转铁蛋白受体及其在药物运输中的作用

文章编号:1000-1336(2004)06-0468-02

转铁蛋白受体及其在药物运输中的作用

赵莉霞 颜 冰 黄培堂

(军事医学科学院生物工程研究所,北京100071)

摘要:血脑屏障的存在阻止了中枢神经系统疾病许多潜在治疗药物的通过。近年来主要利用脑毛细血管内皮细胞膜中的转运蛋白,如转铁蛋白受体、胰岛素受体等,将外源药物与这些受体的特异性抗体相连,通过受体介导的内吞作用将药物转运到脑组织中。转铁蛋白受体在抗癌药物定向运输及恶性肿瘤细胞基因治疗中的研究已经处于临床阶段。

关键词:转铁蛋白受体;功能;表达调控;药物运输中图分类号:Q78

收稿日期:2004-09-07

国家自然科学基金项目(No.30300102)和北京市自然科学基金项目(No.5042022)

作者简介:赵莉霞(1978)),女,博士生;颜冰(1972)),女,博士,助理研究员,联系作者,E -mail:yanbi ng72@https://www.360docs.net/doc/9c5890647.html,

铁是人体必需的营养元素,在氧化还原作用中,许多蛋白质需要铁离子作为辅助因子。在体内,Fe 3+是不可溶的,而Fe 2+具有毒性[1,2]。组织细胞摄取铁是依靠细胞表面表达的转铁蛋白受体与转铁蛋白的特异性结合完成的。Fe 3+

与转铁蛋白结合后,溶解度增加,与细胞膜上的转铁蛋白受体结合,通过受体介导的内吞作用进入细胞。目前已发现有两种转铁蛋白受体:TfR1和TfR2。两者均为ò型跨膜糖蛋白,都能与转铁蛋白结合并介导铁的吸收。TfR1与含铁转铁蛋白的亲合力比TfR2高约25倍

[3]

。TfR1被证实在增殖的细胞和多种肿瘤细胞

中显著增加,其功能除与铁离子的转运有关外,还与

细胞活化、增殖、分化和肿瘤细胞恶变存在着密切关系。TfR2主要存在于肝脏和红细胞,其含量少,具体功能不十分清楚。本文仅就TfR1的性质、功能和在药物运输中的作用进行一些介绍。1.转铁蛋白受体的功能及表达调控

转铁蛋白受体是一种跨膜糖蛋白,由两个亚基组成同源二聚体,每个亚基有760个氨基酸,亚基间通过89位和98位的半胱氨酸形成的二硫键相连。转铁蛋白受体的功能是通过与转铁蛋白的相互作用介导铁的吸收

[4]

。生理pH 下,转铁蛋白受体与带

两个铁离子的转铁蛋白亲和力最高,与带一个铁离子的亲和力次之,与不带铁离子的亲和力最小。转铁蛋白受体表达被认为是转录后水平的调节。铁在

mRNA 稳定水平上调控着转铁蛋白受体的表达,而mRNA 的稳定性则是通过铁调节蛋白与铁反应元件特异性结合来调节的。组织细胞内铁的含量是影响转铁蛋白mRNA 翻译和转铁蛋白受体mRNA 稳定的关键因素。当细胞内缺铁时

[5,6]

,铁应答元件与铁

调节蛋白亲和力提高,转铁蛋白受体mRNA 3c 端的铁应答元件与铁调节蛋白结合,抑制转铁蛋白受体mRNA 的降解,增加转铁蛋白受体mRNA 的稳定性,使转铁蛋白受体表达升高,从而增加细胞对铁的摄取;转铁蛋白mRNA 5c 端的铁应答元件与铁调节蛋白结合,阻止了43S 翻译起始前复合物的形成,抑制转铁蛋白的翻译。相反,当细胞内铁过剩时,铁应答元件与铁调节蛋白的亲和力下降,转铁蛋白受体mRNA 降解,而转铁蛋白mRNA 得以翻译,从而增加铁在细胞内的储存。

2.转铁蛋白受体在脑药物转运中的作用

在生理状态下,转铁蛋白在血浆中浓度很高,约为25L mol/L [7],此浓度对于转铁蛋白受体而言几乎是饱和的,因此转铁蛋白作为药物转运载体受到限制。如果用抗转铁蛋白受体的抗体则可进行药物转运。因为抗体与转铁蛋白受体的结合位点不同于转铁蛋白与转铁蛋白受体的结合位点,彼此之间不相互干扰。

对于所有试图开发用于中枢神经系统疾病治疗药物的研究人员来说,血脑屏障被证明是一个最大的障碍。血脑屏障是存在于血液和脑组织之间的一层屏障系统,由毛细血管内皮细胞、星形细胞、神经胶质细胞和基膜组成,其中相互间紧密连接的毛细血管内皮细胞是血脑屏障的基本结构成分。与其他组织器官内皮细胞间有较大的孔隙不同,脑毛细血

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管内皮细胞排列紧密,缺少跨膜转运的质膜小泡和细胞孔。正常生理情况下,只允许气体分子和分子量小于500的脂溶性小分子通过。这一特性对维系脑内环境的相对稳定十分重要。屏障的功能象是一个过滤器,防止不受欢迎的物质如毒素和病毒进入大脑;遗憾的是这种功能也阻止了潜在治疗药物的通过。

克服这个药物运送问题的传统药学途径集中于开发小分子药物方面。这在开发如癫痫、慢性疼痛、情绪紊乱和神经分裂症等的治疗药方面取得一定的成功。然而在治疗如阿尔茨海默病、亨廷顿病、卒中和脑癌方面却被证明用处不大。目前临床上大多应用鞘内或脑室穿刺直接给药以绕过血脑屏障,或采用渗透压休克法可逆性打开血脑屏障。这些方法技术要求高、副作用大和易造成颅内感染。当前的研究重点主要是利用脑血管内皮细胞膜中的转运蛋白,如转铁蛋白受体、胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体?和血管紧张素ò受体等,将外源药物与这些受体的特异性抗体相连,通过受体介导的内吞作用将药物转运到脑组织中。抗大鼠转铁蛋白受体的单克隆抗体OX26为脑内药物的转运提供了可行性途径[8]。这一系统成功地将治疗性多肽或蛋白质转运进了大脑。最近的研究表明,脑源性的神经营养因子(B DNF)与OX26结合后,能被运入大脑,为治疗急性中风提供了可能。此外,BDNF对多种神经元具有营养、保护和修复作用,有望在阿尔茨海默病、帕金森病、缺血性脑损伤、神经性耳聋等中枢神经系统疾病的治疗中发挥作用。Pardridge等将OX26-BDNF复合物用于治疗永久性中脑动脉闭塞,以5 L g/鼠和50L g/鼠的剂量静脉注射后,脑梗塞面积分别减少了43%和65%[9]。一系列在鼠体内试验的成功,为人类中枢神经系统疾病的治疗带来了希望。本实验室已经合成了大鼠抗转铁蛋白受体单链抗体基因,并在大肠杆菌中获得可溶性表达。该抗体对脑毛细血管具有较好的靶向作用,可以通过血脑屏障[10]。

3.转铁蛋白受体在肿瘤治疗中的作用

转铁蛋白受体作为肿瘤细胞表面相关抗原成分,受到许多研究者的重视。研究证实,转铁蛋白受体在肿瘤细胞中显著增加[11],正常组织中不表达或甚少表达,且在外周血中不存在,可作为肿瘤抗原标记物和导向诊断治疗的靶标。利用单克隆抗体特异性与转铁蛋白受体结合的特征,抗转铁蛋白受体单克隆抗体能相对特异地抵达癌细胞,从而将所携带的抗癌药物也带入癌肿瘤内,发挥抗癌作用。一般生物导向免疫治疗中存在着三大问题[12]:外周血/拦截0、非特异性吸收和生理性屏障。转铁蛋白受体单克隆抗体作为载体,由于外周血中无转铁蛋白受体,转铁蛋白受体单克隆抗体不会被/拦截0,具有相对特异性;其在体内也很稳定,未出现明显去卤化,很少会被非癌组织摄取;转铁蛋白受体不仅存在于癌细胞膜,也存在于癌细胞质中,因而转铁蛋白受体单克隆抗体不仅可与癌细胞膜结合,而且可穿过细胞膜与细胞质中转铁蛋白受体结合,从而增加细胞膜对化疗药物的通透性,导致细胞膜的破坏而杀伤靶细胞。黄尧生等将转铁蛋白受体单克隆抗体与表阿霉素或卡铂偶联后,动脉插管灌注或栓塞治疗晚期恶性肿瘤,取得满意疗效。

转铁蛋白受体在脑药物转运及肿瘤的治疗中,都是利用其抗体与药物连接,通过转铁蛋白受体介导的内吞途径进入细胞发挥作用的。从而,获得转铁蛋白受体的抗体成为关键。目前由于大容量噬菌体抗体库技术的迅速发展,通过多次电转及引入Loxp/Cre重组系统等方法,使抗体库的库容得到了很大提高,可达1011~1012数量级,多样性也不断增加。不仅有完整的抗体分子,还有抗体功能片段,如ScFv、Fab、Diabody和dsFv等。伴随DNA混编(DNA shuffling)以及易错PCR技术的应用,可使抗体的亲和力得到大大提高,最高可达数百倍。特别是大容量人源抗体库的出现,消除了传统鼠源抗体的免疫原性,为获得转铁蛋白受体特异性、高亲和力的人源抗体奠定了基础。

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