CCK8法的步骤

CCK8法的步骤
CCK8法的步骤

CCK8法的操作步骤(更多内容请见说明书):

实验一:细胞活性检测

1 、在96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔)。将培养板放在培养箱中预培养(37℃ ,5% CO2)。

2 、向每孔加入10 μL CCK8溶液(注意不要在孔中生成气泡,它们会影响OD值的读数)。

3 、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

4 、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

5 、若暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定,吸光度不会发生变化。

活力计算:

细胞活力*(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)] ×100

A(加药):具有细胞、CCK8溶液和药物溶液的孔的吸光度

A(空白):具有培养基和CCK8溶液而没有细胞的孔的吸光度

A(0加药):具有细胞、CCK8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度

*细胞活力:细胞增殖活力或细胞毒性活力

保存条件:

4 ℃避光保存一年有效,-20 ℃避光保存两年有效。

PCR扩增的原理和操作步骤

PCR 扩增反应的操作 第一节PCR 扩增反应的基本原理 一、聚合酶链式反应(PCR )的基本构成 PCR 是聚合酶链式反应的简称,指在引物指导下由酶催化的对特定模板(克隆或基因组DNA )的扩增反应,是模拟体内DNA 复制过程,在体外特异性扩增DNA 片段的一种技术,在分子生物学中有广泛的应用,包括用于DNA 作图、DNA 测序、分子系统遗传学等。 PCR 基本原理: 是以单链DNA 为模板,4 种dNTP 为底物,在模板3'末端有引物存在的情况下,用酶进行互补链的延伸,多次反复的循环能使微量的模板DNA 得到极大程度的扩增。在微量离心管中,加入与待扩增的DNA 片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA 膜板、四种dNTP 溶液、耐热Taq DNA 聚合酶、Mg 2+等。反应时先将上述溶液加热,使模板DNA 在高温下变性,双链解开为单链状态;然后降低溶液温度,使合成引物在低温下与其靶序列配对,形成部分双链,称为退火;再将温度升至合适温度,在Taq DNA 聚合酶的催化下,以dNTP 为原料,引物沿5'→ 3'方向延伸,形成新的DNA 片段,该片段又可作为下一轮反应的模板,如此重复改变温度,由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期,反复循环,使目的基因得以迅速扩增。因此PCR 循环过程为三部分构成:模板变性、引物退火、热稳定DNA 聚合酶在适当温度下催化DNA 链延伸合成(见图)。 1.模板DNA 的变性 模板DNA加热到90~95 C时,双螺旋结构的氢键断裂,双链解开成为单链,称为DNA的变性,以便它与引物结合,为下轮反应作准备。变性温度与DNA 中G-C 含量有关,G-C 间由三个氢键连接,而A-T 间只有两个氢键相连,所以G-C 含量较高的模板,其解链温度相对要高些。故PCR 中DNA 变性需要的温度和时间与模板DNA 的二级结构的复杂性、G-C 含量高低等均有关。对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜(DMSO),并且在PCR循环中起 始阶段热变性温度可以采用97 C ,时间适当延长,即所谓的热启动。 2.模板DNA 与引物的退火 将反应混合物温度降低至37~65C时,寡核苷酸引物与单链模板杂交,形成DNA模板-引物复 合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。一般要求引物的浓度大大高于模板DNA 的浓度 ,并由于引物的长度显著短于模板的长度, 因此在退火时,引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多,退火时间一般为1?2min。 3.引物的延伸 DNA 模板-引物复合物在Taq DNA 聚合酶的作用下,以dNTP 为反应原料,靶序列为模板, 按碱基配对与半保留复制原理,合成一条与模板DNA 链互补的新链。重复循环变性-退火-延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。在72 C条件下,Taq DNA聚合酶催化的合成速度大约为40?60个碱基/秒。经过一轮“变性-退火-延伸”循环,模板拷贝数增加了一倍。在以后的循环中,新合成的DNA 都可以起模板作用,因此每一轮循环以后, DNA 拷贝数就增加一倍。每完成一个循环需2?4min, —次PCR 经过30?40次循环,约2?3h。扩增初期,扩增的量呈直线上升,但是当引物、模板、聚合酶达到一定比值时,酶的催化反应趋于饱和,便出现所谓的“平台效应”,即靶DNA 产物的浓度不再增加。 PCR 的三个反应步骤反复进行,使DNA 扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y =(1 + X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数,X表示平(Y)均每次的扩增效率,n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%,但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期, 靶序列DNA片段的增加呈指数形式,随着PCR产物的逐渐积累,被扩增的DNA片段不再呈指数

RT-PCR的实验原理与操作步骤

提取组织或细胞中的总RNA以其中的mRN作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCF使测的灵敏性提高了几个数量级,使一些极为微量 RNA羊品分析成为可能。该技术主要用于:分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 (一)反转录酶的选择 1. Moloney 鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶:有强的聚合酶活性,RNA酶H活 性相对较弱。最适作用温度为37 C。 2. 禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶:有强的聚合酶活性和 RNA 酶 H 活性。 最适作用温度为42 C。 3. Thermus thermophilus 、 Thermus flavus 等嗜热微生物的热稳定性反转录 酶:在Mn2存在下,允许高温反转录 RNA,以消除RNA模板的二级结构。 4. MMLV 反转录酶的 RNase H- 突变体:商品名为 SuperScript 和 SuperScript U。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA,这一 特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的 m 模板合成较长 cDNA 。 (二)合成 cDNA 引物的选择 1. 随机六聚体引物:当特定 mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝 其全长序列时,可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长 mRNA 。 用此种方法时,体系中所有RNA分子全部充当了 cDNA第一链模板,PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的 cDNA 中 96%来源 于 rRNA。 2. Oligo(dT) :是一种对 mRNA 特异的方法。因绝大多数真核细胞 mRNA 具有

分子标记的实验原理及操作流程

AFLP分子标记实验 扩增片段长度多态性 Amplified fragment length polymorphism(AFLP 是在随机扩增多态性(RAPD和限制性片段长度多态性(RFLP技术上发展起来的DNA多态性检测技术,具有RFLP技术高重复性和RAPD技术简便快捷的特点,不需象RFLP 分析一样必须制备探针,且与RAPD标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其基因组的序列特征,同时弥补了 RAPD技术重复性差的缺陷。同其他以PCR为基础的标记技术相比,AFLP技术能同时检测到大量的位点和多态性标记。此技术已经成功地用于遗传多样性研究,种质资源鉴定方面的研究,构建遗传图谱等。 其基本原理是:以PCR(聚合酶链式反应为基础,结合了 RFLP、RAPD的分子标记技术。把DNA进行限制性内切酶酶切,然后选择特定的片段进行PCR扩增(在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的’接头”用与接头互补的但3-端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增,只有那些与3-端严格配对的片段才能得到扩增,再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物,用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。 一、实验材料 采用青稞叶片提取总DNA 实验设备 1. 美国贝克曼库尔特CEQ8000毛细管电泳系统, 2. 美国贝克曼库尔特台式冷冻离心机, 3. 美国MJ公司PCR仪,

4. 安玛西亚电泳仪等。 三、实验试剂 1. 试剂:请使用高质量产品,推荐日本东洋坊TOYOBO公司的相关产品 DNA提取试剂盒; EcoRI酶,Msel酶,T4连接酶试剂盒; Taq 酶,dNTP, PCR reactio n buffer; 琼脂糖电泳试剂:琼脂糖,无毒GeneFinder核酸染料替代传统EB染料;超纯水(18.2M ? ? cm 2. 其他实验需要物品 微量移液枪(一套及相应尺寸Tip头,PCR管,冰浴等。 四、实验流程 1、总DNA提取 使用DNA提取试剂盒提取植物基因组DNA,通过紫外分光光度计检测或用标准品跑胶检测。一般来说,100ng的基因组DNA作为反应模板是足够的。 2、EcoR1酶消化(20ul体系/样品 EcoR1 1ul

凯氏定氮仪原理及操作步骤

凯氏定氮仪原理: 蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分解,分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量乘以换算系数,即为蛋白质含量。 1.有机物中的胺根在强热和CuSO4,浓H2SO4 作用下,硝化生成(NH4)2SO4 反应式为: 2NH2+H2S04+2H=(NH4)2S04 (其中CuSO4做催化剂) 2.在凯氏定氮器中与碱作用,通过蒸馏释放出NH3 ,收集于H3BO3 溶液中 反应式为: (NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O 3.用已知浓度的H2SO4(或HCI)标准溶液滴定,根据HCI消耗的量计算出氮的含量,然后乘以相应的换算因子,既得蛋白质的含量反应式为: (NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=(NH4)2SO4+4H3BO3 (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3 凯氏定氮仪操作步骤: (一)消化

1、准备6个凯氏烧瓶,标号。1、 2、3号烧瓶中分别加入适当浓度的蛋白溶液,样品要加到烧瓶底部,切勿沾在瓶口及瓶颈上。再依次加入硫酸钾-硫酸铜接触剂,浓硫酸,30%过氧化氢。4、5、6号烧瓶作为空白对照,用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质,对样品测定进行校正。4、5、6号烧瓶中加入蒸馏水代替样液,其余所加试剂与1、2、3号烧瓶相同。 2、将加好试剂的各烧瓶放置消化架上,接好抽气装置。先用微火加热煮沸,此时烧瓶内物质炭化变黑,并产生大量泡沫,务必注意防止气泡冲出管口。待泡沫消失停止产生后,加大火力,保持瓶内液体微沸,至溶液澄清后,再继续加热使消化液微沸15min。在消化过程中要随时转动烧瓶,以使内壁粘着物质均能流入底部,以保证样品完全消化。消化时放出的气体内含SO2,具有强烈刺激性,因此自始自终应打开抽水泵将气体抽入自来水排出。整个消化过程均应在通风橱中进行。消化完全后,关闭火焰,使烧瓶冷却至室温。 (二)蒸馏和吸收 蒸馏和吸收是在微量凯氏定氮仪内进行的。凯氏定氮蒸馏装置种类甚多,大体上都由蒸气发生、氨的蒸馏和氨的吸收三部分组成。 1、仪器的洗涤 仪器安装前,各部件需经一般方法洗涤干净,所用橡皮管、塞须浸在10%NaOH溶液中,煮约10min,水洗、水煮10min,再水洗数次,然后安装并固定在一只铁架台上。 仪器使用前,微量全部管道都须经水蒸气洗涤,以除去管道

原理及操作步骤

3 实验原理 3.1人工抗原的制备原理(以奥沙普秦为例) 奥沙普秦为小分子物质(分子质量小于500),本身不具有诱导产生抗体的能力,必须设法先将奥沙普秦与载体蛋白质偶联制备出相应的人工完全抗原,这是半抗原免疫分析的关键所在。合成人工抗原的机理为:水溶性的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的羟基与奥沙普秦的羧基在脂溶性缩合剂二环己基碳二亚胺(DCC)的作用下,脱水缩合形成活泼酯化奥沙普秦中间化合物,然后载体蛋白在某一PH值下,一般是大于其等电点,是蛋白质中的氨基暴露出来,从而成为提供伯胺的底物,然后亲核进攻活性中间产物活泼酯化奥沙普秦,从而达到小分子化学物偶联到载体蛋白的目的。 3.2 ELISA技术的原理 ELISA 是以免疫学反应为基础,将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。免疫酶技术是将酶标记在抗体/抗原分子上,形成酶标抗体/酶标抗原,称为酶结合物。该酶结合物的酶在免疫反应后,作用于底物使之呈色,根据颜色的有无和深浅,定位或定量抗原/抗体。ELISA 法是免疫酶技术的一种,其特点是利用聚苯乙烯微量反应板(或球)吸附抗原/抗体,使之固相化,免疫反应和酶促反应都在其中进行。在每次反应后都要反复洗涤,这既保证了反应的定量关系,也避免了末反应的游离抗体/抗原的分离步骤。在ELISA 法中.酶促反应只进行一次,而抗原、抗体的免疫反应可进行一次或数次,即可用二抗(抗抗体)、三抗再次进行免疫反应。 目前常用的几种ELISA 方法有:测定抗体的间接法,测定抗原的双抗体夹心法和测定抗原的竞争法等。 3.3 ELISA竞争抑制法的原理 包被好的抗原与加入的抗原(标准抗原)形成竞争,如果抗体石特异性抗体,它就会与游离的标准抗原结合,而不与板上的检测

流式细胞仪原理及操作步骤

流式细胞仪原理及操作步骤 流式细胞仪(FCM)是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起 来的一种先进仪器,已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的 研究和临床常规工作。其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断, 对淋巴细胞群和亚群进行精确分类,还能分离纯化某一群或亚群细胞。活细胞免疫荧光技术 是用于FCM检测的标本准备,染色后也能在荧光显微镜下进行观察,在某些实验条件下,活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的结果。 (一)原理一 活细胞表面保留有较完整的抗原或受体,先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合,再用荧光标记的第二抗体结合,根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。 (二)操作步骤 制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用 于本法) 用10% FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5X 106?IX 107/ ml 取40卩1细胞悬液加入预先有特异性McAb(5?50卩I) 的小玻璃管或塑料离心管,再加50卩I 1 : 20(用DPBS (或兔抗鼠)荧光标记物,充分振摇 J 4 C 30mi n 用洗涤液洗涤2次,每次加液2ml左右 1000rpmx 5mi n J] 加适量固定液(如为FCM制备标本,一般加入1ml固定液,如制片后在荧光 显微镜下观察,视细胞浓度加入100?500 ^1固定液) FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 (标本在试管中可保存5?7天) (三)试剂和器材 1. 各种特异性单克隆抗体。 2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体,灭活正常兔血清。 3. 10% FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。

分析仪操作原理及其操作方法讲解

分析仪操作及原理 注意: 1、标定前请确认标气背景气、标定气含量,保证通入仪器的是对应的标气。 2、百分含量仪器通入标气后需稳定10分钟以上方可标定,微量仪器需稳定时间更长一 些,待数值稳定以后再进行标定。 CO2红外气体分析仪(AIA1203) 这台仪器为ABB生产EL2020系列型号为Uras26,测量范围0~5~20ppm.vol.CO2,精度为±1% 一、测量原理(红外式) 根据不同组分气体对不同波长的红外线具有选择性吸收的特性而工作的分析仪表。测量这种吸收光谱可判别出气体的种类;测量吸收强度可确定被测气体的浓度。 各种多原子气体(CO,CO2,CH4等)对红外线某一段电磁波的辐射都能具有一定的吸收能力,而且这种吸收能力对波长具有选择性,只有当红外光谱中某一段光谱的频率与物质分子本身的频率一致时,该物质分子才吸收这一段红外光谱的辐射能。我们把能吸收的这一段红外线光谱称为该气体的特征吸收波段。气体吸收了红外线光谱的辐射能后,一部分可转变成热能,使温度升高。红外线光谱的辐射又特别显著,这就能让我们利用各种元件,如热电堆、热敏电阻等去测量红外线辐射能的大小。 二、标定 1、选择校准菜单:menu calibrate manual calibration. 2、用箭头键选择zero gas。 3、接通零点气。操作零点气钢瓶减压阀组件,使输出压力控制在20kpa,将操作面板上 多通阀(5MV)切向“零点气”,打开测量流量计,调整“测量”转子流量计旋钮,使进气量控制在30L/H左右。 4、确认零点气连接上并且零点气浓度值输入后。按ENTER键确认。 5、当测量示值显示稳定,按ENTER键开始校准零点。 6、接受校准结果按ENTER键;不接受校准结果返回步骤6按BACK键;不接受校准结 果返回测量状态按MEAS键。 7、用箭头键选择SPAN GAS(零点标定完成后会自动跳到zero 和span的选择窗口。 8、按4步骤接通量程气。

3D打印工作原理及操作步骤

3D打印工作原理及操作步骤 3D打印机正如其名,是一种能够打印出3D实体的机器。如我们普通的打印机一样,能够在纸面上打印出任意形状的画面。理想的3D打印机能够在3维空间中打印出任意形状的实体模型,能够不受结构工艺限制,直接将零件的3维数据资料打印成实体零件 在传统的机械设计程序上,一个零件需要由设计者设计完成,并绘制好2维图纸(通常是3视图的形式,并且有些细节部位还需要追加详细图)。然后把这个零件的图纸交给机械工艺师,机械工艺师会根据你的零件图纸排列加工制造工序,再然后工人会按照机械工艺师设计安排的工序来制造零件。通常这个流程还不能一次性完成。机械设计者设计的零件可能会有部分结构不容易加工制造,机械工艺师会将信息反馈给机械设计师,机械设计师再修改图纸。而一旦有了3D打印机,整个流程就简化了。设计者设计完成零件后,就可以直接制造。不需要绘制3视图,不需要细节描述的详细图,不需要工艺师的编排工序,不需要工人加班,而且极少有结构工艺限制,只需要3维数据 本文分为两个部分,第一部分将为简要介绍FDM式3D打印机的工作原理,第二部分介绍打印机的硬件和软件操作。 第一部分:FDM式3D打印机原理简介 任何3维物体都可以看成是由一个个面堆叠累积而成的。就像宝塔一样,是由一层一层的楼堆起来的。比如说,一个球形物体,就可以看成是由一个个厚度很小直径不同的圆柱堆在一起形成的。对于任何一个物体,都可以看成是由一个个厚度很小的菱形物体堆起来的。如果引用数学中的概念,那么就是,当这些菱形的厚度趋近于无穷小的时候,这个堆砌起来的实体与目标实体就是完全一致的。遗憾的是,现实中任何物体都是有厚度的。可是我们可以把这个厚度做到很小,小到我们能容忍的误差以下,就够了。FDM式的3D打印机就是利用这个原理,将任意一个三维数据实体,切割成一个个面来分析。那么理论上只要这台打印机能够实现打印出任意形状的面,它就可以打印出任意形状的物体了(不考虑重力对结构的限制因素)。所以FDM式的3D打印机有一个喷嘴,它能够稳定连续的喷出直径一定的塑料(或者其他热融性的材料)。这个喷嘴一般由步进电机来控制移动。就像我们捏牙膏一样,我们一边用力捏牙膏,一边移动牙膏,就可以把牙膏在牙刷上涂一条直线出来。3D打印机的原理就和我们捏牙膏是一模一样的,只是它的运动由3D实体数据来控制,而且喷出来的材料是稳定的,它一边喷一边按照特定的方式移动。这样它就可以打印出特定的形状来了。等热融性的材料冷却下来,这个实体就定形了。那么我们怎么从手头一无所有,到打印出一个实体呢?世界上3d设计软件千奇百怪,我们怎么把自己设计的3维实体做成能够被打印机应用的数据呢?这里一定要感谢世界上的开源组织和标准化组织(通常是行业的龙头老大)。是他们让我们虽然使用不同的软件,但是我们仍然可以用同样的数据来交流。所有的3D模型都可以导出同样格式的数据,比如说stl,x_t,step等等格式。还有控制机床运动的加工语言:G语言。因为这些标准的存在,让我们整个流程可以走得更顺畅。从技术实现角度来看,要实现FDM式3D打印机,就只需要实现以下三个技术: 1、能够将3维数据格式(如:stl,x_t,step)解析成机械加工的G语言。 正如前文所说,这一个步骤实质上就是生成“捏牙膏的方法”。在这个步骤里,3维数据被解析成一层层面,面被解析成一条条线。线被解析成一条条的G代码。这里的解析方法可以有开源社区提供。这里也稍微简介一下G代码:G代码是用来控制机械加工刀具(喷嘴)运动的代码。 2、能够解析G代码的机器。 通过第1个技术手段,我们有G代码。接下来就需要一台能够“读懂”G代码的机器。要

Transwell实验原理与操作步骤.pdf

Transwell实验原理与操作步骤 Trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思,well有小室的意思,可以从字面上理解, 这是一类有通透性的杯状的装置,根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍,可以认为这是一种膜滤器(Membrane filters),也可认为是一种有通透性的支架(permeable supports)。更准确地说,Transwell应该是一种实验技术,这项技术的主要材料是Transwell 小室(Transwell chamber,Transwell insert),其外形为一个可放置在孔板里的小杯子, 不同厂家对Transwell会有不同的命名,而不同型号也可有不同形状,不同大小,根据实验需要,可有不同选择。但无论是何种外形,其关键部分都是一致的,那就是杯子底层的一张 有通透性的膜,而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔,孔径大小有0.1-12.0μm,根据不同需要可用不同材料,一般常用的是聚碳酸酯膜(polycarbonate membrane)。 将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上室内盛装上层培 养液,下室内盛装下层培养液,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内, 由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。当然不同细胞其体积不同,具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验: (1)共培养体系: 小于3.0um孔径条件下,细胞不会迁徙通过,因此,若研究不涉及细胞运动能力,不 需要细胞穿过聚碳酸酯膜,则应选择 3.0μm以下孔径。常用0.4、3.0μm。我们实验室用的是0.4μm。将细胞A种于上室,细胞B种于下室,可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。 (2)趋化性实验: 可用5.0、8.0、12.0μm膜,上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室,计数进入下室的细 胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。 ①细胞B对细胞A的趋化作用:将细胞A种于上室,细胞B种于下室,可以研究细胞 B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。 ②趋化因子对细胞的趋化作用:将细胞种于上室,下室加入某种趋化因子,可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。 (3)肿瘤细胞迁移实验: 常用8.0、12.0μm膜,上室种肿瘤细胞,下室加入FBS或某些特定的趋化因子,肿瘤 细胞会向营养成分高的下室跑,计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。

ELISA方法的基本原理和操作步骤

ELISA方法的基本原理和操作步骤 自己收集整理的 错误在所难免 仅供参考交流 如有错误 请指正!谢谢 ELISA方法的基本原理和操作步骤 基本原理 1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay ELISA)用于IgG定量测定的文章 使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法 这一方法的基本原理是:①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面 并保持其免疫活性 ②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体 这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性 又保留酶的活性 在测定时 把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应 用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开 最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例 加入酶反应的底物后 底物被酶催化变为有色产物 产物的量与标本中受检物质的量直接相关 故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析 由于酶的催化频率很高 故可极大地地放大反应效果 从而使测定方法达到很高的敏感度 方法类型和操作步骤 ELISA可用于测定抗原 也可用于测定抗体 在这种测定方法中有3种必要的试剂:①固相的抗原或抗体 ②酶标记的抗原或抗体 ③酶作用的底物 根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件 可设计出各种不同类型的检测方法

(一)双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法 操作步骤如下: (1)将特异性抗体与固相载体连接 形成固相抗体:洗涤除去未结合的抗体及杂质 (2)加受检标本:使之与固相抗体接触反应一段时间 让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合 形成固相抗原复合物 洗涤除去其他未结合的物质 (3)加酶标抗体:使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合 彻底洗涤未结合的酶标抗体 此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关 (4)加底物:夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物 根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量 根据同样原理 将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物 即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体 (二)双位点一步法 在双抗体夹心法测定抗原时 如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体 则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步(图15-5) 这种双位点一步不但简化了操作 缩短了反应时间 如应用高亲和力 的单克隆抗体 测定的敏感性和特异性也显著提高 单克隆抗体的应用使测定抗原的ELIS 在一步法测定中 应注意钩状效应(hookeffect) 类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象 当标本中待测抗原浓度相当高时

MTT原理方法及操作步骤

MTT原理、步骤、结果分析方法及注意事项 MTT原理 MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide,汉语化学名为 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名:噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶 性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞 中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范 围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗 肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。缺点:由于MTT 经还原所产生的甲瓒产物不溶于水,需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加,也会对实验结果的准确 性产生影响,而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。 MTT 溶液的配制方法 通常,此法中的MTT 浓度为5mg/ml。因此,可以称取MTT 0.5克,溶于100 ml的磷酸缓冲液(PBS)或无酚红的培养基中,用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌,放4℃避光保存即可。在配制和保存的过程中,容器最好用铝箔纸包住。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光,觉得这样比较好。需要注意的是,MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力,但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果 的时候,为了保证实验结果的线性,MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。 MTT一般最好现用现配,过滤后4oC避光保存两周内有效,或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存,避免 反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP 管里,用的时候现配,直接往培养板中加,没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。 MTT有致癌性,用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌,MTT对菌很敏感;往96孔板加时不避光也没有关系,毕竟时间较短,或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉. 配制MTT时用PBS(ph=7.4)溶解。PBS配方:Nacl 8g + Kcl 0.2g + Na2HPO4 1.44g + KH2PO4 0.24g 调pH 7.4,定容1L。 普通MTT法实验步骤: 1:接种细胞:用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板,每孔体积200ul. 2: 培养细胞:同一般培养条件,培养3-5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。 3:呈色:培养3-5天后,每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS配制,pH=7.4)20ul.继续孵育4 h,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO,振荡10min,使结晶物充分融解。 4:比色:选择490nm波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。 药物MTT法实验步骤 贴壁细胞: 1: 收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度 1000- 10000 孔,(边缘孔用无菌PBS填充)。

巴氏染色原理及操作步骤

巴氏染色原理及操作步骤巴氏染色法是脱落细胞染色中最好的染色方法。苏木素染液,细胞核内的染色质主要是去氧核糖核酸(DNA),DNA的双螺旋结构中,两条链上的磷酸基向外,带负电荷,呈酸性,很容易与带正电荷的苏木素精碱性染料以离子或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色,所以细胞核被染成蓝色。分化:苏木素染色之后,用水洗去未结合在细胞上的染液,但是在细胞核中结合过多的染料和细胞浆中吸附的染料必须用分化液1%盐酸酒精脱去,才能保证细胞核和细胞浆染色的分明,把这个过程称为染色的分化作用。因酸能破坏苏木素的醌型结构,使色素与组织解离,分化不可过度。蓝化:分化之后苏木素在酸性条件下处于红色离子状态,在碱性条件下处于蓝色离子状态,而呈蓝色,所以分化之后用水洗去酸而中止分化,再用弱碱性水使苏木精染上的细胞核变呈蓝色,称蓝化作用,一般多用自来水浸洗即可变蓝,也可用温水(50度温水最佳)变蓝。EA50染液的酸碱度对于巴氏染色的成功起着关键作用,EA50染液由伊红、亮绿、等染料配成。伊红、亮绿、橘黄等属于酸性染料,在溶解媒中其发色团是负离子部分,发色团可与蛋白质中带正电的氨基结合,从而是胞浆显蓝色、绿色、橘黄色或红色,但蛋白质所带正负电荷的多少是随溶液的PH值而改变的,在偏碱环境中,蛋白质的羧基游离增多(带负电),在偏酸环境中蛋白质氨基游离增多(带正电),磷钨酸在染色过程中,不但作为媒染剂可增加染料的着色力,同时磷钨酸与碳酸锂还是一对弱酸弱碱,实际上是一对缓冲剂,可中和分化及蓝化时可能留下的少量酸或碱,保证染色达到理想效果,其适用于上皮细胞及间皮组织的标本,是阴道脱落细胞检查中最常用的染色方法,该

凯氏定氮仪原理和操作步骤

凯氏定氮仪原理和操作步骤 1.有机物中的胺根在强热和CuSO4,浓H2SO4作用下,硝化生成(NH4)2SO4 反应式为 2NH2 H2S04 2H=(NH4)2S04(其中CuSO4做催化剂) 2.在凯氏定氮器中与碱作用,通过蒸馏释放出NH3,收集于H3BO3溶液中 反应式为: (NH4)2SO4 2NaOH=2NH3 2H2O Na2SO4 2NH3 4H3BO3=(NH4)2B4O7 5H2O 3.用已知浓度的H2SO4(或HCI)标准溶液滴定,根据HCI消耗的量计算出氮的含量,然后乘以相应的换算因子,既得蛋白质的含量点焊机 反应式为: (NH4)2B4O7 H2SO4 5H2O=(NH4)2SO4 4H3BO3(NH4)2B4O7 2HCl 5H2O=2NH4Cl 4H3BO3 凯氏定氮仪操作步骤:(一)消化1、准备6个凯氏烧瓶,标号。1、2、3号烧瓶中分别加入适当浓度的蛋白溶液1.0mL,样品要加到烧瓶底部,切勿沾在瓶口及瓶颈上。再依次加入硫酸钾-硫酸铜接触剂0.3g,浓硫酸2.0mL,30%过氧化氢1.0mL。4、5、6号烧瓶作为空白对照,用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质,对样品测定进行校正。4、5、6号烧瓶中

加入蒸馏水1.0mL代替样液,其余所加试剂与1、2、3号烧瓶相同。2、将加好试剂的各烧瓶放置消化架上,接好抽气装置。先用微火加热煮沸,此时烧瓶内物质炭化变黑,并产生大量泡沫,务必注意防止气泡冲出管口。待泡沫消失停止产生后,加大火力,保持瓶内液体微沸,至溶液澄清后,再继续加热使消化液微沸15min。在消化过程中要随时转动烧瓶,以使内壁粘着物质均能流入底部,以保证样品完全消化。消化时放出的气体内含SO2,具有强烈刺激性,因此自始自终应打开抽水泵将气体抽入自来水排出。整个消化过程均应在通风橱中进行。消化完全后,关闭火焰,使烧瓶冷却至室温。(二)蒸馏和吸收蒸馏和吸收是在微量凯氏定氮仪内进行的。 凯氏定氮蒸馏装置种类甚多,大体上都由蒸气发生、氨的蒸馏和氨的吸收三部分组成。1、仪器的洗涤仪器安装前,各部件需经一般方法洗涤干净,所用橡皮管、塞须浸在10%NaOH 溶液中,煮约10min,水洗、水煮10min,再水洗数次,然后安装并固定在一只铁架台上。仪器使用前,微量全部管道都须经水蒸气洗涤,以除去管道内可能残留的氨,正在使用的仪器,每次测样前,蒸气洗涤5min即可。较长时间未使用的仪器,重复蒸气洗涤,不得少于三次,并检查仪器是否正常。仔细检查各个连接处,保证不漏气。首先在蒸气发生器中加约2/3体积蒸馏水,加入数滴硫酸使其保持酸性,以避免水中的氨被蒸出而影响结果,并放入少许沸石(或毛细管等),以防爆沸。沿小玻杯壁加入蒸馏水约20mL让水经插管流入反应室,但玻杯内的水不要放光,塞上棒状玻塞,保持水封,防止漏气。蒸气发生后,立即关闭废液排放管上的开关,使蒸气只能进入反应室,导致反应室内的水迅速沸腾,蒸出蒸气由反应室上端口通过定氮球进入冷凝管冷却,在冷凝管下端放置一个锥形瓶接收冷凝水。从定氮球发烫开始计时,连续蒸煮5min,然后移开煤气灯。冲洗完毕,夹紧蒸气发生器与收集器之间的连接橡胶管,由于气体冷却压力降低,反应室内废液自动抽到反应室外壳中,打开废

PCR扩增的原理和操作步骤

PCR扩增反应的操作 第一节PCR扩增反应的基本原理 一、聚合酶链式反应(PCR)的基本构成 PCR是聚合酶链式反应的简称,指在引物指导下由酶催化的对特定模板(克隆或基因组DNA)的扩增反应,是模拟体内DNA复制过程,在体外特异性扩增DNA片段的一种技术,在分子生物学中有广泛的应用,包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。 PCR基本原理: 是以单链DNA为模板,4种dNTP为底物,在模板3’末端有引物存在的情况下,用酶进行互补链的延伸,多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。在微量离心管中,加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。反应时先将上述溶液加热,使模板DNA在高温下变性,双链解开为单链状态;然后降低溶液温度,使合成引物在低温下与其靶序列配对,形成部分双链,称为退火;再将温度升至合适温度,在Taq DNA聚合酶的催化下,以dNTP 为原料,引物沿5’→3’方向延伸,形成新的DNA片段,该片段又可作为下一轮反应的模板,如此重复改变温度,由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期,反复循环,使目的基因得以迅速扩增。因此PCR循环过程为三部分构成:模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成(见图)。 1.模板DNA的变性 模板DNA加热到90~95℃时,双螺旋结构的氢键断裂,双链解开成为单链,称为DNA的变性,以便它与引物结合,为下轮反应作准备。变性温度与DNA中G-C含量有关,G-C间由三个氢键连接,而A-T间只有两个氢键相连,所以G-C含量较高的模板,其解链温度相对要高些。故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜(DMSO),并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃,时间适当延长,即所谓的热启动。 2.模板DNA与引物的退火 将反应混合物温度降低至37~65℃时,寡核苷酸引物与单链模板杂交,形成DNA模板-引物复合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。一般要求引物的浓度大大高于模板DNA的浓度,并由于引物的长度显著短于模板的长度,因此在退火时,引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多,退火时间一般为1~2min。 3.引物的延伸 DNA模板-引物复合物在Taq DNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条与模板DNA链互补的新链。重复循环变性-退火-延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。在72℃条件下,Taq DNA聚合酶催化的合成速度大约为40~60个碱基/秒。经过一轮“变性-退火-延伸”循环,模板拷贝数增加了一倍。在以后的循环中,新合成的DNA都可以起模板作用,因此每一轮循环以后,DNA拷贝数就增加一倍。每完成一个循环需2~4min,一次PCR经过30~40次循环,约2~3h。扩增初期,扩增的量呈直线上升,但是当引物、模板、聚合酶达到一定比值时,酶的催化反应趋于饱和,便出现所谓的“平台效应”,即靶DNA产物的浓度不再增加。 PCR的三个反应步骤反复进行,使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用Y =(1+X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数,X表示平(Y)均每次的扩增效率,n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%,但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期,靶序列DNA片段的增加呈指数形式,随着PCR产物的逐渐积累,被扩增的DNA片段不再呈指数

凯氏定氮仪原理及操作步骤

凯氏定氮仪原理及操作步骤 凯氏定氮仪原理: 蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分解,分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量乘以换算系数,即为蛋白质含量。 1.有机物中的胺根在强热和CuSO4,浓H2SO4 作用下,硝化生成(NH4)2SO4 反应式为: 2NH2+H2S04+2H=(NH4)2S04 (其中CuSO4做催化剂) 2.在凯氏定氮器中与碱作用,通过蒸馏释放出NH3 ,收集于H3BO3 溶液中 反应式为: (NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O 3.用已知浓度的H2SO4(或HCI)标准溶液滴定,根据HCI消耗的量计算出氮的含量,然后乘以相应的换算因子,既得蛋白质的含量反应式为: (NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=(NH4)2SO4+4H3BO3 (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3 凯氏定氮仪操作步骤:

(一)消化 1、准备6个凯氏烧瓶,标号。1、 2、3号烧瓶中分别加入适当浓度的蛋白溶液1.0mL,样品要加到烧瓶底部,切勿沾在瓶口及瓶颈上。再依次加入硫酸钾-硫酸铜接触剂0.3g,浓硫酸2.0mL,30%过氧化氢1.0mL。4、5、6号烧瓶作为空白对照,用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质,对样品测定进行校正。4、5、6号烧瓶中加入蒸馏水1.0mL代替样液,其余所加试剂与1、2、3号烧瓶相同。 2、将加好试剂的各烧瓶放置消化架上,接好抽气装置。先用微火加热煮沸,此时烧瓶内物质炭化变黑,并产生大量泡沫,务必注意防止气泡冲出管口。待泡沫消失停止产生后,加大火力,保持瓶内液体微沸,至溶液澄清后,再继续加热使消化液微沸15min。在消化过程中要随时转动烧瓶,以使内壁粘着物质均能流入底部,以保证样品完全消化。消化时放出的气体内含SO2,具有强烈刺激性,因此自始自终应打开抽水泵将气体抽入自来水排出。整个消化过程均应在通风橱中进行。消化完全后,关闭火焰,使烧瓶冷却至室温。 (二)蒸馏和吸收 蒸馏和吸收是在微量凯氏定氮仪内进行的。凯氏定氮蒸馏装置种类甚多,大体上都由蒸气发生、氨的蒸馏和氨的吸收三部分组成。 1、仪器的洗涤 仪器安装前,各部件需经一般方法洗涤干净,所用橡皮管、塞须浸在10%NaOH溶液中,煮约10min,水洗、水煮10min,再水洗数次,然后安装并固定在一只铁架台上。

WB操作原理以及流程细节

WB实验的基本原理及操作流程 【实验原理】 一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质(或酶)。因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志,检测蛋白质的方法很多,除ELISA法外,也可用与检测DNA和RNA相类似的吸印方法。前两法有“南”和“北”之意,故本法遂被延伸称为Western(西)印迹法,该法能用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨出与专一抗血清结合的专一性蛋白质。将聚丙烯酰胺凝胶上分辨出的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上并与第一抗体共孵。第一抗体专一地与待分离蛋自质的抗原决定簇结合,然后用另一种蛋自质,如135I-蛋白A或辣根过氧化物酶连接的山羊抗IgG检测已结合上去的抗体。本法所需时间6小时或过夜。 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳 几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行,而所用条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚集。最常用的方法是将强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用,并通过加热使蛋白质解离后再加样于电泳凝胶上。变性的多肽与SDS结合并因此而带负电荷,由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关,因此SDS多肽复合物在聚丙烯酰凝胶电泳中的迁移只与多肽的大小相关。在达到饱和的状态下,每克多肽约可结合1.4克去污剂,借助已知分子量的标准参照物,则可测算出多肽链的分子量。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续缓冲系统中进行,其电泳槽缓冲液的pH值与离子强度不同于配胶缓冲液,当两电极间接通电流后,凝胶中形成移动界面,并带动加入凝胶的样品中所含的SDS多肽复合物向前推进。样品通过高度多孔性的积层胶后,复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带(或称积层)。曲于不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力,故大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝胶的分辨率。 最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornsstein(1964)和Davis(1964)设计的,样品和积层胶中含Tris-Cl(pH6.8),上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸(pH8.3),分离胶中含 Tris-Cl(pH8.8)的。系统中所有组分都含有0.1%的SDS(Laemmli, 1970),样品和积层胶中的氯离干形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界,在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域,它推动样品中的多肽前移并在分离胶前沿积聚,此处pH值较高,有利于甘氨酸的离子化,所形成的甘氨酸离子穿过堆集的多肽并紧随氯离子之后,沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后,SDS多肽复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶,并被筛分而依各自的大小得到分离。 【常用试剂】 1)30%丙烯酰胺/0.8% N,N’-亚甲丙烯酰胺

瘦肉精检测原理及操作步骤(精)

瘦肉精检测原理及操作步骤? 时间:2011-03-22来源:作者: 一、测定原理 “瘦肉精”克仑特罗竞争酶标免疫检测方法快速测定的基础是抗原抗体反应。酶联板的微孔包被有针对兔抗克仑特罗特异性抗体的羊抗体(第二抗体)。加入兔抗克仑特罗特异性抗体(第一抗体)与第二抗体结合而被固定,洗涤后加入标准液或样品溶液与酶结合物(酶标记抗原),标准液或样品中的游离抗原与酶标抗原竞争兔抗克仑特罗特异性抗体上有限的结合位点。通过洗涤除去没有与特异性抗体结合的酶标抗原,加入酶基质(过氧化脲)和发色剂(四甲基联苯胺)并孵育,结合到板上的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的底物。加酸终止反应后,颜色由蓝色转变为黄色。在单波长450 nm处测吸光度,吸收光强度与样品中的克仑特罗浓度成反比。 二、试剂盒的组成 每个盒中(包括标准分析孔)材料如下: (1)1×96孔板(12排×8孔),包被有第二抗体(兔IgG抗体);(2)6个标准液(300ul/瓶)为克仑特罗水溶液。浓度分别为0 ng/kg、100 ng/kg、300 ng/kg、900 ng/kg、2700 ng/kg、8100 ng/kg;(3)1个克仑特罗过氧物酶标记物浓缩液12 ml(红色帽);(4)1个克仑特罗抗体浓缩液12 ml(黑色帽);(5)1个酶基质/发色剂11 ml(蓝色帽);(6)1个反应停止液,1 mol/L硫酸14 ml (黄色帽);(7)1个缓冲液25 ml,酶标记物及抗体浓缩液稀释用。 三、试验材料

1、设备 微孔板酶标仪(450 nm)、均质器、冷冻离心机、离心管(50 ml)、微量可调移液器(单道、八道)、RIDAC18柱、滤纸(0.45μm)。 2、试剂 甲醇(分析纯、100%)、50 mmol/LHCL、10 mmol/LHCL、50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH 3.0)、500 mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH 3.0)、1 mol/LNaOH。 四、储存条件 试剂盒保存于2-8℃,不要冷冻。不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与干燥剂一起重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感,避免直接暴露在光线下。 五、试剂变质的迹象 发色剂有任何颜色表明已变质,应当弃之。0标准的吸光值小于0.6时,表示试剂可能变质。 六、样品处理 1、尿样 尿样一般不用处理,取20清亮尿样直接测定。如果尿样混浊要过滤或离心至得到清亮尿样。 2、肝脏、肉样

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