的酶，在40℃和底物淀粉作用30min，水解10mg淀粉为1个淀粉酶活性单位。