人参锈腐病拮抗放线菌的鉴定及发酵条件

人参锈腐病拮抗放线菌的鉴定及发酵条件
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放线菌抗生素的发酵及目的产物的提取实验报告

放线菌抗生素的发酵及目的产物的提取1、实验目的 1、熟悉掌握土壤中分离抗生素及培养方法 2、了解和掌握种子制备和摇瓶发酵技术和方法 3、了解抗生素发酵的一般规律和代谢调控理论 4、了解小型发酵罐的基本结构 5、熟悉掌握小型发酵罐的使用方法和保养 6.掌握抗生素生物效价测定的原理和方法; 7. 掌握管碟法测定抗生素生物效价相关的操作方法。 8.掌握放线菌次级代谢物的初步纯化及牛津杯实验的基 本原理和操作技术 二、实验原理 ①发酵罐是进行液体发酵的特殊设备。生产上使用的发酵罐容积大,均用钢板或不锈钢板制成;供实验室使用的小型发酵罐,其容积可从约lL至数百升或稍大些。一般来说,5L以下是用耐压玻璃制作罐体,5L以上用不锈钢板或钢板制作罐体。发酵罐配备有控制器和各种电极,可以自动地调控试验所需要的培养条件,是微生物学、遗传工程、医药工业等科学研究所必需的设备。 ②抗生素(antibiotics)是由微生物(包括细菌、真菌、放线菌属)或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物,能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。现临床常用的抗生素有转基因工程菌 培养液液中提取物以及用化学方法合成或半合成的化合物。 ③放线菌发酵结束后,次级代谢物可能与菌体结合,工业上常采用草酸或磷酸等酸化剂处理,释放与菌体结合的次级代谢物,并采用加热发酵液70 ℃,2 min使蛋白凝固,所得酸性滤液,在经碱处理,进一步去除蛋白。 抗生素的效价常采用微生物学方法测定,它是利用抗生素对特定的微生物具有抗菌活性的原理来测定抗生素效价的方法,如管碟法。管碟法是目前抗生素效价测定的国际通用方法,我国药典也采用此法。管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用,比较标准品和检

放线菌筛选的一般方法(1)

放线菌筛选的一般方法 摘要:放线菌是重要的抗生素产生菌,主要分布在土壤中(主要是链霉菌),其数量仅次于细菌。放线菌是革兰氏阳性细菌。因菌落呈放线状而的得名。常以孢子或菌丝状态存在,在自然界中分布很广,主要以孢子繁殖。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体,为了研究某种微生物,就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来,从而获得某一菌株的纯培养。 关键词:放线菌筛选微生物 1 放线菌的情况 放线菌(Actinobacillus)是一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的陆生性较强大的原核生物。因在固体培养基上呈辐射状生长而得名。大多数有发达的分枝菌丝。菌丝纤细,宽度近于杆状细菌,约0.5~1微米。可分为:营养菌丝,又称基质菌丝,主要功能是吸收营养物质,有的可产生不同的色素,是菌种鉴定的重要依据;气生菌丝,叠生于营养菌丝上,又称二级菌丝。是一群革兰氏阳性、高(G+C)mol%含量(>55%)的细菌。放线菌因菌落呈放线状而的得名。 放线菌与人类的生产和生活关系极为密切,广泛应用的抗生素约70%是各种放线菌所产生。一些种类的放线菌还能产生各种酶制剂(蛋白酶、淀粉酶、和纤维素酶等)、维生素(B12)和有机酸等。弗兰克菌属(Frankia)为非豆科木本植物根瘤中有固氮能力的内共生菌。此外,放线菌还可用于甾体转化、烃类发酵、石油脱蜡和污水处理等方面。少数放线菌也会对人类构成危害,引起人和动植物病害。因此,放线菌与人类关系密切,在医药工业上有重要意义。 放线菌在自然界分布广泛,主要以孢子或菌丝状态存在于土壤、空气和水中,尤其是含水量低、有机物丰富、呈中性或微碱性的土壤中数量最多。放线菌只是形态上的分类,属于细菌界放线菌门。土壤特有的泥腥味,主要是放线菌的代谢产物所致。它是一个原核生物类群,主要以孢子繁殖,其次是断裂生殖。与一般细菌一样,多为腐生,少数寄生。 2 放线菌的培养基 高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基,高氏一号培养基:碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO3、NaCl、 K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O作为无机盐,FeSO4?7H2O作为微生物的微量元素,提供铁离子等组成。 高氏一号合成培养基需要K2HPO4?3H2O 0.125g,可溶性淀粉5g,硝酸钾 0.25,MgSO4?7H2O 0.125g,FeSO4?7H2O 0.025g,氯化钠0.125g,琼脂5g,水250ml。配制时,先依次加入上述药品(除琼脂外)顺序溶解,加入无菌水至250ml,调节pH=7.4,再加入琼脂不断搅拌震荡至溶化后, 121℃灭菌20分钟。 3 土壤中放线菌的分离 编号,分装取6套无菌平皿,在皿底贴上标签,注明土壤稀释液的稀释度(10-3、10-4、10-5)。每个稀释度做两个培养皿。然后在每皿中倒入已溶化并冷凝至50℃左右的高氏一号培养基15~20ml左右,待冷凝成平板。另取5支盛有9ml一只盛有10ml无菌水的试管,排列于试管架上,依次标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。 稀释倾注分离称1g土样放入10ml无菌水试管中振荡10min,即10-1的土壤悬液,静置30s。用无菌吸管无菌操作取10-1浓度的土壤悬液1ml并加入编号10-2的无菌试管中,并吹吸吸管2~3次,吸时伸入管底,吹时离开水面,使其混合均匀。即为10-2浓度的土壤稀释液。依此类推,直到稀释至10-5的试管中(每个稀释度换1支无菌吸管)。 4 倒平板分离培养 于上述盛有不同稀释度菌液的培养皿中,倒入溶化后冷却至45℃左右的高氏培养基约

几种真菌的分离与鉴定教学文案

常见真菌的分离与鉴定 病原真菌的一般特性 真菌(Fungi)是微生物中的一个大类,是一群数目庞大的细胞生物,估计全世界已有记载的真菌有10万种以上。它们的子实体小者用显微镜才能见到,大者可达数十厘米,它们共同特征是具有真正的细胞核,产生孢子和不含叶绿素,以寄生或腐生等方式吸取养料,仅少数类群为单细胞,其他都有分支或不分支的丝状体,能进行有性或无性繁殖,具有纤维素(或其他葡聚糖)或几丁质的微纤维或两者兼有的细胞壁的有机体。对人类和动物致病的真菌大约100余种,属于病原真菌。 一、基本性状 (一)形态结构 真菌分单细胞真菌与多细胞真菌两大类,前者属于酵母菌(yeast)一般呈球形或卵圆形,后者称为霉菌(mold)或丝状真菌,呈丝状分枝,菌丝交织象绒球状,另有一些真菌可因寄生环境及培养条件(养料、温度、氧气等)的不同可交替出现两种形态,即在室温中呈霉菌型,在37℃或体内呈单细胞的酵母型,这类真菌有双相性,所以称之为双态真菌或二相真菌。 真菌的细胞结构与一般植物细胞相似,有定型的细胞核及完善的细胞器,但胞壁与细菌胞壁不同,不含粘肽而是由角质及葡聚糖组成,也含有脂多糖蛋白质,其中酵母菌及类酵母菌皆以出芽增殖,不生长真菌丝,革兰氏染色呈阳性,丝状真菌分菌丝及孢子两部分,形态多种多样,分述如下。 1.菌丝(Hypha)真菌在合适的环境中,由孢子生出嫩芽,称为芽管。芽管逐渐延长呈丝状,称菌丝。菌丝继续生长并生长分枝,增殖的菌丝交织组成菌丝体。其中一部分菌丝深入被寄生的物体或培养基中吸取养料,称为营养菌丝体。另一部分菌丝向空间生长,称为气生菌丝体。气生菌丝体能产生孢子者称为生殖菌丝体。菌丝中各个细胞间有明显分隔者,称为有隔菌丝。主要见于病原性真菌。很多非病原真菌的菌丝无明显分隔,称为无隔菌丝。有些菌丝可呈各种特殊形式,如球拍状、破梳状、螺旋状、结节状、关节状、鹿角状、假菌丝。 2.孢子生成孢子是真菌扩大繁殖的一种方式。真菌孢子的抵抗力、形态及作用等均与细菌芽胞不同,分为无性孢子及有性孢子两大类。不经过两性细胞的结合而形成的孢子叫无性孢子,这一繁殖过程称为无性繁殖。常见的无性孢子有5种:关节孢子、厚壁孢子、孢子囊孢子、芽孢和分生孢子。病原真菌属于不完全菌纲,很少产生有性孢子,大多数是无性孢子。 (1)厚壁孢子:当真菌在不利环境中,由菌丝内胞浆缩浓和胞壁增厚而成,呈圆形。当环境好转时可生成芽管成长为菌丝。

细菌真菌放线菌培养基配方

。 细菌培养基:肉膏蛋白胨培养基是一种广泛用于培养细菌的一. 培养基,肉膏蛋白胨培养基的主要成分是牛肉膏、蛋白胨和NaCl。 肉膏蛋白胨培养基 1.药品比例: 牛肉膏3g,蛋白胨10g,Nacl5g,琼脂15~20g,水1000mL, PH7.4~7.6 2.实验器材: 牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡

萄糖、孟加拉红、链霉素、 1mol/L NaOH、lmol/L HCl、KNO、NaCl、K HPO·3HO、MgSO·7HO、222434 FeSO·7HO、4.5mL 无菌水6 管,10%酚液,49.5mL 无菌水( 带玻璃珠)124 瓶。土壤样品、试管、培养皿、移液管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、称量纸、牛角匙、pH试纸、棉花、报纸、记号笔、线绳、纱布、酒清灯。电炉、高压蒸气灭菌锅、超净工作台 . 3.配置方法 (1)称药品:按实际用量计算后,按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯中称量,用热水溶解后倒入大烧杯。蛋白胨极易吸潮,故称量时要迅速。 (2)加热溶解:在烧杯中加入少于所需要的水量,然后放在石棉网上,小火加热,并用玻棒搅拌,待药品完全溶解后再补充水分至.

所需量。若配制固体培养基,则将称好的琼脂放入己溶解的药品中, 再加热融化,此过程中,需不断搅拌,以防琼脂糊底或溢出,最后补 足所失的水分。 (3)调pH:检测培养基的pH,若pH 偏酸,可滴加lmol/L NaOH,边加边搅拌,并随时用pH试纸检测,直至达到所需pH 范围。若偏碱,则用lmol/L HCl 进行调节。pH 的调节通常放在加琼脂之前。应注意 pH值不要调过头,以免回调而影响培养基内各离子的浓度。 (4)过滤:液体培养基可用滤纸过滤,固体培养基可用4 层纱 布趁热过滤,以利培养的观察。但是供一般

细菌真菌放线菌培养基配方

。 一.细菌培养基:肉膏蛋白胨培养基是一种广泛用于培养细菌的培养基,肉膏蛋白胨培养基的主要成分是牛肉膏、蛋白胨和NaCl。 肉膏蛋白胨培养基 1. ~7.6 2. 、 6管,10% 3. (1 速。 (2)加热溶解:在烧杯中加入少于所需要的水量,然后放在石棉网上,小火加热,并用玻棒搅拌,待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基,则将称好的琼脂放入己溶解的药品中,再加热融化,此过程中,需不断搅拌,以防琼脂糊底或溢出,最后补足所失的水分。 (3)调pH:检测培养基的pH,若pH偏酸,可滴加lmol/LNaOH,边加边搅拌,并随时用pH试纸检测,直至达到所需pH范围。若偏碱,则用lmol/LHCl进行调节。

pH的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH值不要调过头,以免回调而影响培养基内各离子的浓度。 (4)过滤:液体培养基可用滤纸过滤,固体培养基可用4层纱布趁热过滤,以利培养的观察。但是供一般使用的培养基,这步可省略。 (5)分装:按实验要求,可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。 分装量:固体培养基约为试管高度的l/5,灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以 (6 (7 (8 (9 (10)无菌检查:将灭菌的培养基放入37℃温箱中培养24~48h,无菌生长即可使用,或贮存于冰箱或清洁的橱内,备用。 二.放线菌培养基:高氏合成一号培养基是一种用于培养放线菌的合成培养基,培养基中的可溶性淀粉作为碳源和能源,KNO3作为氮源,K2HP04、MgSO4和FeS04作为无机盐等

高氏合成一号培养基 1.药品比例: 可溶性淀粉20g NaCI 0.5g KNO31g K2HPO4 MgSO4 FeSO4 琼脂 水 pH 2. 3. 成分,并依次溶化,对微量成分FeSO4.7H2O可先配成高浓度的贮备 液,按比例换算后再加入。待所有试剂完全溶解后,补充水分到所需的总体积。 配制固体培养基时,将称好的琼脂放入已溶的试剂中,在加热融化,最后补充所损失的水分。 (2)、调pH

土壤中拮抗放线菌的筛选与鉴定

土壤中拮抗放线菌的筛选与鉴定 一、培养基 1 放线菌培养基 高氏一号液体培养基:可溶性淀粉20g,KNO3 1g,K2HPO4 0.5g,NaCl 0.5g,MgSO4.7H2O 0.5g,FeSO4·7H2O 0.01g,H2O 1000mL,pH 7.2~7.4。 黄豆粉固体培养基:大豆粉20g(沸水煮30min,过滤保留滤液),蔗糖10g,可溶性淀粉5g,蛋白胨2g,酵母膏2g,NaCl 2g,CaCO31g,MgSO4·7H2O 0.5g,KH2PO40.5g,琼脂15g,H2O 1000mL,初始pH7.0。 放线菌发酵培养基:大豆粉20g(沸水煮30min,纱布过滤后保留滤液),蔗糖10g,可溶性淀粉5g,蛋白胨2g,酵母膏2g,NaCl2g,CaCO31g,MgSO4·7H2O 0.5g,KH2PO40.5g,H2O 1000mL,初始pH7.0。 2 放线菌形态及培养特征研究用培养基 察氏培养基(ISP1):蔗糖30g,NaNO32.0g,K2HPO41.0g,MgSO4.7H2O 0.5g,KCl 0.5g,FeSO4·7H2O 0.01g,H2O 1000mL,pH 7.2~7.4。 麦芽膏-酵母膏培养基(ISP2):酵母膏4.0g,葡萄糖4.0g,麦芽膏10.0g,微量盐溶液1mL,H2O 1000mL,琼脂20g,pH 7.0~7.4。 燕麦片培养基(ISP3):燕麦片20g(加1000mL 水煮20 分钟,然后用离心或过滤得澄清滤液并补足1000mL),微量盐溶液1mL,pH 7.2(微量盐溶液:FeSO4.7H2O 0.1g,MnCl2.4H2O 0.1g,ZnSO4.7H2O 0.1g,H2O 100mL)。 甘油-天门冬酰胺培养基(ISP5):L-天门冬酰胺1.0g,甘油10.0g,K2HPO41g,微量盐溶液1mL,琼脂20g,pH 7.0~7.4。 无机盐淀粉培养基:可溶性淀粉10g,K2HPO41.0g,MgSO4.7H2O 1.0g,CaCO32.0g,(NH4)2SO42.0g,微量盐溶液1mL,H2O 1000mL,pH 7.4。 马铃薯培养基:去皮马铃薯块200g(1000 毫升水,80℃煮1小时,然后离心或过滤得上清液),葡萄糖20g,pH 7.4。 营养琼脂培养基:蛋白胨10g,牛肉膏5.0g,H2O 1000mL,pH 7.4(亦可补加葡萄糖10g)。 葡萄糖-天门冬酰胺培养基:葡萄糖10g,L-天门冬酰胺0.5g,K2HPO40.5g,牛肉膏2g,H2O 1000mL,pH 7.2。 3 测定生理生化特性供试培养基 淀粉水解测定培养基:可溶性淀粉10g,K2HPO45.65g,NaCl 0.5g,KNO31g,MgCO31g,琼脂15g,H2O 1000mL,pH 7.2~7.4。 纤维素水解培养基:MgSO4.7H2O 0.5g,NaCl 0.5g,K2HPO40.5g,KNO31g,H2O1000mL。滤纸条(5cm×0.8cm)灭菌20 分钟。(pH7.0~7.2) 明胶液化培养基:蛋白胨5g,葡萄糖20g,明胶200g,H2O 1000mL,明胶灭菌10min,pH7.0(灭菌3 次,每次20min,灭菌后立即浸入冷水中冷却。) 牛奶凝固与胨化培养基:脱脂牛奶1000mL,CaCO30.02g,pH 7.2~7.4,间歇灭菌三次(脱脂牛奶的制备:取新鲜牛奶,煮沸后冷却,经两次离心(3000r/min,10min)脱脂,除去上层油脂,即得脱脂牛奶)。 石蕊溶液配制:称取2.5g 石蕊浸泡在100ml 蒸馏水中过夜,使石蕊充分溶解,然后过滤备用。石蕊牛奶的制备:2.5%的石蕊液与脱脂牛奶以4:100(V/V)比例混合,牛奶呈紫丁香色,分装于试管中,灭菌备用。接种前抽检灭菌是否彻底。

放线菌抗生素的发酵及目的产物的提取实验报告要点

放线菌抗生素的发酵及目的产物的提取 一、实验目的 1、熟悉掌握土壤中分离抗生素及培养方法 2、了解和掌握种子制备和摇瓶发酵技术和方法 3、了解抗生素发酵的一般规律和代谢调控理论 4、了解小型发酵罐的基本结构 5、熟悉掌握小型发酵罐的使用方法和保养 6.掌握抗生素生物效价测定的原理和方法; 7. 掌握管碟法测定抗生素生物效价相关的操作方法。 8.掌握放线菌次级代谢物的初步纯化及牛津杯实验的基本原理和操作技术 二、实验原理 ①发酵罐是进行液体发酵的特殊设备。生产上使用的发酵罐容积大,均用钢板或不锈钢板制成;供实验室使用的小型发酵罐,其容积可从约lL至数百升或稍大些。一般来说,5L以下是用耐压玻璃制作罐体,5L以上用不锈钢板或钢板制作罐体。发酵罐配备有控制器和各种电极,可以自动地调控试验所需要的培养条件,是微生物学、遗传工程、医药工业等科学研究所必需的设备。 ②抗生素(antibiotics)是由微生物(包括细菌、真菌、放线菌属)或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物,能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。现

临床常用的抗生素有转基因工程菌培养液液中提取物以及用化学方法合成或半合成的化合物。 ③放线菌发酵结束后,次级代谢物可能与菌体结合,工业上常采用草酸或磷酸等酸化剂处理,释放与菌体结合的次级代谢物,并采用加热发酵液70 ℃,2 min使蛋白凝固,所得酸性滤液,在经碱处理,进一步去除蛋白。 抗生素的效价常采用微生物学方法测定,它是利用抗生素对特定的微生物具有抗菌活性的原理来测定抗生素效价的方法,如管碟法。管碟法是目前抗生素效价测定的国际通用方法,我国药典也采用此法。管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用,比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管(内径6.0±0.l mm,外径8.0±0.l mm,高10±0. lmm),管内放人标准品和检品的溶液,经16~18小时恒温培养,当抗生素在菌层培养基中扩散时,会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度,即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此,当抗生素浓度达到或高于MIC(最低抑制浓度)时,试验菌就被抑制而不能繁殖,从而呈现透明的无菌生长的区域,常呈圆形,称为抑菌圈。根据扩散定律的推导,抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系,比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小,可计算出抗生素的效价。 常用的管碟法有:一剂量法、二剂量法、三剂量法。后二法已经列入药典。二剂量法系将抗生素标准品和供试品各稀释成一定浓度比

放线菌的选择培养基

高氏一号合成培养基的制备、土壤中放线菌的分离 实验材料: 培养基成分:可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O、琼脂。 实验内容: 高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基,高氏一号培养基:碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO3 、NaCl 、K2HPO4?3H2O 、MgSO4?7H2O作为无机盐,FeSO4?7H2O作为微生物的微量元素,提供铁离子等组成。 放线菌是重要的抗生素产生菌,主要分布在土壤中,其数量仅次于细菌,一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体,为了研究某种微生物,就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来,从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求,常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变,或土壤预先处理(120℃热处理1h),或加入某种抑制剂(如加数滴10%酚等),都可以使细菌,霉菌出现的数量大大减少,从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法,使放线菌在固体培养基上形成单独菌落,并 可得到纯菌株。 实验步骤: 1.高氏一号合成培养基的制备 先将可溶性淀粉称好,在小烧杯内用50~100ml水调成糊状,再在另一容器内加入900~950ml热水,将小烧杯内淀粉倒入混匀。再分别称取其它药品,并加热搅拌使之溶解后,调pH至7.2~7.4,分装,0.1Mpa(15lb/in2)15~30min高压蒸汽灭菌。 2.土壤中放线菌的分离 (1)取9套无菌平皿,在皿底贴上标签,注明土壤稀释液的稀释度(10-3、10-4、10-5)、组别、姓名、操作日期等。每个稀释度做三个培养皿。然后在每皿中倒入已溶化并冷至50℃左右的高氏一号培养基15~20ml左右,待冷凝成平板。 (2)将土样放入用酒精擦拭过的乳钵中,除去石块、草根、研磨压碎后,称取5g,放入盛有45ml无菌水的三角瓶中。振荡10min,即10-1的土壤悬液,静置30s。 (3)另取装有9ml无菌水的试管4支,编号10-2、10-3、10-4、10-5。用无菌吸管无菌操作取10-1浓度的土壤悬液1ml并加入编号10-2的无菌试管中,并吹吸吸管2~3次,使与9ml水混匀,即为10-2浓度的土壤稀释液。依此类推,直到稀释至10-5的试管中(每个稀释度换1 支无菌吸管)。 (4)用无菌吸管从浓度最小稀释液开始,每次吸取0.5ml加到一组相应编号(10-5)的高氏

实验2 土壤中稀有放线菌的分离--土壤样品采集

实验2 土壤中稀有放线菌的分离--土壤样品采集 1 目的 1.1 了解微生物分离和纯化的原理 1.2 掌握常用的分离纯化微生物的方法 2 原理 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件,如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长,而抑制其他微生物生长的环境,从而淘汰一些不需要的微生物。土壤是微生物生活的大本营,它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所,是发掘微生物资源的重要基地,可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。本实验将采用不同的培养基从土壤中分离不同类型的微生物。 3 材料 3.1 培养基 淀粉琼脂培养基(高氏I号培养基),牛肉膏蛋白胨琼脂培养基,马丁氏琼脂培养基,查氏琼脂培养基。 3.2 仪器或其它用具 取样铲、塑料袋、记号笔、 1.布点:按照土壤类型和作物种植品种分布,按土壤肥力高、中、低分别采样。一般150-300亩(不同地区可根据情况确定)采取一个耕层混合样,采样点以锯齿型或蛇型分布,要做到尽量均匀和随机。应用土壤底图确定采样地块和采样点,并在图上标出,确定调查采样路线和方案。 2.采样部位和深度:用取样铲,将表层5cm左右的浮土除去,取5~25cm处的土样0.5-1kg,在采样过程中,采取的混合样一般都大于该重量,所以要去掉部分样品,将所有采样点的样品摊在塑料布上,除去动植物残体、石砾等杂质,将大块的样品整碎,混匀,摊成园形,中间划十字分成四份,然后对角线去掉两份,若样品还多,将样品再混合均匀,再反复进行四分法,直至样品最终重量要求0.5-1公斤(试验用的样品2公斤)为止。如下示意图。一用取土器或锄头直接挖入耕层取样。每个点切取的土块宽度、厚度应 基本一致。装入事先准备好的塑料袋内扎好。北方土壤干燥,可在10~30cm处取样。 3.采样方法、数量:1)面积小,地势平坦,肥力均匀的田块,采用对角采样法。2)面积中等,地势平整,有些肥力差异的田块采用棋盘式采样法。3)面积大,地势又不平坦,肥力不匀的田块采用蛇型线采样法。土样由20个样点组成。样点分布范围不少于3亩(各地可根据情况确定)。每个点的取土深度及重量应均匀一致,土样上层和下层的比例也要相同。采样器应垂直于地面,入土至规定的深度。采样使用不锈钢、木、竹或塑料器具。样品处理、储存等过程不要接触金属器具和橡胶制品,以防污染。每个混合样品一般取1kg左右,如果采集样品太多,可用“四分法”弃去多余土壤。 4.样品编号和档案纪录:做好采样记录:土样编号、采样地点及经纬度、土壤名称、采样深度、采样日期、采样人等。

植物根际土壤中稀有放线菌的选择分离及生物活性-厦门大学学报

doi:10.6043/j.issn.0438-0479.201604056 鹭宁两地植物根际土壤中放线菌的多样性分析及抗菌等生物活性评估 王霏1,黎丹1,黄耀坚1,邓贤明1,吴莹莹2* (1.厦门大学生命科学学院天然产物源靶向药物国家地方联合工程实验室,福建厦门361005;2. 上海市农业科学院食用菌研究所,上海2 01406) 摘要:为探究不同地区植物根际土壤中可培养放线菌的多样性,筛选具有抗菌及抗肿瘤活性的药源菌株,本研究采用改良聚乳酸-明胶和海藻糖-脯氨酸两种培养基,选择分离采自厦门市翔安区香山风景区、南京中山植物园及南京玄武湖公园的17份植物根际土壤样品中的放线菌,并进行16S rRNA基因鉴定、系统发育分析及抗菌、抗肿瘤生物活性测定. 共分离到178株放线菌,其中链霉菌151株,其余27株为稀有放线菌,占总数的15.2%. 稀有放线菌包含9个属:微杆菌属(Microbacterium)、拟无枝菌酸菌属(Amycolatopsis)、韩国生工菌属(Kribbella)、野野村氏菌属(Nonomuraea)、小单孢菌属(Micromonospora)、链孢囊菌属(Streptosporangium)、拟孢囊菌属(Kibdelosporangium)、纤维微菌属(Cellulosimicrobium)和栖白蚁菌属(Isoptericola),包含2株新种. 对分离得到的所有放线菌进行液体小量发酵,并测定其发酵粗提物的抗菌和抗肿瘤活性. 结果显示,所测定的178株放线菌中,有82株对一种或多种指示菌表现出抗菌活性,占供测菌株的46.1%;有60株对一种或多种肿瘤细胞具有抑制作用,占供测菌株的33.7%. 研究结果表明植物根际土壤中放线菌资源丰富,其中抗菌和抗肿瘤活性显著的菌株可为后续微生物药物研发提供有利资源. 关键词:放线菌;选择分离;系统分析;活性测定 中图分类号:Q 939 文献标志码:A 放线菌是天然药物的重要来源,目前临床及农业上使用的抗生素中,超过60%是放线菌产生的[1]. 自1944年美国放线菌学家Walksman[2]从灰色链霉菌(Streptomyces griseus)中发现链霉素以来,大量新型抗生素被陆续从放线菌中分离得到,其中大部来自链霉菌,约占自然界来源抗生素总数的45%,另有16% 来自非链霉菌属的放线菌[3]. 随着对链霉菌资源的

放线菌抗生素的发酵及目的产物的提取实验报告

放线菌抗生素得发酵及目得产物得提取 一、实验目得 1、熟悉掌握土壤中分离抗生素及培养方法 2、了解与掌握种子制备与摇瓶发酵技术与方法 3、了解抗生素发酵得一般规律与代谢调控理论 4、了解小型发酵罐得基本结构 5、熟悉掌握小型发酵罐得使用方法与保养 6。掌握抗生素生物效价测定得原理与方法; 7. 掌握管碟法测定抗生素生物效价相关得操作方法、 8、掌握放线菌次级代谢物得初步纯化及牛津杯实验得基本原理与操作技术 二、实验原理 ①发酵罐就是进行液体发酵得特殊设备。生产上使用得发酵罐容积大,均用钢板或不锈钢板制成;供实验室使用得小型发酵罐,其容积可从约lL至数百升或稍大些。一般来说,5L以下就是用耐压玻璃制作罐体,5L以上用不锈钢板或钢板制作罐体。发酵罐配备有控制器与各种电极,可以自动地调控试验所需要得培养条件,就是微生物学、遗传工程、医药工业等科学研究所必需得设备、 ②抗生素(antibiotics)就是由微生物(包括细菌、真菌、放线菌属)或高等动植物在生活过程中所产生得具有抗病原体或其它活性得一类次级代谢产物,能干扰其她生活细胞发育功能得化学物质。现临床常用得抗生素有转基因工程菌培养液液中提取物以及用化学

方法合成或半合成得化合物。 ③放线菌发酵结束后,次级代谢物可能与菌体结合,工业上常采用草酸或磷酸等酸化剂处理,释放与菌体结合得次级代谢物,并采用加热发酵液70 ℃,2 min使蛋白凝固,所得酸性滤液,在经碱处理,进一步去除蛋白、 抗生素得效价常采用微生物学方法测定,它就是利用抗生素对特定得微生物具有抗菌活性得原理来测定抗生素效价得方法,如管碟法。管碟法就是目前抗生素效价测定得国际通用方法,我国药典也采用此法。管碟法就是根据抗生素在琼脂平板培养基中得扩散渗透作用,比较标准品与检品两者对试验菌得抑菌圈大小来测定供试品得效价。管碟法得基本原理就是在含有高度敏感性试验菌得琼脂平板上放置小钢管(内径6。0±0、l mm,外径8、0±0。l mm,高10±0。lmm),管内放人标准品与检品得溶液,经16~18小时恒温培养,当抗生素在菌层培养基中扩散时,会形成抗生素浓度由高到低得自然梯度,即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此,当抗生素浓度达到或高于MIC(最低抑制浓度)时,试验菌就被抑制而不能繁殖,从而呈现透明得无菌生长得区域,常呈圆形,称为抑菌圈。根据扩散定律得推导,抗生素总量得对数值与抑菌圈直径得平方成线性关系,比较抗生素标准品与检品得抑菌圈大小,可计算出抗生素得效价、 常用得管碟法有:一剂量法、二剂量法、三剂量法。后二法已经列入药典。二剂量法系将抗生素标准品与供试品各稀释成一定浓度比例(2:1或4:1)得两种溶液,在同一平板上比较其抗药活性,再根据

放线菌酮

放线菌酮, 环己酰亚胺。通过干扰蛋白质合成过程中的移位步骤而阻碍翻译过程。常用来抑制生物体外真核细胞的蛋白质合成,通过将放线菌酮去除可以很快地取消它的作用。 推荐用DMSO溶解cycloheximide,配制成100毫克/毫升。具体要根据实验要求。 after transfection and after 5 hr ofcycloheximide (50 ug/ml) treatment following 16 hr of expression 拼音:fangxianjuntong 英文名称:actidione 说明:由产生放线菌酮的放线菌发酵液中提得的一种抗生素。无色晶体。熔点119~121℃。易溶于甲醇、乙醇和丙酮,微溶于水。耐酸、耐热。在碱性情况下易分解。对酵母菌、霉菌、原虫等病原菌等有抑制作用。对

细菌无显著抑制作用。农业上,用于防治樱桃叶斑病、樱花穿孔病、桃树菌核病、橡树立枯病、薄荷及松树的疱锈病、甘薯黑疤病、菊花黑星病和玫瑰的霉病等。此外,也是鼠类、兔子、狗熊、野猪等的忌避剂。也可由链霉素、制霉菌素等发酵液中的副产物制得。 性状无色片状结晶。2℃时溶解度(g/100ml):水中2.1,乙酸戊酯7.0。溶于氯仿、乙醇、乙醚、丙酮和甲醇。 熔点119.5-121℃(115-116℃),比旋光度[α]D25 +6.8?(c=2,水中),[α]D29+3.38?(c=9.47,甲醇中)。有毒,半数致死量(小鼠,静脉)150mg/kg。有刺激性。 放线菌酮是一种在真核生物中对蛋白质生物合成过程有抑制效应的 化合物,它是灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的一种产物。它通过干扰蛋白质合成过程中的易位步骤而阻碍翻译过程。在生物药学研究中放线菌酮常被用来抑制生物体外真核细胞的蛋白质合成。这个方法非常有效、快速和廉价。而且通过将放线菌酮从试管中去除掉可以很快地取消它的作用。 由于放线菌酮拥有非常强烈的毒性,包括损害DNA、导致畸形胎儿和其它对繁殖过程的效应(包括出生障碍和对精子的毒性),它一般只被用在体外的研究应用中,它不适宜在人体内作为抗菌素使用。过去在农业中它被用来作为杀真菌剂,但是由于对它的危险性的认识不断提高这个用法已经很少了。 碱可以破坏放线菌酮,因此假如工作台面或者容器被放线菌酮污染后只要使用无害的碱溶液(比如肥皂)洗就可以了。

病原菌的分离鉴定及其疫苗的制备

一、实验目的 熟悉水产细菌性病原的分离、培养、纯化与鉴定的基本方法,了解所分离细菌性病原的形态特征及培养特点,了解细菌性灭活疫苗制备的基本过程。 二、实验材料 患白内障病虎纹蛙(或其他患细菌性疾病的水产动物)、健康虎纹蛙、脑膜炎败血黄杆菌(虎纹蛙白内障病的病原) 三、实验药品、用具 2216E 琼脂平板、 2216E 琼脂斜面、福尔马林、无菌蒸馏水、生理盐水、磷酸缓冲液、接种环、解剖刀、剪刀、镊子、滴管、纱布、白瓷盘、酒精棉球、灭菌试管、 96 孔板、注射器、酒精灯、离心机(包括离心管)、水族箱、记号笔 四、实验操作程序 (一)病原菌的分离与鉴定 1 .培养基的制备 ( 1 )普通肉汤培养基: 按以下剂量称取各种试剂(先称取盐类再称蛋白胨及牛肉膏),置于铝锅或搪瓷缸中。 牛肉膏 5g 磷酸氢二钾 1g 蛋白胨 10g 蒸馏水 1000ml 氯化钠 5g pH 7 . 4 ~ 7 . 6 初配好的培养基呈酸性故要用 NaOH 调整。将 pH 测定后的肉汤培养基用滤纸过滤,将过滤好的肉汤分装试管、盐水瓶、三角烧瓶等容器,待灭菌。 ( 2 )普通营养琼脂培养基 普通肉汤 1000ml

琼脂 20g 琼脂是由海藻中提取得一种多糖类物质,对病原性细菌无营养作用,但在水中加温可融化,冷却后可凝固。在液体培养基中加入琼脂 1 . 5 ~ 2 %即可固定培养基,如加入 0 . 3 ~ 0 . 5 %则成半固体培养基。 将称好的琼脂加到普容肉汤中,加热煮沸,待琼脂完全融化后,将 pH 调至 7 . 4 ~ 7 . 6 。琼脂融化过程中需不断搅拌,并控制火力,不使培养基溢出或烧焦,并注意补充蒸发掉的水份。 加热溶解好的培养基可用滤纸进行过滤,固体培养基要用 4 层纱布趁热过滤(切勿使培养基凝固在纱布上),之后按实验要求,将配制好的培养基分装入试管或三角瓶中,包扎好待灭菌,将培养基置于高压蒸汽锅内,121 ℃ 灭菌 15 ~ 30min ,趁热将试管口一端搁在玻棒上,使之有一定斜度,凝固后即成普通琼脂斜面,也可直立,凝固后即成高层琼脂。 盐水瓶中的普通琼脂以手掌感触,若将瓶紧握手中觉得烫手,但仍能握持者,此即为倾倒平皿的合适温度( 50 ~60 ℃ ),每只灭菌培养皿倒入约 15 ~ 20ml ,将皿盖盖上,并将培养皿于桌面上轻轻回转,使培养基平铺于皿底,即成普通琼脂平板。 培养基中的某种成分,如血清、糖类、尿素、氨基酸等在高温下易于分解、变性,故应过滤除菌,再按规定的量加入培养基中。 2 .病原菌的分离与培养 分离病原菌的材料要求是具有典型患病症状的活的或刚死不久的患病生物,病原菌的分离方法如下。 体表分离:先将病灶部位表面用 70% 酒精酒精棉球擦拭消毒或取病灶部分小片或用经酒精灯灼烧的解剖刀烫烧消毒,再用接种环刮取病灶深部组织或直接挑取部分深部患病组织,接种于普通肉汤培养基增菌或直接在普通琼脂平板上划线分离。 内部组织器官:用 70 %酒精浸过的纱布覆盖体表或用酒精棉球擦拭,进行体表消毒,无菌打开病鱼的腹腔,以肝、肠、心脏等脏器为材料,先将拟分离病原的部位表面用 70% 酒精棉球擦拭或用经火焰上灼烧

病原菌的分离鉴定

竭诚为您提供优质文档/双击可除 病原菌的分离鉴定 篇一:常见病原菌采样分离过程 金黄色葡萄球菌采样分离过程 1、样本采集及初步分离 (1)奶样的采集: 采集有乳房炎和隐形乳房炎症状较明显的奶牛,消毒挤奶人手、奶牛乳头,弃2-3把乳,以乳样收集管无菌收集每个乳区乳样10-30mL,编好编号,4个乳区按:左前LF、左后Lh、右前RF、右后Rh编号,采集后尽快返回实验室,如不能尽快返回,应放在低温环境中带回。 (2)乳房皮肤拭子 用0.5mL肉汤润湿的消毒棉球拭子从乳房皮肤檫拭到乳头顶端,如果乳房土较多的话先檫掉土。拭子放入5mL离心管中,再放入冰盒中,迅速带回实验室处理。 (3)鼻腔拭子 用消毒棉球拭子插入动物鼻腔中,取出后放到盛有 0.5mL肉汤的5mL离心管中,放入冰盒中,迅速带回实验室

处理。 菌种的初步分离 首次分离时,用接种环蘸取样品在科玛嘉金黄色葡萄球菌显色平板上涂布接种,37℃,16-18小时培养后,从显色平板上挑取红色的单菌落,用脑心浸液(bhI)肉汤35℃培养18小时左右。 需要注意的是金葡菌初次分离时,接种显色培养基后培养时间最好不超过18h进行观察,因为超过24h后所有的葡萄球菌属细菌皆会导致显色培养基变色,进而出现假阳性。 2、菌种的保存 2mL灭菌离心管中加入400μL新鲜菌液+200μL60%灭菌甘油,-80℃(长期)或-20℃(临时)冻存。 3、菌种的复苏 如需再次纯化,或进行进一步实验,可将甘油保种的菌液在显色平板或哥伦比亚血琼脂平板上划线培养,或者将保种的菌液直接接入液体培养基培养。 肠球菌采样分离过程 1、样本采集及初步分离 (1)肛门拭子 以灭菌长棉签采集猪肛门拭子或蘸取新鲜粪便,棉拭子应以捻转方式插入肛门4-5厘米深,取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中,如不能立即接种,应放于低温环境中迅

放线菌的分离

实验五:土壤中放线菌的分离 实验学时:5学时 实验类型:验证性实验、综合性实验 实验要求:必修 一、实验目的 从土壤中分离、纯化放线菌;初步掌握药用微生物的分离纯化方法和操作技术。了解不同生境条件中土壤放线菌的种类与数量。 二、实验内容 筛选放线菌永远是新抗生素研究的课题之一。迄今为止,已发现的抗生素约有80%来自于放线菌。土壤中放线菌最丰富,品种齐全。通常情况下,放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。随着地理分布、植被及土壤性质的不同,放线菌的种类、数量和拮抗性也各不相同。从堆肥或过热的材料中如干草或蔗渣中可分离到大量的嗜热放线菌,从淡水和海洋环境中可分离到嗜碱性的和嗜酸性的菌种。土壤中含有的放线菌主要是链霉菌,人们通常将除链霉菌以外的其它放线菌统称为稀有放线菌,如小单孢菌、游动放线菌、诺卡氏菌等,它们是生物活性物质重要的产生菌。但往往由于样品中稀有放线菌的数量太少,常规的分离方法很难得到。 对样品进行风干、干热处理、培养基添加重铬酸钾等方法可以减少细菌和真菌的数量,以提高放线菌的获得率。用干热和苯酚处理可减少链霉菌数量和比例的方法,可以分离得到更多种类的放线菌。 土壤中分离放线菌的方法很多,其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等,本实验主要采用稀释法来获得放线菌。 注:从土壤中分出的放线菌要进一步鉴别是否为抗生菌。首先应根据筛选目的确定试验模型,然后利用培养基平板进行拮抗性测定。常用的方法有琼脂块法和滤纸片法。其主要依据是扩散原理,即观察在抗生菌周围是否会出现明显的抑菌圈。抑菌圈的大小和透明度则表明了该菌株抗菌活性的强弱。 三、实验原理、方法和手段 原理一:稀释涂布平板法;如图1。 原理二:对样品进行风干、干热处理以减少细菌和真菌的数量; 原理三:向培养基添加适量的重铬酸钾能抑制其他细菌、真菌的生长,但不

肠道致病菌的分离与鉴定

肠道致病菌的分离与鉴定 一、实验目的 (1)掌握肠道致病菌的分离、鉴定的主要步骤 (2)掌握平板划线分离法 (3)掌握玻片凝集试验的操作方法以及实际意义 二、实验材料 (1)实验仪器:试管、玻片、酒精灯、接种针、接种环、试管架、(2)实验试剂:生理盐水、细菌培养基、伤寒诊断血清、伊红美蓝培养基(EMB)、克氏双糖铁培养基(KIA)、葡萄糖发酵管、乳糖发酵管、甘露醇发酵管、尿素培养基、蛋白胨水、半固体培养基 三、实验流程 (1)肠道致病菌的分离 ①待测标本的制作:把接种环放置于点燃的酒精灯火焰处对其进行灭菌,用已灭菌的接种环在细菌培养基中取少量待测细菌于盛有5ml生理盐水的试管中,混匀。 ②细菌的分离接种:用接种环取适量配置好的细菌悬液,在酒精灯附近进行划线分离法接种细菌于EMB培养基。将培养基置于37℃培养18~24小时。 (2)肠道致病菌的纯化 ①单菌落接种:从已培养待测细菌的EMB培养基上用已灭菌的接种针挑取某单个菌落接种到KIA培养基上,一部分直接深入培养基中底部,一部分直接涂抹于斜面处,置于37℃培养18~24小时。 ②待测细菌的初步判断:取出已纯化培养待测细菌的KIA培养基,观察现象,初步断定该细菌是致病菌或是非致病菌。

(3)肠道致病菌的鉴定 ①生化鉴定:分别取葡萄糖、乳糖、甘露醇发酵管各一只(注意管内的小倒管则应充满液体,不含气泡),用已灭菌的接种针取已培养的KIA培养基上的培养物接种于各发酵管,将各发酵管于37℃培养18~24小时。取出并观察记录现象。(注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌) ②动力检查:用已灭菌的接种针取KIA培养基上的培养物分别接种于蛋白胨水、尿素培养基、半固体培养基中,将各个培养基于37℃培养18~24小时。取出后将靛基质(吲哚)加入到蛋白胨水培养基中,并观察记录现象。(注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌) ③血清学鉴定:取洁净玻片一张,将其用蜡笔分为两格,两边各取生理盐水一滴,再用已灭菌的接种环分别取KIA培养基上的培养物加入两格中,与生理盐水混匀不摊开。(注意每次使用接种环前都应用酒精灯火焰进行灭菌)然后在第二格中滴入一滴伤寒诊断血清,混匀不摊开,轻轻摇动玻片,经1~2min观察两格中有无凝集现象。注:本实验涉及细菌接种都应在无菌条件下进行,由于条件有限,因而可在燃烧的酒精灯附近进行实验操作。 四、实验结果与分析 (1)EMB培养基现象与分析: ①培养基下部呈现黑色现象,上部培养基仍为红色,培养基斜面有细菌明显蔓延生长。 ②分析:培养基下部出现黑色现象,说明该细菌能够分解培养基中的物质并产出硫化氢气体,由于培养基中含铁,因而硫化氢能够与其

一株放线菌的发酵培养及产物分析[毕业作品]

中文摘要 天然产物的作用越来越大,天然产物的来源主要是植物和微生物。现在微生物的研究发展迅速,而放线菌作用尤为突出。本文的实验材料为放线菌,放线菌数量巨大种类繁多,在众多领域发挥着新颖独特不可取代的地位,长久以来在药学、化学、生物学等领域占有及其重要的研究价值,放线菌的应用潜力是我们无法想象到的,至今为止从放线菌中提取出的生物活性物质多于13700种,应用于各个领域发挥作用。 本文通过一系列的分离技术对发酵液进行分离纯化,最终对得到的活性物质进行结构鉴定。分离纯化得到的化合物样品的结构鉴定主要运用氢谱(1H-NMR)技术与质谱(EI-MS)技术。最后经过质谱和核磁共振波谱鉴定出了两种化合物的结构和分子量,经过数据分析和文献比对,最终确定了这两种化合物的名称分别是:1-Hydroxyphenazine和Resistomycin。 关键词:放线菌发酵分离纯化结构鉴定

ABSTRACT The natural products in modern society have an increasingly important role.The source of natural products is plants and microorganisms.Microbiological research and development is particularly rapid development.Actinomycetes contribute very much to natural products.The experimental material of this paper is actinomycetes.The large number of actinomycetes in a wide range of areas play a unique and irreplaceable position in many fields and have long been in the field of pharmacy, chemistry, biology and other important research value.The potential of application of actinomycetes is something we can not imagine.So far more than 13,700 species bio-active substances extracted from the actinomycetes are applied to play a role in various fields. The theoretical basis of this paper is natural product chemistry.The related technical methods are microbial fermentation technology, organic solvent extraction technology and column chromatography separation technology.Firstly,the ctinomycetes are expanded to ferment.Then,The fermentation broth is separated and purified.At last,the structure of the obtained active substance is identified.The step of separation of extracts and the completion of the purification was carried out primarily by reverse phase chromatography, Seghadex LH-20, and thin layer chromatography.Finally, the structure and molecular weight of the two compounds were identified by mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. The final definition of these two compounds were 1-Hydroxyphenazine and Resistomycin according to the data analysis and literature comparison. Keywords:Actinomycetes;ferment;isolation and purification; structure identification

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