考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的含量
实验一 考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的含量
【实验目的】
1．掌握考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量的原理和过程。 2．熟悉蛋白质含量测定的影响因素。 【实验原理】
1976年Bradford 等建立了用考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，迅速、灵敏的定量测定蛋白质的方法。染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收的改变，从465 nm 变为595 nm ，光吸收增加。蛋白质-染料复合物具有较大的吸光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低检出量为1 g 蛋白。染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约只需2分钟，结合物的颜色在1小时内是稳定的。由于该法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。
N CH 2CH 3
CH 2
N +
CH 3CH 2CH 2NH
CH 3CH 3
O CH 2CH 3
SO 3-SO 3Na
蛋白质+ 蛋白质-染料复合物
H +
考马斯亮蓝G-250
（蓝色，λ
max
595nm ）
【仪器与试剂】
1．紫外-可见分光光度计，微量注射器。
2．考马斯亮蓝G-250，95%乙醇，85%(W/V)磷酸。 【实验步骤】
1．标准蛋白质溶液的配制
称取牛血清白蛋白适量，加水溶解并配制成1 mg/ml 的溶液。 2．蛋白试剂的配制
称取100 mg考马斯亮蓝G-250，加入95%乙醇50 ml溶解，再加入85%(W/V)磷酸100 ml，将溶液用水稀释至1000 ml。试剂的终浓度为0.01%考马斯亮蓝G-250，4.7%乙醇和8.5%(W/V)磷酸。
3．标准曲线的制作
取标准蛋白质溶液5、10、20、50、100 μl于小试管中，用水稀释至0.1 ml，然后分别加入5 ml蛋白试剂，充分振荡混合，2分钟后于595 nm测定其吸光度值。以0.1 ml水及5 ml蛋白试剂作为空白对照。以蛋白浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线作为定量依据。
4．样品测定
取含10~100 μg蛋白质溶液于小试管中，加水稀释至0.1 ml，然后加入5 ml 蛋白试剂，充分振荡混合，2分钟后于595 nm测定其吸光度值。以0.1 ml水及5 ml蛋白试剂作为空白对照。根据吸光度值计算样品中蛋白质的含量。
【实验结果】
1．绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数。
2．计算蛋白质的含量。
1．牛血清白蛋白预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度确定称取量，或根据牛血清白蛋白的紫外吸光系数为6.6来确定。
2．一些阳离子，如K+、Na+、Mg2+、(NH4)2SO4和乙醇等物质不干扰测定，而大量的去污剂如Triton X-100和SDS等严重干扰测定，少量的去污剂可通过用
适当的对照而消除。
3．如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5～20分钟内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的；比色反应需在1小时内完成。
4．测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的；测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
实验二3、5-二硝基水杨酸比色法测定糖的含量
【实验目的】
1．掌握3、5-二硝基水杨酸比色法测定糖含量的原理和过程。
2．了解糖含量测定的干扰因素。
【实验原理】
还原糖是指含自由醛基或酮基的单糖（如葡萄糖）和某些具有还原性的双糖（如麦芽糖）。它们在碱性条件下，可变成非常活泼的烯二醇。遇氧化剂时，具有还原能力，烯二醇本身则被氧化成糖酸及其他产物。黄色的3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂与还原糖在碱性条件下共热后，自身被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，反应液里棕红色物质颜色深浅程度与还原糖的含量成一定比例关系，在波长为520nm处测定溶液的吸光度，查对标准曲线并计算，便可求得样品中还原糖的含量。
对于非还原性的双糖（如蔗糖）以及还原性很小的多糖（如淀粉），应先用酸水解法将它们彻底水解成单糖。再借助于测定还原糖的方法，可推算出总糖的含量。由于多糖水解时，在每个单糖残基上加了一分子水，因而在计算时，须扣除加入的水量，当样品里多糖含量远大于单糖含量时，则比色测定所得总糖含量应乘以折算系数（1 - 18/180 = 0.9），即得比较接近实际的样品中总糖含量。
【仪器与试剂】
1．紫外-可见分光光度计，恒温水浴。
2．3、5-二硝基水杨酸试剂，6mol/L盐酸，10%氢氧化钠，酚酞指示剂，碘-碘化钾溶液。
3．无水葡萄糖（AR），山芋粉。
【实验步骤】
1．葡萄糖标准液的配制
精密称取预先在105?C干燥至恒重的无水葡萄糖100 mg，用少量蒸馏水溶解后，定量转移至100 ml容量瓶中，再加水定容至刻度，摇匀，即得浓度为l.0 mg/ml的标准溶液。
2．总糖样品液的制备
精密称取1 g山芋粉，置锥形瓶中，加入6 mol/L盐酸液l0 ml和水15 ml，在沸水浴中加热0.5小时，取出1～2滴置于白瓷板上，加l滴碘-碘化钾溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈蓝色。冷却后加入l滴酚酞指示剂，以10%氢氧化钠溶液中和至溶液呈微红色，过滤，滤液加水定容至100 ml。再精确吸取上述溶液l0 ml于100ml容量瓶中，加水定容至刻度，混匀备用。
3．还原糖样品液的制备
精密称取2 g山芋粉，置100 ml烧杯中，先以少量水调成糊状，然后加50～60ml蒸馏水，于50?C恒温水浴中保温20分钟，过滤，将滤液收集在100 ml容量瓶中，加水定容至100 ml。
4．标准曲线的制作
取5支试管，分别加入0.1、0.2、0.5、1.0和2.0 ml葡萄糖标准液，加水至2.0 ml后，再加入3、5-二硝基水杨酸试剂1.5 ml；混合均匀，在沸水浴中加热5分钟；取出后立即用冷水冷却至室温。再向每管加入21.5 ml蒸馏水，摇匀；用2.0 ml水作为空白，于520 nm波长处测吸光度（A）值。以葡萄糖质量（mg）为横坐标，以吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线。
5．样品中总糖和还原糖的含量测定
分别取1.0 ml总糖样品液或还原糖样品液，加入蒸馏水1.0 ml和3、5-二硝基水杨酸试剂1.5 ml，其余操作均与标准曲线的制作相同。以2.0 ml蒸馏水作空白对照，平行测定3份样品液。测定后，根据样品的吸光度平均值在标准曲线上
查出相应的糖量，用下式计算出山芋粉中还原糖与总糖的百分含量。
还原糖含量（%）= ×100%
C x ×D
W x
总糖含量（%）= ×100%
C x ′×D
W x
式中，C X 和C X ′分别为样品水解前和水解后的还原糖浓度，D 为样品溶液的稀释体积，W X 为样品称取量。 【实验结果】
1．绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数。
2．计算还原糖和总糖的含量。
还原糖含量测定结果
总糖含量测定结果
最优考马斯亮蓝染色Protocol
考马斯亮蓝染色 推荐选用前三种染色方法，另有传统考马斯亮蓝染色法和网上经验，染色效果不好，不推荐使用，仅供参考。（见后页比对照片） 操作步骤： 1、取出SDS-PAGE凝胶，经超纯水漂洗；（以下每步操作皆在摇床上进行。） 2、固定：将凝胶放入相应的固定液中，固定1小时； 3、染色：取出凝胶，放入相应的染色液中，过夜染色；（也可依实际情况缩短时间） 4、脱色（胶体法&改良法）：凝胶放入纯水中洗脱，换液数次； 脱色（Neuhoff法）：取出凝胶，用0.1 M Tris-H3PO4缓冲液（pH6.5）漂洗2分钟。再用25%乙醇淋洗＜1 min。然后再用10%乙酸中在室温脱色2小时即可。 试剂的配制： 1、胶体考马斯亮蓝染色法（colloidal Coomassie brilliant blue，cCBB）： 固定液：40%甲醇、10%乙酸 染色液：1.6%磷酸、8%硫酸铵、0.02% CBB-G250、20%乙醇 脱色液：H2O 2、改良考马斯亮蓝染色法（modified Coomassie brilliant blue，mCBB）： 固定液：40%甲醇、10%乙酸 染色液：10%磷酸、10%硫酸铵、0.12% CBBG250、20%乙醇（着色1小时即可）。 脱色液：H2O 3、Neuhoff染色法： 固定液：12%三氯醋酸 染色液：2%磷酸、10%硫酸铵、0.02% CBB-G250、使用前振摇。染色时，取一定体积的染色液，加入1/4体积的甲醇。 脱色所需：0.1 M Tris-磷酸缓冲液（pH6.5）、25%乙醇、10%醋酸
4、传统考马斯亮蓝染色法： 固定液：45.4%甲醇、4.6%乙酸 染色液：45.4%甲醇、4.6%乙酸、0.1% CBB-G250 脱色液：5%甲醇、7.5%乙酸 5、网上方法： 固定液：40%甲醇、10%乙酸 染色液：30%甲醇、10%乙酸、0.125% CBB-G250 脱色液：30％甲醇，10％乙酸 比对照片：每块胶左道是Marker（质量原因，未跑开( ˇ?ˇ )）上样量5μl，右道是BSA（分子量68kDa），上样量为3μg. Neuhoff法 传统法胶体法改良法网上法
实验 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
实验五考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 一、实验目的 1.掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质含量的原理与方法 2.熟练分光光度计的使用和操作方法。 二、实验原理 考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种，它与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。它在酸性溶液中呈棕红色，最大光吸收峰在465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大吸收峰改变为595nm。考马斯亮蓝G-250—蛋白质复合物呈蓝色，在一定范围内，595nm下光密度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝结合法是近年来发展起来的蛋白质定量测定法，本方法具有操作方便、快速、干扰因素少的特点。 离心机的使用说明： 1.要离心的离心管和管套要称重，重量不等时将水加在管套里。2．离心管的放置是对角线放置，要求必须对称。 3. 先将离心机转速旋钮恢复到零刻度后，再定时间，定好时间后缓慢旋转转速旋钮，使离心机均匀的提速到预定转速。 分光光度计的使用说明： 1.接通电源开关，预热20min后，再选择须用的单色光波长。 2.放入已加入溶液的比色皿，盖上样品室盖，推动试样架拉手，使对照比色皿（溶液装入4／5高度，置第一格）置于光路上，调节100％透射比按钮，使吸光度值A=。 3.推动试样架拉手，使样品比色皿置于光路上，读出吸光度值。 4.测量完毕，取出比色皿，洗净后置于乙醇溶液中浸泡脱色。 5.电源开关置于“关”，拔下电源插头。 三、试剂与器材： 1. 试剂： （1）％NaCl：9g NaCl溶解在1L的容量瓶中。 （2）标准蛋白质：称取50mg结晶牛血清蛋白定溶于50ml容量瓶里。 （3）染液：考马斯亮蓝G-250 ，溶于250mL95%乙醇，再加入500mL85％(W
考马斯亮蓝测定蛋白含量总结
一原理 考马斯亮蓝 G — 250（GooMAssle BrIIIIAnT Blue G — 250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝 G— 250在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nM，后者在595nM。在一定蛋白质浓度范围内（1?100卩g）,蛋白质与色素结合物在595nM波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋 白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G — 250结合在2Min左右的时间内达到平衡，完成 反应十分迅速，其结合物在室温下1H内保持稳定。该反应快速灵敏（灵敏度比Foiln -酚法 还高4倍）、易于操作、干扰物质少（考马斯亮蓝G — 250和蛋白质通过范德华力结合，受蛋白质的特异性影响较小，除组蛋白外，其他不同种类蛋白质染色强度差异不大），可测定微克级蛋白质含量，是一种比较好的蛋白质定量法。但此方法也存在其缺点，考马斯亮蓝在蛋 白质含量很高时线性关系偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有差异。 考马斯亮蓝G-250试剂呈色反应颜色稳定、灵敏度高，最低测试蛋白质量在1ug左右。 二试剂配置 考马斯亮蓝 G-250100mg溶于50mI95%乙醇，加入100ml质量浓度为0.85g/ml的磷酸，作为母液保存，使用时用水稀释到 1000ml。滤纸过滤。试剂的最终浓度为0.01%考马斯亮蓝 G-250、质量浓度为0.085g/ml磷酸。贮放在棕色瓶中，此溶液在常温下可放置1个月。 三步骤 1破碎细菌提取蛋白液 大肠杆菌表达外源蛋白，在超声破碎的时候，用含有1%triton-X-100的PBS悬浮，然后超 声的效果较好，1%triton-X-100的作用还是很明显的，对其他的一些细菌同样起作用，比如链霉菌。（30% Triton X-100 的配制 Triton X-100 28.2ml 0.1mol/L PBS（pH=7.3）或 0.05mol/l TBS（pH=7.4） 72.8ml 配制方法 取Triton X-100及PBS （或TBS）混合，置37C?40C水浴中2?3h,使其充分溶解混匀。用前取该储备液稀释至所需浓度。通常将30%稀释到1%。） 目的蛋白就在这些未破碎的细胞中。 1*会产生气泡是因为你的探头位置没放好。探头一定要接近底部，约1cm （我一般是距底部
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度Word版
实验报告 学院：第二临床医学院专业：临床医学年级：2013级班级：1班姓名：学号：日期：2014,3,8 得分：实验课程：生物化学实验 实验名称：蛋白质的定量测定（五）——考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度 【实验目的】 掌握考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量的原理和方法。 【实验原理】 考马斯亮蓝G-250（Coomassie G-250）是一种甲基取代的三苯基甲烷，分子中磺酸基的蓝色染料，在465nm处有最大吸收值。考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成蛋白质—考马斯亮蓝复合物蓝色溶液，引起该染料的最大吸收λmax的位置发生红移，在595nm处有最大吸收值。由于蛋白质—考马斯亮蓝复合物在595n处的光吸收远高于考马斯亮蓝在465nm处的光吸收，因此可大大地提高蛋白质的测定灵敏度。蛋白质—考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。利用溶液颜色的差异进行比色测定，适合于蛋白质类的定量分析尤其适合于稀有蛋白质的微量分析。考马斯亮蓝G-250试剂呈色反应颜色稳定、灵敏度高，最低测试蛋白质量在1ug左右。 【试剂与器材】 试剂： 考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇，加入100ml质量浓度为0.85g/ml 的磷酸，用蒸馏水稀释到1000ml。 标准蛋白质溶液：结晶牛血清清蛋白，预先经微量凯氏定氮法标定该蛋白质的百分含量，然后根据该蛋白的纯度用0.15mol/LNacl配制成1.0mg/ml蛋白溶液。
器材： 试管和试管架 722型分光光度计 吸量管 移液枪 【实验步骤】 一、制作标准曲线 各管混匀后，静置3min，以0号管为空白管调零，在595nm波长下分别测定各管溶液的吸光度值（A595）. 以A595值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。 二、待测蛋白质浓度测定 测定方法同上，1ml待测蛋白质家5ml考马斯亮蓝试剂，。用上述0号管调零，测出血清的A595值。 【实验结果】
考马斯亮蓝染色套装使用说明
考马斯亮蓝染色套装使用说明 货号：P1305 保存：室温保存，至少一年有效。 规格：100ml+500ml 产品简介： 本考马斯亮蓝染色套装(Commassie Blue Staining Kit)采用了最经典的 考马斯亮蓝染色和脱色方法，以考马斯亮蓝G-250为染料，可用于SDS-PAGE或非变性PAGE等蛋白电泳凝胶的常规染色和脱色，或Western 转膜后PAGE胶上残余蛋白的检测。 产品内容： 考马斯亮蓝染色液100ml 考马斯亮蓝脱色液500ml 说明书1份 使用方法： 1、电泳结束后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中(至少5倍胶体积)，确保染色液可以充分覆盖凝胶。 2、将凝胶置于摇床上缓慢摇动，室温染色至少2小时，低丰度蛋白染 色需4小时以上。 3、染色结束后移除染色液，染色液通常可重复利用2-3次，但染色效
果会略有影响。 4、将凝胶浸泡于和染色液等量体积的脱色液中，摇床上脱色4-8小时，期间更换3-5次脱色液。 注意事项： 1.染色时间4小时以上效果最佳。 2.脱色可根据目的蛋白丰度和脱色效果随时终止，或延长脱色时间。 3.脱色越彻底，检测的蛋白量越低，脱色24小时一般可以检测出0.1ug蛋白量。 4.脱色后，将凝胶保存在水中，拍照或扫描保存图像。或制成干胶保存。 相关试剂： P1300-500考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液 PC0020BCA蛋白浓度测定试剂盒 PR1400低分子量蛋白MARKER PR1700预染次高分子量蛋白MARKER I1020IPTG溶液(50mg/ml) A101030%丙烯酰胺(29:1) T10705×Tris-甘氨酸电泳缓冲液 P1300SDS-PAGE凝胶制备试剂盒
考马斯亮蓝法测蛋白质
考马斯亮蓝法测蛋白质含量 一、原理 考马斯亮蓝G-25(Coomassie G-250是一种甲基取代的三苯基甲烷，分子中磺酸基的蓝色染料，在 465nm 处有最大吸收值。考马斯亮蓝 G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成蛋白质一考马斯亮蓝复合物蓝色溶液，引起该染料的最大吸收入max的位置发生红移，在 595nm 处有最大吸收值。由于蛋白质—考马斯亮蓝复合物在 595nm 处的光吸收远高于考马斯亮蓝在 465nm 处的光吸收，因此，可大大地提高蛋白质的测定灵敏度。蛋白质—考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。利用溶液颜色的差异进行比色测定，适合于蛋白质类的定量分析，尤其适合于稀有蛋白质的微量分析。考马斯亮蓝G-250试剂呈色反应颜色稳定、灵敏度高，最低测试蛋白质量在 1ug 左右。 二、操作步骤 1. 标准曲线测定法 分别取六只试管，其中一只加入 1.0ml蒸馏水做空白，5只分别加入不同体积的浓度为 100ug/ml 牛血清清蛋白标准液，补充水到 1.0ml。然后每只试管加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀放置5min,在紫外 -可见分光光度计 595nm 处测定吸光值。以 A595 吸光值为纵坐标,牛血清清蛋白的 ug 数量为横坐标绘制标准曲线。具体操作见下表。
蛋白质标准曲线测定加样 在标准蛋白质测定时，为了减小误差，每一个浓度的蛋白质做3支平 行管。 3?试剂配置 a. 牛血清清蛋白标准液结晶牛血清清蛋白或酪蛋白，预先经微量凯氏定氮法标定该蛋白质的百分含量或者根据牛血清清蛋白的消光系数 是6.6来计算其百分含量。然后根据该蛋白的纯度配置成浓度为 100 ug/ml的蛋白溶液。 b. 考马斯亮兰G— 250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G—250,溶于 50ml 95%的乙醇后，再加入100ml 85%的磷酸，用水稀释至1升
考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白
考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白质含量 原理： 考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。该染料在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm在一定蛋白质浓度范围内（1-1000μg），蛋白质与色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。 考马斯亮蓝G-250于蛋白质结合反应十分迅速，2min左右即达到平衡。其结合物在室温下1h内保持稳定。此法灵敏度高，易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。 材料、仪器设备及试剂 1、材料 小麦叶片、马铃薯块茎、或其他植物材料 2、仪器设备 分光光度计、研钵、烧杯、移液管 3、试剂 （1）标准蛋白质溶液：100μg·Ml-1牛血清白蛋白：称取牛血清白蛋白25mg，加水溶解并定容至100ml,吸取上述溶液40ml，用蒸馏水稀释至100ml即可。（2）考马斯亮蓝G-250溶液：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml90%乙醇中，加入100ml85%（W/V）的磷酸，再用蒸馏水定容到1L，贮于棕色瓶中，常温下可保存一个月。 方法： 1、标准曲线的绘制 取6支具塞试管，按表加入试剂。混合均匀后，向各管中加入5ml考马斯亮蓝 G-250溶液，摇匀，并放置5min左右，在595nm下比色测定吸光度。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 管号 1 2 3 4 5 6 标准蛋白质（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水量（ml） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 蛋白质含量（μg） 0 20 40 60 80 100 2、样品测定 （1）样品提取：取鲜样0.5g，加入2ml蒸馏水研磨，磨成匀浆后用6ml蒸馏水冲洗研钵，洗涤液收集在同一离心管中，在4000r/min下离心10min，弃去沉淀，上清液转入容量瓶，以蒸馏水定容至10ml，摇匀后待测。 （2）吸取样品提取液0.1ml，放入具塞试管中（每个样品重复2次），加入5ml 考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合，放置2min后在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。 （3）结果计算（单位mg/g）样品中蛋白质含量=（C·VT）/(1000 VS·WF) 式中：C—查的标准曲线值（μg）
考马斯亮蓝染色法
蛋白质浓度的测定──考马斯亮蓝染色法 目的要求 学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和方法。 实验原理 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。 考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’s law）。此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。 蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5μL/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10－100μg蛋白质，微量测定法测定范围是1－10μg蛋白质。此反应重复性好，精确度高，线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。 此方法干扰物少，研究表明：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，（NH4）2SO4无干扰。强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris，乙酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如Triton X―100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。 试剂与器材 一、试剂 考马斯亮蓝试剂： 考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G―250，4.7%(W/V)乙醇。 二、标准和待测蛋白质溶液 1．标准蛋白质溶液 结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/ml，0.1mg/ml蛋白溶液。 2．未知蛋白质溶液。 三、器材 试管及试管架，移液管（0.1ml及5ml），UV－2000型分光光度计。 操作方法
蛋白质含量测定法考马斯亮蓝法
蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法 [实验目的] 学习、掌握考马斯亮蓝法（Bradford 法）测定蛋白质含量的方法 [实验原理] （蓝色）变为氨基酸芳香族 碱性 染料考马斯亮蓝磷酸nm G 595250max λ??→?+ - [器材与试剂] 器材 722型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管16支 试剂 1.标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA ），配制成1.00mg/ml 。 2.考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg 考马斯亮蓝，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。 [实验方法] 标准方法 1.取10支试管，分别编号后按 表1 剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。 2.加完染料20min 后，使用722分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。 3.用标准蛋白浓度（mg/ml ）为横坐标，用A 595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。根据测得的未知样品的A 595，代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。根据所测样品的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量,按下式计算: 样品蛋白质含量(μg/g 鲜重) = ） 测定时提取液体积（）样品重（） 提取液总体积（）查得的蛋白质（ml g ml g g ??/μ SDS 干扰实验 1.取5支试管，分别编号后按表2剂量依次加入标准蛋白、SDS 、去离子水和考马斯亮蓝染料。每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。 2.加完染料20min 后，使用753分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。 [实验数据与结果分析] （一）标准方法的数据和图 表1 考马斯亮蓝标准法实验表格
常规考马斯亮蓝染色液
常规考马斯亮蓝染色液 简介： 考马斯亮蓝染色液(Commassie Blue Staining Solution)是以考马斯亮蓝R250为染料可用于SDS-PAGE 或非变性PAGE 等蛋白电泳胶的常规染色或Western 转膜后PAGE 胶上残余蛋白的检测。采用常规染色方法需至少1h ，采用快速染色方法一般数分钟即可。本染色液经过改良，不含有毒的甲醇，但含有刺激性气味的乙酸。 组成： 操作步骤(仅供参考)： (一)常规染色脱色方法 1、PAGE 电泳结束后取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶。 2、置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温染色1小时或更长时间。具体的染色时间取决于凝胶的厚度和染色时的温度。凝胶较厚，温度较低，则染色时间宜适当延长。凝胶较薄，温度较高，则染色时间可以适当缩短。通常染色至凝胶的颜色和染色液的颜色非常接近，在染色液中几乎看不清凝胶时，可以认为已染色充分。染色小时或更长时间不会对最终的染色效果产生负面影响。 3、倒出染色液。染色液可以回收重复使用次。 4、加入适量脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶。Leagene 推荐脱色液的配方是：40%乙醇，10%乙酸，50％蒸馏水。 5、置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温脱色。期间更换脱色液2～4次，直至蓝色背景基本上全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期。通常蛋白条带在脱色1～2h 后即可出现。 6、完成脱色后把凝胶保存在水中，用于后续的拍照等。保存在水中的凝胶会发生溶涨。如需避免溶涨，可以把胶保存在含20%甘油水溶液中，长期保存可以制备干胶。 (二)快速染色脱色方法 1、PAGE 电泳结束后取胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，微波炉加热至接近沸腾或刚刚沸腾，立即停止加热。 2、随后在染色液温度较高的情况下，在室温摇床上摇动。 3、倒出染色液。染色液可以回收重复使用2～3次。 编号 名称 PT0018 PT0018 Storage Commassie Blue Staining Solution 100ml 500ml RT 使用说明书 1份
标准曲线制作考马斯亮蓝法测蛋白质含量(精)
标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量 一、标准曲线 一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。 二、蛋白质含量测定方法 1、凯氏定氮法 2、双缩脲法 3、Folin-酚试剂法 4、紫外吸收法 5、考马斯亮蓝法 三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作 （一）、试剂： 1、考马斯亮蓝试剂： 考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。 2、标准蛋白质溶液： 纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。 （二）、器材： 1、722S型分光光度计使用及原理（）。 2、移液管使用（）。 （三）、标准曲线制作： 1、 2、以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、
40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。 1）、利用标准曲线查出回归方程。 2）、用公式计算回归方程。 3）、或用origin作图，测出回归线性方程。即A595nm=a×X( )+6 一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。 4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。 （四）、蛋白质含量的测定： 样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。 一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。 （五）、注意事项： 1、玻璃仪器要洗涤干净。 2、取量要准确。 3、玻璃仪器要干燥，避免温度变化。 4、对照：用被测物质以外的物质作空白对照。
最优考马斯亮蓝染色Protocol
最优考马斯亮蓝染色 P r o t o c o l Company number：【WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998】
考马斯亮蓝染色 推荐选用前三种染色方法，另有传统考马斯亮蓝染色法和网上经验，染色效果不好，不推荐使用，仅供参考。（见后页比对照片） 操作步骤： 1、取出SDS-PAGE凝胶，经超纯水漂洗；（以下每步操作皆在摇床上进行。） 2、固定：将凝胶放入相应的固定液中，固定1小时； 3、染色：取出凝胶，放入相应的染色液中，过夜染色；（也可依实际情况缩短时间） 4、脱色（胶体法&改良法）：凝胶放入纯水中洗脱，换液数次； 脱色（Neuhoff法）：取出凝胶，用 M Tris-H3PO4缓冲液（）漂洗2分钟。再用25%乙醇淋洗＜1 min。然后再用10%乙酸中在室温脱色2小时即可。 试剂的配制： 1、胶体考马斯亮蓝染色法（colloidal Coomassie brilliant blue，cCBB）： 固定液：40%甲醇、10%乙酸 染色液：%磷酸、8%硫酸铵、% CBB-G250、20%乙醇 脱色液：H2O 2、改良考马斯亮蓝染色法（modified Coomassie brilliant blue，mCBB）： 固定液：40%甲醇、10%乙酸 染色液：10%磷酸、10%硫酸铵、% CBBG250、20%乙醇（着色1小时即可）。 脱色液：H2O 3、Neuhoff染色法： 固定液：12%三氯醋酸
染色液：2%磷酸、10%硫酸铵、% CBB-G250、使用前振摇。染色时，取一定体积的染色液，加入1/4体积的甲醇。 脱色所需： M Tris-磷酸缓冲液（）、25%乙醇、10%醋酸 4、传统考马斯亮蓝染色法： 固定液：%甲醇、%乙酸 染色液：%甲醇、%乙酸、% CBB-G250 脱色液：5%甲醇、%乙酸 5、网上方法： 固定液：40%甲醇、10%乙酸 染色液：30%甲醇、10%乙酸、% CBB-G250 脱色液：30％甲醇，10％乙酸 比对照片：每块胶左道是Marker（质量原因，未跑开( ˇˇ )）上样量5μl，右道是BSA（分子量68kDa），上样量为3μg.
实验七 考马斯亮蓝G250法测定的蛋白质含量
实验七考马斯亮蓝G250法测定的蛋白质含量 一、试验目的 1. 学习分光光度计的原理及操作 2.学习利用染色方法提高蛋白质消光系数，以提高分光光度法检测灵敏度 二、基本原理 1. 根据物质的吸收光谱进行定性或定量分析的方法称为吸收光谱法或分光 光度法。该法所用的仪器称为分光光度计或吸收光谱仪。该法所使用的光谱范围包括可见光和紫外光，即包括波长在200 - 800 nm之间的光。 2.分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用范围广，其中的紫外/可见分光 光度技术更是生物化学研究工作中必不可少的基本手段之一。 3.紫外区可分为紫外（近紫外）和真空紫外（远紫外）。由于吸收池（又称样 品池、比色杯等）和光学元件以及氧气能吸收小于190nm波长的光，因此常规紫外测定集中在近紫外区，即200nm-400nm。可见光区为400nm -800nm。 4.考马斯亮蓝G250法 原理：考马斯亮蓝G250与蛋白质结合后，其最大吸收波长从465nm改变为595nm,该蛋白－染料复合物吸光系数很高，所以检测灵敏度很高，可以测定1μg /mL的蛋白质，染料和蛋白结合只需要2分钟，颜色在1小时内稳定。 操作简便，快速，是常用的蛋白含量测定方法之一。去污剂，粘多糖等严重干扰该方法的测定 三、试剂 1. 标准蛋白质溶液：0.5mg/ml牛血清白蛋白溶液 2. 考马斯亮蓝G250蛋白染色剂： 四、操作步骤 1.标准曲线的绘制： 取6只试管，分别加入浓度为0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mg/ml的标准蛋白质溶液0.1ml，然后加入5ml考马斯亮蓝试剂，震荡混匀，2分钟后于595nm 测定吸光值，以蛋白质浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。 2.样品测定： 样品液0.1mL , 然后加入5ml考马斯亮蓝试剂，震荡混匀，2分钟后于595nm 测定吸光值。从标准曲线中查出相应的浓度。 五、试验结果
考马斯亮蓝法测定蛋白
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度 蛋白质浓度测定的方法有很多，考马斯亮蓝测定蛋白质是实验室最常见的 一种方式，它利用比色法和色素法混合方法、操作简便，下文介绍了考马斯亮 蓝测定蛋白质浓度的原理、优缺点、操作以及注意事项。 实验原理 考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质― 染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。这种蛋白质 测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方 法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收 峰(lmax)的位置，由465nm变为 595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通 过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主 要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。 考马斯亮蓝染色法的突出优点是： (1)灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高 的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。 (2)测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分 钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可 以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而 完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。 (3)干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、 糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。 此法的缺点是： (1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮 蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。 (2)仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)等。 试剂与器材 一、试剂
一种简便的考马斯亮蓝G250蛋白质染色方法_江南
经验交流 一种简便的考马斯亮蓝G250蛋白质染色方法* 江南1)吴开力黄强潘苏华 (中山医科大学中山眼科中心,广州510060) 摘要介绍一种快速、简便、几乎无背景的考马斯亮蓝G250(CBB G250)染色方法.该方法所用试剂仅为稀盐酸和CBB G250,CBB G250的工作浓度为010015%,灵敏度达0102L g/带,染色2h达70%,4h以上或染色过夜即可充分染色.与以往的考马斯亮蓝染色方法相比,该方法有经济方便、灵敏度高、几乎无背景等优点,便于推广应用. 关键词电泳,染色方法,考马斯亮蓝G250 学科分类号Q5-33 蛋白质电泳后染色方法有多种:氨基黑染色、考马斯亮蓝染色和银染色等.其中考马斯亮蓝染色克服了氨基黑染色灵敏度较低,和银染法操作复杂、假阳性率高的缺点,是最常用的染色方法.但它仍然存在一些问题,如考马斯亮蓝R250 (CBB R250)背景深、耗时长;CBB G250灵敏度不高;二者所耗试剂均较多.近几年,人们对考马斯亮蓝染色法作了许多改进,不同程度地改善了某些方面的问题,但仍未尽善.本文介绍一种经济快速,灵敏度高,几乎无背景的CBB G250染色方法. 1材料和方法 111材料 11111蛋白质样品:牛血清白蛋白(BSA)购自Bio-Rad公司;小牛晶状体的alpha晶体蛋白由Sephadex G200sf两次柱层析(100cm@116cm和40cm@116cm)分离获得. 11112染色液配制:1mol/L盐酸溶液(A), 1g/L CBB G250溶液(B);应用时用1ml A液和15ml B液混合加水至1L,搅拌混匀. 11113仪器:Bio-Rad Model1000/500电泳仪; Bio-Rad(M in-i Proteanò)电泳槽.DY-1500A型高压电泳仪;Pharmacia Biotech(M ultiphorò)电泳槽. 112方法 11211电泳:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、常规聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、等电聚焦(IEF)参照郭尧君等[1]方法操作. 11212染色程序:a1电泳完毕,取出凝胶浸于5mmol/L盐酸溶液中,振荡1h;b1弃去盐酸溶液,重复步骤a;c1将胶置于染色液中,染色2~ 16h,连续振荡;d1弃去染色液,将胶置于1mmol/L盐酸溶液中脱色数小时(换液3~5次).最后对凝胶进行观察和照相,并将凝胶保存于1mmol/L盐酸溶液中. 11213凝胶染色图象分析:在染色和漂洗过程中应用Alphaimag e2000Documentation&Analysis System对凝胶照相(同一照相条件及参数)并作蛋白质条带染色强度分析;观察染色的强度变化时,以同一参照点分别测定蛋白质条带和凝胶背景的染色强度;测定漂洗时染色强度变化则以蛋白质条带的强度减去背景强度后作为该蛋白质条带的染色强度;染色强度和加样量的相关性分析采用Video DensitometeròSystem(USA Biomed Instrument.Inc),扫描每条蛋白质条带的染色强度并计算其与加样量的依存关系;染色的灵敏度通过加样不同浓度(\10ng)的BSA,染色后以肉眼能观察到的最低浓度的条带为标准. *广东省自然科学基金项目(970084)部分工作. 1)通讯联系人. Tel:(020)87330395,E-mail:yunj uyan@https://www.360docs.net/doc/998618483.html, 收稿日期:1999-08-15,修回日期:2000-01-04 # 560 #生物化学与生物物理进展Prog.Biochem.Biophys.2000;27(5)
考马斯亮蓝染色
考马斯亮蓝染色 一产品简介： 本考马斯亮蓝染色试剂盒(Commassie Blue Staining Kit)采用了最经典的考马斯亮蓝染色和脱色方法，以考马斯亮蓝R250为染料，可用于SDS-PAGE或非变性PAGE等蛋白电泳凝胶的常规染色和脱色，或Western转膜后PAGE胶上残余蛋白的检测。 使用本试剂盒，采用常规染色脱色方法累计时间达到2-3小时后可以观察到蛋白条带；采用快速染色脱色方法20分钟左右即可观察到蛋白条带。观察到最清晰的蛋白条带则需染色脱色更长时间。 本试剂盒中的染色液和脱色液经过改良，不含有毒的甲醇，但含有刺激性气味的乙酸。二保存条件：室温保存，至少一年有效。 注意事项： 可以使用枪头盒或适当大小的培养皿作为染色和脱色的容器。 本染色液呈酸性，有轻微腐蚀性，使用时请作必要防护。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 三使用说明： 1. 常规染色脱色方法： a. 电泳结束后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶。 b. 置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温染色1小时或更长时间。 注：具体的染色时间取决于凝胶的厚度和染色时的温度。凝胶较厚，温度较低，则染色时间宜适当延长。凝胶较薄，温度较高，则染色时间可以适当缩短。通常染色至凝胶的颜色和染色液的颜色非常接近，在染色液中几乎看不清凝胶时，可以认为已染色充分。染色2-4个小时或更长时间不会对最终的染色效果产生负面影响。 c. 倒出染色液。染色液可以回收重复使用至少2-3次。 d. 加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶。 e. 置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温脱色4-24小时。期间更换脱色液2-4次，直至蓝色背景基本上全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期。通常蛋白条带在脱色1-2小时后即可出现。 注：脱色期间可以在脱色液中加入一片吸水纸，可以使部分染料吸附在吸水纸上，加快脱色。脱色时间过长也会导致蛋白条带的颜色变浅。 f．完成脱色后，可以把凝胶保存在水中，用于后续的拍照等。保存在水中的凝胶会发生溶涨。如需避免溶涨，可以把胶保 存在含20%甘油的水中。长期保存可以制备干胶。 2. 快速染色脱色方法： a. 电泳结束后，取胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，微波炉加热至接近沸腾或刚刚沸腾，立即停止加热。通常对于胶浓度大于10％的胶比较坚韧，在发生煮沸时不易破损；对于胶浓度小于10%的胶，宜尽量避免煮沸，以免出现胶碎裂的情况。 b. 随后在染色液温度较高的情况下，在室温摇床上摇动5-10分钟。 c. 倒出染色液。染色液可以回收重复使用至少2-3次。 d. 加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，确保染色液可以充分覆盖凝胶。 e. 微波炉加热至接近沸腾或刚刚沸腾，立即停止加热。 f. 随后在脱色液温度较高的情况下，在摇床上摇动5-10分钟。此时通常可以观察到比较清楚的蛋白条带。 g. 更换新鲜的脱色液，重复步骤e和步骤f，直至蓝色背景基本上全部被脱去，蛋白条带染色效果达到预期。
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量 一、实验目的 掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理和方法。学习分光光度计的原理及使用方法。 二、实验原理 三、实验步骤 试剂 试管编号 0 1 2 3 4 5 6 7 标准蛋 白质溶 液/ml 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 样品0.1 样品0.1 相当于 蛋白质 含量/微 克0.00 20 40 60 80 100 未知未知 蒸馏水 /ml 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0 0 考马斯 亮蓝染 液/ml 3 3 3 3 3 3 3 3 1、打开分光光度计，预热30min。 2、取8支洁净的干燥试管，按上表进行编号，0~5号用于标准曲线的绘制，6号、7号用于 样品溶液的测定。 3、取微量注射器，用蒸馏水清洗3次，再用标准蛋白质溶液润洗2次。按上表在0~5号试 管中加入标准蛋白质溶液，然后用蒸馏水洗3次，再按上表在0~5号试管中加入相应含量的蒸馏水。 4、微量注射器用样品润洗2次，抽取100微克的样品加入到6号试管，再抽取100微克加 到7号试管。用蒸馏水清洗微量注射器。 5、取5ml的移液管，用蒸馏水清洗3次，用考马斯亮蓝染液润洗2次。在0~7号试管中各 加入3.0ml的考马斯亮蓝染液。振荡试管，混合均匀。 6、待其充分反应（约2分钟）后，用分光光度计分别测它的吸光值。 7、用0~5号的数据。以蛋白质浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。 8、由样品液的吸光值查标准曲线求出蛋白质含量。 四、实验结果与分析 试管编号0 1 2 3 4 5 6 7 A595 0 0.383 0.603 0.871 1.093 1.189 0.876 0.83 6 样品溶液吸光值=（0.876+0.836）/2=0.856 查标准曲线得样品液的蛋白质含量为66.0微克
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的具体方法及步骤
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的具体方法及步骤 蛋白质浓度测定的方法有很多，考马斯亮蓝测定蛋白质是实验室最常见的一种方式，它利用比色法和色素法混合方法、操作简便，下文介绍了考马斯亮蓝测定蛋白质浓度的原理、优缺点、操作以及注意事项。 实验原理 考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465 nm变为595 nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定595 nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。考马斯亮蓝染色法的突出优点是： (1)灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1 mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。 (2)测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在
1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。 (3)干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。 此法的缺点是： (1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。 (2)仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)等。 试剂与器材 一、试剂 考马斯亮蓝试剂： 考马斯亮蓝G―250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000 mL。 二、标准和待测蛋白质溶液 1. 标准蛋白质溶液
考马斯亮蓝快速染色液
考马斯亮蓝快速染色液 简介： 考马斯亮蓝快速染色液(Commassie Blue Fast staining solution)是以考马斯亮蓝G250为染料可用于SDS-PAGE 或非变性PAGE 等蛋白电泳胶的快速染色，亦可用于Western 转膜后PAGE 胶上残余蛋白的检测。 Leagene 考马斯亮蓝快速染色液采用Leagene 自主研发的技术，在传统考马斯亮蓝快速染色液的基础上进行改良，是一种无毒的染色液，快速染色液，可以检测低达蛋白电泳条带。其核心优点在于：无需对凝胶进行固定，无需煮沸，无需脱色，染色时间短，操作更加简单。 组成： 自备材料： 1、 水平摇床或侧摆摇床 2、 蒸馏水 3、 (可选)加热装置 4、 20%甘油水溶液 操作步骤(仅供参考)： 1、PAGE 电泳结束后取凝胶放入约蒸馏水中，在摇床上摇动，弃液，重复上述步骤1次。 2、弃蒸馏水，加入Commassie Blue Fast staining solution ，使染色液能盖住凝胶。 3、(可选)凝胶置于考马斯亮蓝快速染色液中，在水浴锅或微波炉内加热至95～100℃，立即从加热装置中取出。(此步骤可以使染色提高灵敏度或加快染色进程，亦可省略。) 4、在摇床上摇动染色，蛋白量大的条带10～15min 左右会出现，大部分蛋白条带会在30～60min 左右出现。一般情况下，5h 能获得极佳效果。 5、出现清晰的目标蛋白条带即可停止染色，弃染色液。 6、加入适量的蒸馏水停止染色反应。亦可以在摇床上摇动脱色，以便减少背景干扰。 7、把凝胶保存在水中，用于后续的拍照等。保存在水中的凝胶会发生溶涨。如需避免溶涨，可以把胶保存在含20%甘油水溶液中，长期保存可以制备干胶。 编号 名称 PT0013 PT0013 Storage 考马斯亮蓝快速染色液 100ml 500ml 4℃ 使用说明书 1份
考马斯亮蓝G-250标准曲线法测定蛋白含量
考马斯亮蓝G-250标准曲线法测定蛋白含量 实验目的： 学习和掌握考马斯亮蓝G-250 测定蛋白质含量的原理和方法。 实验原理： 考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。该法是1976年Bradford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高4 倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。 材料、主要仪器和试剂 1．实验材料 新鲜绿豆芽 2．主要仪器 （1）分析天平、台式天平 （2）刻度吸管 （3）具塞试管、试管架 （4）研钵 （5）离心机、离心管 （6）烧杯、量筒 （7）微量取样器 （8）分光光度计 3．试剂 （1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg 牛血清白蛋白，溶于100mL 蒸馏水中，即为1 000μg／mL 的原液。 （2）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250 的配制：称取100mg 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。此溶液在常温下可放置一个月。 （3）乙醇 （4）磷酸（85％） 四、操作步骤 1．标准曲线制作 （1）0~100μg／mL 标准曲线的制作：取6 支10mL 干净的具塞试管，按表1 取样。盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min 后用1cm 光经的比色杯在595nm 波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。