细菌16S扩增详细步骤和注意要点

8F/1492R使用最普遍，效果的确不错；但我们的经验是sgF/sgR（上海生工公司扩16S推荐的引物）效果更好。这2对引物对应的PCR产物都在1.5kb左右。

这对引物也是我们用过的，效果很好。对应的PCR产物约90bp（V6区平均长度80-100bp，一说79bp）。

引物到后，先在迷你离心机上短暂离心，将黏附在管口、管壁、管盖的核苷酸粉末甩到管底，然后在超净台操作（因为16S序列所有细菌里都有，扩增时很容易混入杂菌，因此本实验涉及的每一种试剂、耗材都要非常小心，保证无污染）：按照引物合成单的说明，加入灭菌的TE缓冲液，如果没有，灭菌的双蒸水也行（注意每OD加入量不等于最终加入量，一般引物合成是2OD）。溶解核苷酸粉末后，用枪头吹吸混匀。取5μL溶液转移到另一个灭菌的EP管，加入45μL灭菌的双蒸水，即稀释10倍，此时引物浓度为10μM，也就是工作浓度。最好分装保存，避免多次使用导致反复冻融，造成引物不稳定。

以genomic DNA为模板，最适模板量为0.1-10 ng，多了可能引发非特异性扩增，少了可能扩不出来，所以要先稀释。PCR体系建议25μL，效果远好于50μL。推荐用TAKARA的LA Taq（保真度是普通Taq的6.5倍，扩增效率也较高）或FINNZYMES的Phusion（保真度是普通Taq的50倍，pfu的6倍），以保证16S测序结果可信。

PCR体系：

模板1μL

引物F 0.5μL

引物R 0.5μL

dNTP（10 mM）0.5μL

LA Taq（5U/μL）0.5μL

10×PCR buffer 2.5μL

灭菌水19.5μL

总体积25μL

模板1μL

引物F 0.5μL

引物R 0.5μL

Phusion12.5μL

灭菌水10.5μL

总体积25μL

注意：1、PCR 加样过程要在超净台进行。操作前先开紫外灯30 min ，关闭后再开风机10 min ，再用酒精棉球清洁台面和双手，方可开始操作。

2、一定要做阴性对照（不加模板，其余成分都加）！

3、所用PCR 管、枪头、水均须严格灭菌。

4、加样过程中，每一管管盖开的时间不要太久，加完立刻扣上盖子，再加下一管，避免交叉污染（genomic DNA 浓度通常很高，在空气中容易逸散）。

5、加样在冰盒上操作，加完轻轻吹吸，短暂离心，保证各组分均匀混合。

PCR 程序：

针对全长：

94℃ 4 min

94℃ 30 s

65℃ 40 s 72℃ 90 s

72℃ 10 min

4℃ ∞

针对V6区：

94℃ 4 min

94℃ 30 s

55℃ 30 s

72℃ 10 s

72℃ 5 min

4℃ ∞

注意：Phusion 的扩增效率较LA Taq 低，所以如果Phusion 扩不出，可适当增加3-5个循环数。

电泳检测：

配制1%（16S 全长）或3%（V6区）琼脂糖凝胶——样品PCR 产物和阴性对照PCR 产物各取4μL ，混合0.5μL 6×loading buffer 点样，并点DL2000 Marker （16S 全长）或50 bp ladder Marker （V6区）——1×TAE ，115V ，电泳45-60min ——EB 染色15 min ——紫外凝胶成像仪拍摄电泳照片

正确的结果应该是：1.5kb 单一亮带（16S 全长）或稍小于100bp （V6区）单一亮带，阴性对照无条带。