免疫细胞化学在辅助浆膜腔积液细胞病理学诊断中的应用
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李香菊综述潘秦镜审校
(中国医学科学院协和医科大学肿瘤医院病理科北京100021)
=摘要>免疫细胞化学是辅助浆膜腔积液细胞病理学鉴别诊断良恶性细胞的主要手段。腺癌细胞敏感抗体有
B7213、Ber-EP4、MOC-31等;间皮细胞敏感抗体有calretinin、thrombomodulin、HB ME-1等。最理想的标本制备方法是石
蜡包埋法。
=中图分类号>R392131R36113=文献标识码>A=文章编号>1007-8096(2003)01-0045-04
良、恶性浆膜腔积液的主要诊断方法是细胞病理学检查,细胞病理学诊断恶性浆膜腔积液的敏感度为50%~ 78%112。诊断的主要困难是转移性腺癌细胞与间皮源性细胞的鉴别,因为两者在形态学上常有交叉12-52。组织化学染色曾作为辅助鉴别诊断的手段,但因其敏感性及特异性不高,已逐渐被淘汰162。电镜作为辅助诊断手段有一定作用,但因为间皮瘤超微结构特征不恒定,而且电镜标本制作过程复杂、设备昂贵,限制了其应用16,72。也有学者尝试用DNA 影像定量分析(IC M)和流式细胞检查(FC M)辅助细胞病理学鉴别诊断18,92,但因DNA含量正常的肿瘤不能被检出而影响了诊断的敏感性。
近10年来,随着免疫学方法的不断完善以及抗原纯化和抗体制备技术的提高,免疫细胞化学成为辅助细胞病理学鉴别诊断良、恶性浆膜腔积液的主要方法。开始采用的是上皮源性抗体,通常采取对原发部位不同的腺癌敏感性及特异性不同的一组抗体组合应用11,2,5,10,112。近年来,出现了一些间皮源性抗体,随之出现了这类抗体与上皮源性抗体的组合应用,这样可以双重互补,得到正反两方面的证实。因采用的抗体来源、细胞学标本处理方法以及观察判断方法不同,其敏感性和特异性也不尽相同12,3,12,132。以下介绍常用的抗体及应用情况,并简单介绍免疫细胞化学常用的细胞学标本制备方法。
1常用抗体
111腺癌细胞敏感抗体
11111CEA是分子质量为180kDa的糖蛋白,最初发现于胚胎性结肠和结肠癌中,后来发现在多种腺癌尤其是原发于胃肠道和胰腺的腺癌均有表达,但在浆液性腺癌中低表达(<40%)16,72。在间皮瘤和增生性间皮细胞中不表达或低表达162。CEA抗体是最早应用于浆膜腔积液鉴别诊断的抗体之一,其阳性反应表现为胞质着色或胞质、胞膜均着色1102。文献报道,应用CE A抗体的敏感性差异很大(40%~ 9414%)13-5,10,11,142。差异的主要原因是抗体类型不同,单克隆抗体敏感性低而特异性高,多克隆抗体则敏感性高而特异性低。Shield等1112将多克隆CEA抗体和2种单克隆CEA抗体(AE7、A5B7)分别应用于浆膜腔积液的鉴别诊断,前者的敏感性是69%,而后者的敏感性分别为52%和21%。CEA抗体可与坏死组织、巨噬细胞尤其是中性粒细胞中的非特异性交叉抗原(NCA)反应,使背景着色,影响结果判断,文献报道其假阳性率为5%~15%1152。
11112B7213是以人乳腺癌细胞膜免疫小鼠产生的单克隆抗体,能识别大分子量糖蛋白TAG-72。TAG-72除存在于乳腺癌外还广泛存在于多种不同来源的腺癌,如肺、胃肠道、胰腺和卵巢以及正常分泌期的子宫内膜。阳性反应表现形式多样,可以是胞质局灶性或弥散分布的颗粒状着色,也可以是胞膜着色。间皮细胞不表达111,142,间皮瘤中低表达(< 15%)152。B7213较早应用于浆膜腔积液免疫细胞化学研究。多项研究显示B7213有很高的特异性(9111%~100%),敏感性差异较大(3417%~87%)15,11,14,152。Shield等1112将B7213、多克隆CEA和其他5种抗体应用于153例经石蜡包埋方法处理的胸腹水标本中,结果发现,B7213与多克隆CEA有互补作用,1/3CEA阴性的转移性腺癌病例B7213阳性。Delahaye等152报道B7213与Ber-EP4也可互补。近年来有报道研制出一种与B7213类似的抗体TAC-72,其在80%以上的乳腺癌呈阳性反应1162。
11113Ber-EP4是单克隆抗体,由MCF-7乳腺癌细胞系免疫小鼠产生,可以识别分子质量为34kDa和39kDa的糖蛋白,这两种糖蛋白以非共价健结合,存在于人类大部分上皮细胞胞膜和胞质(除表层鳞状上皮和肝细胞外)。虽然文献报道Ber-EP4用于区别腺癌和间皮瘤阳性率差异较大,在腺癌为32%~100%,而在间皮瘤为0%~8715%,但大部分研究支持Ber-EP4是现今可得到的对腺癌较特异的抗体162。阳性反应常表现为强弥散的胞质、胞膜着色1102;而间皮瘤则是少量细胞弱的局灶性胞质着色。浆膜腔积液研究显示腺癌的阳性率是32%~100%,而间皮瘤和增生的间皮细胞阳性率仅为0%~215%13-5,11,14,15,17,182。一个大样本浆膜腔积液研究(103例腺癌和129例良性浆膜腔积液)显示,腺癌的阳性率是83%,其中卵巢癌93%,胃肠道癌88%,肺癌81%,乳腺癌73%1182。Ber-E P4的敏感性与标本的固定方法有关,多项研究报道福尔马林固定的细胞块敏感性较高115,17,182。11114MOC-31是单克隆抗体,能与分子质量为38kDa的
糖蛋白反应,此种糖蛋白存在于大多数正常和恶性上皮细胞13,62。阳性反应表现为胞膜着色,一般不产生背景反应。浆膜腔积液研究报道,MOC-31对腺癌的敏感性为76%~ 100%,特异性为9219%~100%13,5,6,102。对乳腺癌报道的敏感性差异较大,为4711%~100%15,102。在间皮源性细胞很少有反应13,6,72,阳性反应仅发生在少数病例的个别细胞,表现为局灶性着色。
11115其他敏感抗体CD15最初认为是霍奇金病(HD)的特异性标志,后来发现在非霍奇金淋巴瘤和多种腺癌中均有表达11,6,112。但此抗体在腺癌中的反应常是局灶性的,且常产生背景反应,所以在浆膜腔积液研究中敏感性较低(24% ~7819%)14,6,112。E MA广泛存在于正常和肿瘤上皮细胞,但在实际应用中,因着色类型极难判断,应用受到限制。E-cadherin是跨膜糖蛋白cadherin的一种,在上皮源性细胞中有表达,但浆膜腔积液研究结论不一致13,13,192,原因可能是所用标本处理方法不同。B G8在腺癌中常高表达,而间皮源性细胞不表达,但相关文献不多。CA19-9、CA15-3和TTF-1仅在特定部位的腺癌表达。C A19-9在胃肠道、胰腺和卵巢常有高表达,C A15-3则在乳腺癌高表达。新近组织学研究显示, TTF-1在肺癌和甲状腺癌中高表达,但尚无此抗体应用于检测浆膜腔积液的报道。
112间皮源性细胞敏感抗体
11211calretinin是近年出现的一种新抗体,它是分子质量为29kDa的神经特异性钙结合蛋白,除在中枢和外周神经系统表达外,还可表达于非神经组织细胞,包括间皮源性细胞。阳性反应表现为胞质、胞核着色,有/无胞膜着色,有胞膜着色者即所谓/煎蛋0样改变1202。也可表现为胞膜着色或强而弥散的胞质着色1122。calretinin在腺癌细胞不表达或表现为局灶性弱的胞质着色。近日有报道,结肠癌尤其是低分化结肠癌有calretinin表达121,222。自1996年开始有文献相继报道多克隆calretinin抗体用于鉴别间皮瘤和腺癌,但报道的敏感性和特异性有差异112,13,19-21,232。随着抗体的纯化,calretinin 抗体在鉴别腺癌和间皮源性细胞中的价值越来越多的被证实。组织学研究显示,calretinin抗体对间皮瘤的敏感性是92%~100%,有极少数腺癌病例显示弱阳性反应1232。浆膜腔积液研究与组织学研究结果相似,对间皮瘤和间皮增生的敏感性分别为88%~100%和92%~100%112,13,20,212。11212thrombomodulin是分子质量为75kDa的糖蛋白,存在于内皮和间皮细胞、滋养膜细胞、变移细胞和滑膜细胞等16,242。阳性反应表现为胞质和/或胞膜着色。组织学研究报道thrombomodulin对间皮瘤有较高的特异性,但敏感性差异较大162。浆膜腔积液研究显示,thrombomodulin在间皮瘤和腺癌中均有较高的表达,阳性率分别为67%~100%和18% ~53%13,23,242。能表达thrombomodulin的腺癌主要来自肺(37%)和肾(50%),来自其他部位的腺癌很少表达1232。11213其他敏感抗体间皮细胞抗体(HB ME-1)来自人恶性上皮型间皮瘤细胞悬液。在实际应用中,腺癌、间皮瘤和增生性间皮细胞对HB ME-1反应表现类型有交叉,因此限制了其在鉴别诊断中的应用16,72。CD44S(CD44H)为分子质量85 ~90kDa的跨膜糖蛋白,是透明质酸的受体162。组织学研究显示在间皮源性细胞中高表达,在肺癌中低表达。但CD44抗体在浆膜腔积液中应用较少,其实际应用价值需要进一步研究。近年有文献报道CK5/6在间皮瘤高表达,在腺癌不表达或低表达19,232。目前尚无浆膜腔积液的相关报道。
113其他抗体在浆膜腔积液研究中常用的抗体还有p53、bc-l2和c-erbB-2。有人认为应用此类抗体有助于鉴别良恶性细胞,但所报道的结果不一致,效果尚不能肯定。
2抗体的组合运用
抗体的相对特异性和一种抗原在同一种肿瘤以及不同肿瘤间的异源性表达,使得仅用一种抗体辅助诊断易产生误差,选用几种适当的抗体组合应用可使诊断的敏感性和特异性提高。通常选用3种或3种以上抗体组合,也有用2种抗体组合。以下将浆膜腔积液研究中应用较多的抗体组合归纳如下。
有报道CEA、CD15和Ber-EP4抗体组合敏感性和特异性均很高11,172。Grove等1172分别研究了三者单独、两者联用和三者联用的敏感性和特异性,发现CEA与CD15二者联用也取得了很好的效果,敏感性和特异性分别达到100%和8211%。Dejmek等142将CE A、vi mentin、Ber-EP4、CAM512、Leu-M1和E MA6种抗体应用于53例腺癌、36例间皮瘤和24例反应性改变,认为CEA、Ber-EP4和EMA(胞膜反应)抗体联合应用较有效。Gupta等1252将CEA、EMA、B7213、vi mentin和LCA 等11种抗体用于22例恶性心包积液中,发现CEA和B7213组合诊断转移性腺癌敏感性高。Shield等1112用CEA和B7213组合并结合PASd染色,也取得了敏感性83%、特异性100%的好效果。Delahaye等152研究发现,Ber-EP4和B7213组合有较好的互补作用,两者结合对腺癌诊断的敏感性可达94%,而单用一种抗体的敏感性仅为7814%和7713%。Davidson 等1142用Ber-EP4、B7213和BG8辅助诊断妇科恶性肿瘤,敏感性达95%。Patrica等122认为,用Ber-EP4、B7213、CA19-9和calretinin组合效果最佳。Maria等132将HBME-1、thrombomodulin、calretinin、MOC-31、Ber-EP4、E-cadherin、CD15和CE A8种抗体应用于44例浆膜腔积液中,发现最佳组合是HBME-1、thrombomodulin、MOC-31、Ber-EP4和CD15。Habashi 等1262用细胞学诊断87例浆膜腔积液敏感性是65%,而加入p53、B7213和c-erbB-2敏感性提高到98%。Kitazume等1132认为用E-cadherin和calretinin组合效果好。Nagel等1122将calretinin和Ber-EP4应用于42例恶性和65例反应性浆膜腔积液也取得了良好的效果。但也有报道一些抗体组合效果不明显,如CEA、Ber-E P4和MOC-31组合及C A19-9、HB ME-1和thrombomodulin组合等110,202。
3用于免疫细胞化学分析的细胞学标本制备方法
浆膜腔积液免疫细胞化学结果差异较显著,差异产生的
一个重要原因是采用的细胞学标本制备方法不同。常用的标本制备方法有直接涂片法、微量标本涂片(cytospin)法、液基薄层细胞涂片(thinPrep)法和细胞块石蜡包埋法。直接涂片和微量标本涂片由于涂片中存在大量蛋白液、血液和细胞碎片,常会出现高背景着色,而且由于蛋白质聚集在细胞周围,阻止免疫试剂进入细胞12,262。加之这两种标本制作方法易产生三维结构的大细胞团,免疫试剂可能被包裹其中,导致假阳性反应12,26,272。thinPrep涂片制作过程中的标本保存液可以溶解血和黏液,减少背景着色12,4,26,28,292。并且一个标本可同时获得多张涂片,便于进行多种检测。但有发现thinPrep保存液中含甲醇,使部分抗原(主要是淋巴类抗原)损伤12,272。多数研究者认为,细胞块石蜡包埋法是较理想的免疫细胞化学标本处理方法12,27,302。在石蜡切片中背景着色低,结果易于判断,并可同时制作多张切片,以利于抗体组合应用。
综上所述,免疫细胞化学辅助浆膜腔积液细胞病理学诊断的有效抗体是B7213、Ber-E P4、MOC-31和calretinin,它们的组合应用有双重互补作用。采取石蜡包埋法处理标本,并将以上几种抗体组合应用能取得较好的效果。但免疫细胞化学的研究方法还需要进一步标准化。
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(收稿日期2002-06-10)
中耳腔绿色瘤1例
杜江刘红刚(首都医科大学附属北京同仁医院北京100730)
=中图分类号>R739161=文献标识码>B=文章编号>1007-8096(2003)01-0048-01
患儿女性,1岁3个月。上呼吸道感染后左耳流少量黄色渗出液2周,以/乳突炎0治疗后渗出消失,但继发左侧面瘫4天。C T示中耳、鼓室、乳突腔内均为软组织密度影,并破坏周围骨组织。手术见左耳面神经水平段、水平半规管处有骨折和肉芽组织。
病理检查巨检:灰褐色软组织多块,质脆,016cm@ 015cm@014cm大小。镜检:小圆形肿瘤细胞密集浸润,肿瘤间质少,瘤细胞形状不规则,有两种类型,其一胞质空亮,肾形核或带弯曲的杆状核,核仁明显,核膜薄;另一种胞质红染,核圆,偏于一侧,可见核仁(图1)。PAS染色部分瘤细胞胞质内可见粉染颗粒(图2)。免疫组化:瘤细胞膜CD99(+) (图3),髓过氧化物酶(+)(图4),S-100蛋白、溶菌酶、CD34、NSE、Chg-A、LCA和NF均为(-)。
病理诊断:左中耳腔粒细胞肉瘤。
7个月后该患儿于北京市儿童医院经骨髓穿刺诊断为粒细胞性白血病。
讨论白血病细胞大多呈弥散性浸润,一般不形成肿块,但有时原粒细胞浸润骨膜(好发于眼眶骨膜下)、硬脑膜等处可聚集形成肿块,称原粒细胞瘤112。由于原粒细胞瘤的白血病细胞含髓过氧化物酶,使肿块呈绿色,故又名绿色瘤。肿瘤暴露于空气中因氧化而迅速褪色,置于甘油中可短期保持绿色。1853年由King提出并用来描述组织中的绿色肿瘤,称为绿色瘤。
儿童绿色瘤发生率最高,75%发生在10岁左右,男孩比女孩易患122。急粒中该瘤的发生率是慢粒的5倍,白血病尸检病例中8%可检出此瘤。此肿瘤绝大多数见于M1(急性粒细胞白血病未分化型)和M2(急性粒细胞白血病部分分化型),少数见于M4(急性粒-单核细胞白血病)和M5(急性单核细胞白血病)。绿色瘤可继发于白血病,也可作为白血病的首发症状132,后者通常于绿色瘤发生后1~6个月出现白血病全身症状(本例初诊时末梢血象未见白血病改变)。也有一类患者仅有绿色瘤,终生不患白血病。
绿色瘤常侵及颅骨及其他具有造血功能的扁骨,有时也侵及皮肤、乳房、外阴、鼻旁窦等处。它通常发生于骨髓,经过哈弗管达骨膜。当发生在颅骨及面骨时,易于扩散至眼球、邻近软组织、淋巴结、鼻旁窦及硬膜外。脑实质的绿色瘤很少见,可能是沿血管外膜周围的硬膜扩散而来122。此肿瘤虽易侵及扁骨,但骨X线检查大多阴性。C T可有阳性发现。MRI定位、定量的诊断价值是肯定的,在定性方面需要与硬膜外血肿及其他转移瘤鉴别142。绿色瘤氯醋酸脂酶染色及细胞髓过氧化物酶抗体标记阳性,髓细胞单克隆抗体荧光染色也可为阳性。最近文献报道其CD99阳性率为55%152,本例亦为阳性。
应与恶性淋巴瘤、骨尤文瘤、小细胞神经内分泌瘤及神经母细胞瘤鉴别。
(本文图1~3见插页第15页)
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(收稿日期2002-05-25)
免疫组织化学(傅琦博)-免疫组织化学
免疫组织化学 傅琦博 引言 酶工程是生物工程的重要组成部分，近几十年来，随着研究手段的更新和技术水平的提高，产生了一门以研究酶在细胞内的存在及其动态，以阐明组织细胞的结构和功能为主要内容的科学——酶组织化学。酶组织化学是利用酶化学反应的产物可在光学显微镜或电子显微镜下被识别的特性，借以从形态学角度判定酶在组织细胞内的存在的部位的一门技术，其基础是组织化学。它具有将形态学、生物化学和生理学联系起来的特点，在生物学、生物化学、医学生物领域内日益发挥着重要的作用。研究组织细胞内特定酶分布的酶组织化学方法大致分为：（1）利用酶的活性反映的方法；（2）利用抗原抗体反应（免疫应答）证实酶的存在部位的方法。后者也被称之为免疫组织化学。 免疫组织化学概述 免疫组织化学简称免疫组化，是应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分，进行原位的定性、定位或定量的研究。这种技术称为免疫组织化学技术。免疫组化是利用抗体与抗原的结合具有高度特异性的特点，采用一直的抗体检测组织或细胞的抗原物质，以期确定组织或细胞是否存在未知抗原，并进行定性、定位或定量的研究。抗原与抗体结合形成的免疫复合物是无色的，故必须借助组织化学方法，将抗体抗原反应部位显示出来。它的主要研究方法是免疫组织染色法（简称免疫染色法），食用该方法检测细胞内物质，必须具备两个条件：①作为检测对象的物质须具有抗原性，能制作出与之相应的特异、高效价的抗体；②在免疫反应发生之前，目标物质要保持抗原性，同时还要保持在组织细胞内的稳定状态。要检测抗原，就要用与之相应的抗体进行免疫反应，同时要用可视的标记标出抗原或抗体，采用这种方法的免疫染色法称为标识抗体法或标识抗原法，常用的表示抗体法有直接法、间接法、补体结合法以及多重染色法等。直接法是标识要检出的抗原的抗体，然后进行反应的方法，其特异性高，但检出的敏感度不如间接法，标识抗体的食用范围手局限。间接法是以未标识的第一抗体进行反应，接着标识以第一抗体为抗原所制作的抗体（即第二抗体）进行重叠反应，间接的证明抗原，这种方法的缺点是容易出现非特异性反应，但敏感度较高，标识抗体的用途也广；补体结合法是将间接法中的第二抗体作为标识抗补体抗体食用；多重染色法则是在同一标本上检出多种抗原物质的方法，可以用反复进行的重复标记的直接法，也可以用酶标记的重复进行的间接法。此外，还有后标识抗体的免疫染色法，此法先采用未标识的抗体进行反应，反应结束后，通过免疫化学反应或其他化学反应，用适当的标记物质来识别已与组织细胞内抗原发生结合的抗体。 免疫组织化学技术的发展 免疫组织化学技术是形态学研究领域一门新兴方法学。自它问世以来发展迅猛,用“日新月异”一词形容它毫不过分。酶标免疫组织化学技术是由Nakane 等人于60 年代末期创立的最早的免疫酶组织化学技术,之后Sternberger 等人于70 年代初期便在此基础上建立了非标记抗体酶法(又称间接法) 和PAP 法(过氧化酶抗过氧化酶法) 。80 年代初期美籍华人Hsu 又建立了卵白素生物素复合物法(ABC法) ,自此之后,免疫金银染色法、免疫电镜等技术相继问世。80 年代末期人们又发现链霉菌抗生物素蛋白(或译成链霉菌亲合素,St reptavidin) 与生物素结合力极强,遂用它标记过氧化酶建立起了SP 法,或称LSAB 法(链霉菌亲合素生物素过氧化酶法) 。由于链霉菌亲合素不与人组织中的内源性生物素起非特异性结合反应,故背景染色更加清晰,且敏感性比ABC 法高4～8 倍,比PAP 法高8～16 倍。进入90 年代,免疫组织化学又向基因水平深入发展,与分子生物学技术的结合日益紧密。如原位杂交后信 号的放大与显示便是采用了免疫组织化学显色技术,因而又可称之为原位杂交免疫组织化学技术。而图象分析、流式细胞仪的运用，是免疫细胞化学定量分析技术提高到更精确的水平。现就该技术的发展及其应用作一概述。 1利用免疫荧光标记技术可以分辨出标记抗原抗体所在的位置及其性质, 并可利用荧光定量技术计算抗原(或抗体) 的含量, 以达到对定性、定位、定量测定的目的[2 ]。如黄祥瑞等人(1999) 利用免疫荧光细胞化学技术研究西藏环状病毒细胞生物学特性和敏感细胞范围(CPE) , 成功地观察到该病毒的细胞病变效应特异荧光发生的部位、细胞数量和病毒的形态发生。辛德毕斯热是由辛德毕斯病毒Sindbis V irus (SiN ) 引起的人兽共患虫媒病毒病, 1974 年南非发生辛德毕斯热大流行。1991年梁国栋等通
免疫细胞化学常用试剂介绍.
免疫细胞化学常用试剂介绍 一、固定剂 大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。 目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。 1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3） 试剂：多聚甲醛40g 0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml 配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。 该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。 2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠 试剂：A液：多聚甲醛40g 蒸馏水400ml B液：Na2HPO4·2H2O16.88g 蒸馏水300ml C液：NaOH 3.86g 蒸馏水200m 配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1n NaOH或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存备用。 该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5%～1%。该固定剂较温和，适于组织的长期保存。组织标本于该固定液中，4℃冰箱保存数月仍可获得满意的染色效果。 3．Bouin’s液及改良Bouin’s液 试剂：饱和苦味酸 40%甲醛250ml 冰醋酸50ml 配制方法：先将饱苦味酸过滤，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后存于4℃冰箱中备用。冰醋酸最好在临用前加入。改良Bouin’s液即不加冰醋酸。
免疫细胞化学与图像分析
免疫细胞化学与图像分析 在细胞生物学中，一个常见的问题是如何获取与细胞功能相关的各种定量测量信息。在免疫细胞化学中也存在同样的问题。制作免疫细胞化学标本环节较多，只要有一个环节失误就会影响实验结果，除了需要精制的药品外，还需要熟练的技术。那么，做成了理想的标本后，如何进行观察，才能获得尽量多的的各种定量信息，而且使这些信息能较客观的反映出来，这就是本章的编写目的。 一、定量分析的重要性 目前有许多研究免疫细胞化学的文章，是做定性和定位研究的。如有文献中提到，P物质在脑组织中存在于30处以上，这只是解决了定性定位问题，这些部位含P物质的量是否相同？可否用快速简便的方法对细胞内免疫反应产物的量进行分析？从而可进行比较。所谓反应产物的“量”包括颜色深浅，其所占的长度或面积等，就要借助于图像分析仪（image analyzer）了。 以往我们对免疫细胞化学或一般组织化学光镜标本的观察，对反应产物的量常用“+”号表示，一般可分为0～+++，共五个等级，这种方法对差别较大的标本当然还是可以用的，但存在以下三方面的问题：①同一张标本，不同的观察者可以得到出不同的结论，因为这种分级没有明确的客观标准；②即使同一张标本同一个观察者，间隔若干天后进行再次观察时，可能结论也不一样的；③最后一点也是最重要的一点，人的视觉是有一定限制的，用一般观察法实际上已经丢失掉了许多可贵的信息，因为你察觉不到实际上存在的较小的差异。因此我们力求有一个客观的比较精密的标准。除了常用的仪器如显微分光光度计(microspe ctrophotometer)和显微密度计（microdensitometer）等以外，还可用图像分析仪进行测量。前二者已有许多有关著作中介绍过，就其精确与灵敏来说都是够的，但却不能同时测出标本中某些成分的面积、体积或长度等其他极有用的参数。图像分析仪的分析广度则要大得多，并能明显地提高工作效率，所得到的各种数据可通过分析仪上的计算机进行统计学处理，只要将各种统计学公式输入计算机，选择其中你所采用的公式，即可快速得出分析结果，告诉你有无显著性差异。 二、图像分析仪简介 图像分析仪又称图像分析系统（image analysis system），主要用来解决如何客观地较精确地用数字来表达存在于标本中的各种信息，可称为数学形态学。它已经成为一种公认的科学研究工具，并且逐渐展现出巨大的潜能。图像中包含着极其丰富的内容，是人们从客观世界中获得信息的重要手段，因此，正确地测量和处理图像已成为测量技术中的重要课题，并广泛应用于航空遥感测量、金属图像测量、微电子技术
免疫组织化学技术(ABC法)
免疫组织化学技术（ABCxx） 大鼠脊髓冰冻切片或细胞爬片依次入含3%Triton-x100 和 0.03%H 2O 2的 0.01%磷酸盐缓冲液（PBS, pH 7.4 ），室温30min ;含3%牛血清白蛋白（BSA, Sigma的PBS室温30 min; 豚鼠抗HAP1抗体（1:300）, 4C孵育48h; PBS漂洗3次，每次10min;生物素化羊抗豚鼠IgG（1:200）室温2小时；PBS漂洗3次，每次10min; ABC复合物（1:100）, 2小时；PBS漂洗3次，每次10min ;含 0.03%DAB 和 0.006%H 2O 2 的Tris 盐酸缓冲液（pH 7.6）室温13mi n;常规脱水、透明、树脂封片，显微镜观察、拍照。以上免疫染色以PBS缓冲液替代一抗作阴性对照。 鞘内注射HAP1-siRNA后大鼠脊髓HAP1表达水平的变化。A示对照组大鼠脊髓背角HAP1免疫反应性，B示RNAi组大鼠脊髓背角HAP1免疫反应性强度减弱。C示RNAi后大鼠脊髓HAP1表达水平的免疫印迹检测。D示RNAi后大鼠脊髓背角免疫反应强度变化的统计学分析, *示与对照组比较, P< 0.01。比例尺为100 am。E示RNAi后大鼠脊髓HAP1蛋白含量变化的统计学分析, ▲示与对照组比较, P< 0.01。 免疫荧光双标技术
脊髓切片或生长在盖玻片上的PC12细胞依次入含3%Triton-100的PBS室温30min，含2%正常羊血清(NGS和3%BSA的PBS室温30min,入豚鼠抗HAP1 抗体(1:3000)和兔抗NK1R(1:100) 4C 孵育48h; PBS漂洗 3 次，每次10 min，加入RodamineRed或FITC标记的驴抗豚鼠或兔IgG (1:500),室温闭光2h, PBS闭光漂洗3次，每次10min，含10%甘油的PBS封片。荧光显微镜观察，FITC用488nm 氩氪激光激发，用530-560nm滤光片检测；Rodamine Red用543nm 氩氪激光激发,用570nm 滤光片检测。 HAP1和NK1R在大鼠脊髓背角中的定位关系。A示荧光标记的脊髓灰质背角浅层表达的HAP1, B示荧光标记的脊髓灰质背角浅层表达的NK1R C示A和 B的重叠图像。箭头示HAP1和NK1R双标细胞。 比例尺为20 am。 细胞进行处理后,弃培养基,用 0.01MPBS漂洗3遍。加入4%多聚甲醛固定30min。PBS漂洗3遍。 加入3%Triton-x 100的PBS室温30 min;含2%正常驴血清(NGS和3%BSA 的PBS室温30 min;分别加入小鼠抗MAP2单克隆抗体(1:200, Neuro-Marker 公司)或兔抗mGluR5多克隆抗体(1:1000, sigma公司)或兔抗NSE多克隆抗体 (1: 100,北京中山生物技术公司)4C孵育48h; PBS漂洗3次，每次 10min;入Rodamine Red标记的驴抗兔/小鼠IgG (1:500, Jackson ImmunoResearch Laboratories，室温闭光3h; PBS闭光漂洗3 次，每次10 min;含10%甘油的PBS封片。激光共聚焦显微镜(Olympus FV500观察，EGFP用 488nm氩氪激光激发，用530-560nm滤光片检测；RodamineRed用543nm 氩氪激光激发,用570nm 滤光片检测。
多浆膜腔积液
多浆膜腔积液 多浆膜腔积液是一种常见的临床现象，患者在病程中，同时或相继出现胸腔积液、腹水、心包积液。最常见病因为：恶性肿瘤(31.3%)，其次为结缔组织疾病、结核、肝硬化、心功能不全等。恶性肿瘤导致胸腔积液合并腹水，原发肿瘤多来自卵巢、肝脏及其它消化器官；此时肺癌的可能性很小。结核性积液多见于胸腔积液合并腹水以及胸腔积液合并心包积液的病例；肝硬化几乎仅见于胸腔积液合并腹水的病例；结缔组织疾病在上述4种多浆膜腔积液的组合中都比较常见，尤其多见于三类浆膜腔积液。 多浆膜腔积液是一种常见的临床现象，患者在病程中，同时或相继出现胸腔积液、腹水、心包积液。其发生机制为以下几个方面： 1、感染病原体直接扩散、侵犯到浆膜 2、机体变态反应性增高，而致浆液渗出 3、淋巴引流障碍 4、感染病原体通过淋巴或血行播散到浆膜。 多浆膜腔积液最常见病因为：恶性肿瘤(31.3%)，其次为结缔组织疾病、结核、肝硬化、心功能不全等。积液部位与病因的关系:胸腔积液合并腹水或心包积液时，恶性积液比例很高，约占所有恶性积液的81.5％。恶性肿瘤导致胸腔积液合并腹水，原发肿瘤多来自卵巢、肝脏及其它消化器官；此时肺癌的可能性很小。而对于胸腔积液合并心包积液的患者，应特别注意肺癌，血液系恶性肿瘤也应考虑，而此
时卵巢癌及消化系恶性肿瘤的可能性不大。三浆膜腔积液的病因比较复杂，良性病变占71%，22.6%为结缔组织疾病，而恶性积液占16.1%，其次为缩窄性心包炎及心功能不全。结核性积液多见于胸腔积液合并腹水以及胸腔积液合并心包积液的病例；肝硬化几乎仅见于胸腔积液合并腹水的病例；结缔组织疾病在上述4种多浆膜腔积液的组合中都比较常见，尤其多见于三类浆膜腔积液。 恶性肿瘤：导致多浆膜腔积液的恶性肿瘤主要有卵巢癌、肺癌、肝癌及其他消化道肿瘤。主要特点：(1)年龄>40岁，无发热或有低热，体重明显下降，痰中带血，缓慢起病，进行性加重，消耗症状重，治疗效差；(2)顽固性胸痛而且胸液量增多后疼痛不减轻反而加重，胸腔积液合并心包积液或腹水；(3)抗炎、抗痨治疗无效，抽液后积液增长快，量多不易消退；(4)多为渗出液，血性或洗肉水样积液，或初起为草黄色而后转为洗肉水样积液；(5)非化脓性积液表现，且胸水LDH/血清LDH≥3.5；(6)胸水CEA>20ug/L、胸水CEA/血清CEA>1。 结核性积液:主要特点：(1)发病年龄较年轻；(2)有全身中毒症状如乏力、午后低热、消瘦、盗汗等，PPD试验强阳性，起病急，发热常见，多为持续高热；；(3)有结核病密切接触史，积液TB—PCR阳性，抗结核治疗有效者；(4)经胸、腹膜活检或手术探查病理发现上皮细胞、多核巨细胞或有干酪性肉芽肿者；(5)反复多次痰或积液找抗酸杆菌或积液培养出分支杆菌者(6)积液部位出现疼痛；(7)血沉显著增快；(8)渗出液；(9)黄色积液；(10)抗痨及局部注射激素、抗痨药效好。（注意：结核性积液与恶性积液在症状、体征、积液的各种性状上仍
6.浆膜腔积液检查Word版
浆膜腔积液检查 目录 1.浆膜腔积液检查的临床意义 2.浆膜腔积液标本的采集与处理 3.一般性状检查 4.化学检查 5.显微镜检查 6.微生物学检查 7.漏出液与渗出液的鉴别 复习思考题
1.浆膜腔积液检查的临床意义： 主要用于漏出液与渗出液的鉴别诊断。 2.浆膜腔积液标本的采集与处理 由医师经无菌胸腔、腹腔、心包腔和关节腔穿剌采集。标本分别置于4个无菌试管中，每个试管1～2ml 。第1管：细菌学检查，第2管：化学及免疫学检查，第3管：细胞学检查，第4管：不加抗凝剂，观察有无凝集现象。采集后立即送检，一般不超过1小时。 3.一般性状检查 （一）颜色： 1. 漏出液：多为淡黄色。 2. 渗出液：多为深黄色，因病因不同可呈不同颜色。红色血性：恶性肿瘤、结核性胸膜炎或腹膜炎、出血性疾病和内脏损伤。黄色脓样：化脓性细菌感染。乳白色：淋巴管阻塞。绿色：铜绿假单胞菌感染。 （二）透明度： 1. 漏出液：多清晰透明。
2. 渗出液：常混浊，化脓菌感染时最混浊，可有凝块及絮状物产生，结核菌感染呈微混、云雾状，乳糜液因含大量脂肪也呈浑浊外观。 （三）凝固性： 1. 漏出液，含纤维蛋白很少，一般不易自凝。 2. 渗出液：含较多纤维蛋白原及组织碎片，静置后较易凝结。（四）比密： 1. 漏出液，含蛋白质、细胞成分少，比密常＜1.015。 2. 渗出液：含有较多蛋白质、细胞成分，比密常＞1.018。 4.化学检查 （一）粘蛋白定性试验：1.漏出液：多阴性。 2.渗出液：多阳性。 （二）蛋白质定量： 1.漏出液：蛋白总量多＜25g/l。 2.渗出液：蛋白总量常＞30g/l。 （三）葡萄糖定量：1. 漏出液：与血浆葡萄糖接近。2. 渗出液：较血浆葡萄糖明显降低，以化脓性细菌感染时最低，结核性次之。
免疫组织化学技术题库1-2-10
免疫组织化学技术题 库1-2-10
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]免疫组化技术的优点不包括（）. A.高特异性 B.高敏感性 C.形态学的直观性 D.精确定量分析 E.能对抗原表达情况进行分析 免疫组化技术重要的特点是形态学的直观性，用于抗原表达的定性分析，不能精确定量。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]免疫组织化学技术中，必须保证组织材料（）. A.取材新鲜 B.形态保存良好 C.抗原物质的抗原性不被破坏 D.以上均包括 E.以上均不包括 取材必须新鲜、形态保存良好、抗原性不被破坏。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]免疫细胞组织化学技术包括（）. A.酶免疫组织化学技术 B.荧光免疫组织化学技术 C.亲和素免疫细胞组织化学技术 D.以上均包括 E.以上均不包括 免疫细胞组织化学技术包括以上所有。 (NBA总冠军 https://www.360docs.net/doc/9612374180.html,/)
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]免疫标记电镜技术获得成功的关键是（）. A.对细胞超微结构完好保存 B.保持被检细胞或其亚细胞结构的抗原性不受损失 C.选择的免疫试剂能顺利穿透组织细胞结构与抗原结合 D.以上叙述都正确 E.以上均不正确 上述均为免疫标记电镜的成功关键。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]胶体金是氯金酸在何者的作用下聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态（）. A.还原剂 B.氧化剂 C.变构剂 D.化学物质 E.以上都不对 氯金酸在还原剂如白磷、维生素C等的作用下还原为金颗粒。
免疫组织化学及其应用
免疫组织化学及其应用 浙江大学病理学与法医学研究所 周韧 1．免疫组织化学的历史、现状和发展 1．1．历史 ●人类的历史有多长，医学的历史也就有多长.医学的任何一个进步都是建立在当 时科学与技术发展的相应水平上的. ●医学的目的: 解除人体的病痛 ●核心: 诊断和治疗。 任何疾病的有效治疗均来源于正确的诊断。●疾病的诊断手段准确性，首推病理诊断准确性高，即病理组织学诊断。更准确、 更可信、更有权威性。 ●免疫组织化学（以下简称免疫组化）已成为病理诊断中的一种常用手段。 病理诊断发展过程的主要事件 年代作者事件 1632年 Severino 肿瘤切开后观察的书 1661年 Malpighi 放大镜观察后的报告 1761年 Morgagni 肿瘤与外科方面的书 1829年 Horner 首篇病理论文 1832年Hodgkin 报告7例尸检结果的论文 1858年Virchow 发表《细胞病理学》 1863年 Paget 发表《外科病理学》 1897年 Mallory和Wright 发表组织学技术的书 1914年 Mallory 发表《细胞组织学原则》 1919年 Ewing 发表《肿瘤病》 1924年 McFarland 发表《外科病理学》 1926年 Karsner 发表《人体病理学》 1928年 Papanicolaou 发表细胞学方面的书 1951年电镜应用于病理诊断 1974年免疫组化用于病理诊断 ●诊断病理学开始于19世纪 ●20世纪的第二个25年中达到光学显微镜诊断的辉煌。随之而起的电子显微镜 ●20世纪第三个25年中成为诊断病理的发展高峰。
●进入20世纪最后25年，取而代之的便是免疫组化了。 1．2．免疫组织化学的发展 1．2．1．免疫学的发展 1．2．2．单克隆技术的出现 ●病理诊断的确立：是找到“特征性”形态表现。 常规苏木素伊红（HE）染色 几百种的“特殊染色” ●免疫组织化学产生： 抗原抗体结合原理 ●从组织细胞水平进行抗原抗体反应，于是就了免疫组织化学技术。 主要的发展过程 年代研究者事件 1941年 Coons 实用免疫荧光技术 1948年 Fagraeus 进一步发展免疫荧光技术 1970年 Sternberger 抗体酶标记技术 1974年 Taylor 证实组织中的浆细胞免疫 1975年 Kohler和Milstein 单克隆抗体技术 1981年 Hsu ABC法 90年代以来 SP法，原位杂交及原位PCR免 疫组化法
免疫细胞化学 (abcam新版指南)ICC-IMMUNOCYTOCHEMISTRY
IMMUNOCYTOCHEMISTRY (ICC) General Procedure: i Coat coverslips with polyethylineimine or poly-L-lysine for 1 hr at room temperature. ii Rinse coverslips well with sterile H2O (3 times 5 min each). iii Allow coverslips to dry completely and sterilize them under UV light for at least 4 hrs. iv Grow cells on glass coverslips or prepare cytospin or smear preparation. v Rinse briefly in phosphate-buffered saline (PBS). Fixation: 1. Fix the samples either in ice-cold methanol, acetone (1-10 min) or in 3-4% paraformaldehyde in PBS pH 7.4 for 15 min at room temperature. 2. Wash the samples twice with ice cold PBS. Permeabilization: If the target protein is expressed intracellularly, it is very important to permeabilize the cells. Note: acetone fixed samples do not require permeabilization. 3. Incubate the samples for 10 min with PBS containing 0.25% Triton X-100 (or 100 μM digitonin or 0.5% saponin). Triton X-100 is the most popular detergent for improving the penetration of the antibody. However, it is not appropriate for the use of membrane-associated antigens since it destroys membranes. 4. Wash cells in PBS three times for 5 min. Blocking and Incubation: 5. Incubate cells with 1% BSA in PBST for 30 min to block unspecific binding of the antibodies (alternative blocking solutions are 1% gelatin or 10% serum from the species that the secondary antibody was raised in). 6. Incubate cells in the diluted antibody in 1% BSA in PBST in a humidified chamber for 1 hr at room temperature or overnight at 4°C. 7. Decant the solution and wash the cells three times in PBS, 5 min each wash. 8. Incubate cells with the secondary antibody in 1% BSA for 1 hr at room temperature in dark. 9. Decant the secondary antibody solution and wash three times with PBS for 5 min each in dark. Counter staining: 10. Incubate cells on 0.1-1 μg/ml Hoechst or DAPI (DNA stain) for 1 min. 11. Rinse with PBS. Mounting: 12. Mount coverslip with a drop of mounting medium.
免疫细胞化学技术题库9-2-10
免疫细胞化学技术题 库9-2-10
问题： [单选,A1型题]应用尚无文献报道的抗血清或自己制备的抗血清进行免疫酶组织细胞化学染色时，必须设置的对照是（） A.交叉实验 B.替代实验 C.吸收实验 D.置换实验 E.阳性对照
问题： [单选,A1型题]可引起免疫酶组织化学染色假阳性的是（） A.组织内待检抗原过多 B.内源性过氧化物酶丰富 C.洗液用TBS缓冲液 D.抗体浓度过低 E.抗体特异性高
问题： [单选,A1型题]免疫酶组织化学染色中过氧化氢液的作用是（） A.提高抗原抗体的识别能力 B.减少内源性过氧化酶的活性 C.修复抗原 D.提高敏感性 E.激活抗原 https://www.360docs.net/doc/9612374180.html,/ 月子病
问题： [单选,A1型题]ABC法的基本原理是（） A.利用抗卵白素分别连接卵白素标记的第二抗体和卵白素标记的酶来检测组织和细胞中的抗原 B.利用抗卵白素分别连接卵白素标记的第一抗体和卵白素标记的酶来检测组织和细胞中的抗原 C.利用抗生物素分别连接生物素标记的第二抗体和生物素标记的酶来检测组织和细胞中的抗原 D.利用抗生物素分别连接生物素标记的第一抗体和生物素标记的酶来检测组织和细胞中的抗原 E.利用抗地高辛分别连接生物素标记的第一抗体和生物素标记的酶来检测组织和细胞中的抗原
问题： [单选,A1型题]BRAB法的基本原理是（） A.用生物素标记抗体，然后与生物素和酶形成复合物 B.用生物素分别标记抗体和酶，然后以抗生物素为桥，把两者连接起来 C.用卵白素标记抗体，然后与卵白素和酶形成复合物 D.用卵白素分别标记抗体和酶，然后以抗卵白素为桥，把两者连接起来 E.用亲和素分别标记抗体和酶，然后以抗亲和素为桥，把两者连接起来
浆膜腔积液
实验一浆膜腔积液理学检查 【目的】掌握浆膜腔积液(serous cavity fluid)理学检查的内容和方法。 【原理】因漏出液与渗出液的产生机制不同，故各种体液的颜色、透明度、凝固性等也有不同，可以通过肉眼和感观的方法区别。 【器材】比重计、比重筒。 【标本】浆膜腔穿刺液。 【操作】 1．观察颜色以肉眼观察浆膜腔积液颜色变化。渗出液混浊，可呈深浅不同的黄色、红色、乳白等颜色；漏出液多为淡黄色，稀薄透明，根据观察到的颜色如实描述报告。 2．观察透明度观察时可轻摇标本，以肉眼观察浆膜腔积液透明度的变化。漏出液清晰透明；渗出液可出现不同浊度，如“微浑”、“浑浊”等，根据观察到的透明度如实描述报告。 3．观察凝固性倾斜浆膜腔积液试管，肉眼观察有无凝块形成，结果可根据标本情况不同用“无凝块”、“有凝块”报告，渗出液常有凝块，而漏出液一般无凝固性。 4．测定比密充分混匀的浆膜腔积液缓慢倒入比重筒中，以能悬浮起比重计为宜。将比重计轻轻放入装有浆膜腔积液的筒中并加以捻转，待其静置自由悬浮于浆膜腔积液中(勿使其接触比重筒壁)，读取液体凹面相重合的比重计上的标尺刻度数值并作记录。 【参考值】 1．外观漏出液为浅黄色清晰透明或微混；渗出液为黄色、黄绿色、红色、咖啡色等不同的颜色，混浊。 2．比密漏出液＜1.015；渗出液＞1.015。 【注意事项】 1．器材保持比重计干净、刻度准确，测定比密后，应立即浸泡、清洗干净，以免蛋白质凝固在比重计上，影响准确性。如标本量少，可采用折射仪测定比密。 2. 标本浆膜腔积液标本一般分装在2支试管内送检：一管作细胞学检查，为避免标本凝固引起细胞变性破坏而影响结果，应加100mg/ml乙二胺四乙酸二钠或二钾抗凝，每 0.1ml可抗凝6ml标本；另一管不加抗凝剂，用以观察有无凝固现象。 3．判断结果 （1）当标本颜色或透明度改变不明显或难以观察时，可在试管后以白色或黑色为背景，灯光下仔细观察。 （2）标本呈黄色一般为渗出液，多见炎症性积液，呈云雾状混浊样，甚至呈脓性，凝固性高、比密增
免疫细胞化学技术
免疫细胞化学技术 一、免疫细胞化学技术的概述 *免疫细胞化学(immunocytochemistry, ICC) -是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定细胞内抗原的成分(主要是多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为～。 (一) 对抗原和抗体的要求 *具有特异性高和亲和力强的抗体是实验成功的首要条件。 -对抗体的要求：纯度高、比活性强； *高度特异性抗体的获得，取决于抗原的纯度。 -对抗原的要求：纯度高，免疫原性强，稳定无变化。 (二) 抗原(antigen, Ag) *抗原的概念：凡是在机体内引起体液免疫和(或)细胞免疫反应的物质，称为抗原。抗原具有两个方面的特性： -免疫原性：引起机体产生抗体和(或)致敏淋细胞的特性； -免疫反应性：抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。 *根据抗原是否显示免疫原性分为： -完全抗原：分子量较大，一般在10kDa以上，并具有较复杂的化学组成。 *免疫原性最强的是蛋白质抗原，多糖次之；脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。 -半抗原：又称为不完全抗原，分子量较小。例如：某些短肽、多糖、类脂和药物等。 *半抗原必需与载体结合，才能获得免疫原性。 载体 *通常是具有高度免疫原性的大分子物质，具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。 -常用的载体有钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin，OV A)等。 -用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团-NH2、-COOH等将半抗原结合到载体上。结合比例为5kDa结合5～25个分子的小肽。 （三）抗体(antibody, Ab) 1、抗体的概念： *机体受到抗原刺激后，由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白，被称为抗体。 -抗体主要存在于血清内； -抗体都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗体。 -免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种，既IgG、IgD、IgE、IgA、IgM。 2、免疫组化实验中常用的抗体：单克隆抗体和多克隆抗体。 *单克隆抗体：是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。 -特异性强、抗体产量高。 *多克隆抗体：是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。 -特异性低，会产生抗体的交叉反应。
免疫组织化学及HE染色实验步骤教学文案
免疫组织化学及H E 染色实验步骤
精品资料 免疫组织化学（ immunohistochemistry） 1组织脱水、包埋及切片 （1）将剥离出瘤组织切成合适大小的组织块放于4%多聚甲醛中固定2天，固定时间最长不能超过1个月； （2）将组织块从固定液中取出，PBS漂洗1h，然后开始进行组织脱水，程序如下：70%乙醇浸泡30min—80%乙醇浸泡30min—90%乙醇浸泡30min—95%乙醇I浸泡30min—95%乙醇II浸泡30min—无水乙醇I浸泡30min—无水乙醇II浸泡30min—无水乙醇III浸泡30min—二甲苯I浸泡30min—二甲苯II浸泡 30min； （3）将组织块完全浸泡在蜡液中60℃过夜； （4）打开包埋仪器，设置相应参数，2h后将蜡液中的组织块取出放入包埋机的蜡缸中，将包埋所用铁槽清理干净放入蜡缸，用镊子将组织块放于铁槽正中央，取出铁槽接取少量蜡液使凹槽填满，将包埋盒倒置卡在铁槽上，放于低温工作台上冷却凝固，待其完全凝固后，取下包埋好的蜡块； （5）在切片前，先将蜡块表面修平，切成连续的厚度为5μm的切片，放入冷水中展片，用刀片将连续蜡带分开，然后放入40℃水浴锅中，用防脱载玻片捞出目的蜡带，放入烤片机上过夜，组织切片4℃保存。 2免疫组化染色 （1）首先，用二甲苯脱蜡，然后用梯度酒精和水使切片充分复水，详细流程为：二甲苯I浸泡10min—二甲苯II浸泡10min—无水乙醇I浸泡5min—无水乙醇II浸泡5min—90%乙醇浸泡5min—80%乙醇浸泡5min—自来水冲洗5min； （2）抗原修复：微波炉中火预热配制好的枸橼酸缓冲液3min，将切片浸入修复液内，用微波炉中火加热3min，在此过程中注意不要让修复液溢出，以免切片变干，加热后室温冷却5min，加热冷却过程重复3次，修复完成后自然冷却至室温，用PBS清洗3次，每次5min； （3）滴加适量的3% H2O2覆盖组织，室温孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶的活性，摇床上PBS清洗3次，每次5min； （4）用PBS配制5%的山羊血清，滴加适量至组织上封闭1h； 仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除谢谢2
免疫细胞化学和免疫荧光
免疫细胞化学和免疫荧光 一般步骤： 1. 将盖玻片表面用PEI（聚亚乙基亚胺）或者poly-L-赖氨酸室温处理1h。 2. 盖玻片用无菌水清洗3次，每次5分钟。 3. 盖玻片完全干燥后置于UV紫外下杀菌4h。 4. 将细胞培养于处理的盖玻片上，或者准备细胞离心涂片。 5. 用PBS简单清洗。 6. 洗脱液我们推荐使用含0.1%Tween20的PBS溶液。 固定 细胞可以使用以下两个方法之一固定： 1. 用置于-20°冷冻的100%的甲醇室温处理孵育细胞5分钟。 2. 使用4%的多聚甲醛.PBS固定液（PH:7.40）室温固定10分钟。 细胞用预冷的PBS清洗3次。 抗原修复（可选步骤） 在细胞受到热抗原修复后，一些抗体会更有效。一抗使用时可以查看产品说明书看是否需要抗原修复这一步骤。 1. 预热抗原修复液（100 mM Tris, 5% (w/v) urea, pH 9.5)）至95°C：可以将盛有抗原修 复液的染色缸放于95°C的水浴锅中。 2. 使用一副宽头的镊子，将盖玻片小心的置于盛有抗原修复液的染色缸中，使细胞面朝上。 3. 95°C加热盖玻片10分钟。 4. 将盖玻片从抗原修复液中取出，细胞面朝上置于盛有PBS的6孔板中。 5. 用PBS清洗细胞3次，每次5分钟。 透化（Permeabilization） 若目标蛋白位于细胞内，那么通透细胞就显得尤其的重要。 丙醇固定的样品不需要通透。 1. 将样品置于含0.1-0.25% Triton X-100或者100 μM Digitonin or 0.5% Saponin的PBS 溶液中10分钟。Triton X-100是目前广泛使用的能够提高抗体的渗透能力的去垢剂。 然而，这并不适用于位于膜上的抗原，因为它会损坏膜。 对于每一种感兴趣的蛋白都要选择合适的Triton X-100的浓度。 2. 用PBS清洗细胞3次，每次5分钟。
15.浆膜腔积液检验
浆膜腔积液检验 一、填空题 正常成人胸腔液< 20 ml，腹腔液< 50 ml，心包积液在 10到15 ml，在腔内主要起作用。 二、判断题： 胸水常规检查结果：无色透明，比重1.014，细胞数<100×106/L ，粘蛋白定性试验阴性，表明是渗出液。（） 三、名词解释： 浆膜腔 四、选择题： A型题： 1、某老年胸腔积液患者，胸水常规检查：比重1.020，蛋白定量30g/L,细胞总数100×109/L，白细胞500×106/L，细菌培养阴性，该胸水应考虑是：（D） A、乳糜性胸腔积液 B、化脓性胸腔积液 C、漏出性胸腔积液 D、血性胸腔积液 E、以上都不是 B型题：问题2—5 A、浆膜腔积液中LDH测定达正常的30倍 B、结核性积液LZM含量＞30mg/L，明显高于 C、当积液中ADA＞40u/l应考虑 D、积液中CEA测定<5ug/L E、积液中胆红素定性试验阳性 2、结核性积液（C） 3、化脓性积液（A） 4、良性积液（E） 5、癌性和风湿病性积液 C型题： 问题6—9 A、结核性积液 B、癌性积液 C、两者均有 D、两者均无 6、漏出液（B） 7、草黄色渗出液（C） 8、血性渗出液（C ） 9、乳糜性渗出液（C） X型题： 10、下列哪种疾病腹水为漏出液：（ ABCE ） A、肝硬化 B、肾病综合症 C、胃穿孔 D、重度营养不良 E、丝虫病 11、下列符合渗出液特点是：（ ABC E） A、比重＞1.018 B、粘蛋白定性试验阳性 C、蛋白含量＞30g/L D、细胞总数<100×106/L E、常为草黄色液体 五、问答题： 如何鉴别渗出液与漏出液 【参考答案与题解】 一、填空题： 20ml、50ml、10-50ml，润滑 二、判断题： ×，是漏出液 三、名词解释： 人体的胸腔、腹腔、心包腔统称为浆膜腔，在生理状态下腔内有少量液体，主要起润
免疫组织化学技术
第十三章免疫组织化学技术 第一部分目的要求和教学内容 目的要求：掌握金免疫测定的方法，免疫金银染色的原理、方法，熟悉胶体金和免疫金的特性和制备。 一、免疫胶体金标记原理。 二、免疫胶体金的制备原则：标记要点和影响因素，胶体金标记蛋白的纯化和鉴 定。 三、免疫金（银）染色法：滤纸模型的免疫金（银）染色应用，免疫金（银） 染色技术类型，组织切片的免疫金（银）染色法。 第二部分测试题 一、选择题 （一）A1 型题(标准型) 1 .PAP复合物中的酶是 A.碱性磷酸酶 B.葡萄糖氧化酶 C.辣根过氧化物酶 D.胃蛋白酶 E.胶原酶 2.PAP的特点是几个抗酶抗体和3 个过氧化物酶分子组成复合物，结构非常稳定 A.1 B.2 C.3 D.4 E.6 3.ABC法中的“桥”是指 A.第一抗体 B. 第二抗体 C. 第三抗体 D.亲和素 E.链霉素亲和素 4.双标记荧光免疫法中，如用罗丹明标记A 抗体，呈什么颜色，用异硫氰酸荧光素标记B 抗体，呈什么颜色 A.黄绿色，橘红色 B.橘红色，黄绿色 C.红色，淡黄色 D.淡黄色，红色 E.橙黄色，浅绿色 5. 荧光免疫间接法比直接法荧光增强多少倍，敏感性提高多少倍
A.1—2 B.2—4 C.3—6 D.4—8 E.5—10 6. 胶体金标记蛋白时，待标记蛋白的实际用量是在稳定1ml 胶体金所需蛋白基础上再增加多少 A. 5—10% B. 10—20% C. 20—30% D. 30—40% E. 40—50% 7.铁蛋白是一种含铁多少，相对分子量为650～900KD 的球形蛋白 A.15% B.20% C.25% D.30% E.35% 8.下列哪种方法制备的胶体金是红色 A.枸橼酸三钠 B.白磷 C.维生素C D.乙醇-超声波 E.硼酸钠 9.免疫组化技术的关键步骤是 A.标本处理 B.抗体的处理与保存 C.设立对照试验 D.结果判断 E.免疫染色 10.免疫组化技术的首要试剂是 A.抗原 B.标记物 C.固定剂 D.抗体 E.洗涤液 二、填空题 1.用丙酮做固定剂的抗原是（）；用1%聚甲醛做固定剂的抗原是（）；用10%甲 醛做固定剂的抗原是（）；用95%乙醇做固定剂的抗原是（）；用四氯化磺做固 定剂的抗原是（）。 2.免疫染色对特殊标本的进一步处理常用（）和（）法。 3.免疫组化染色后，阳性细胞的染色分布有三种类型，分别是（）、（）和
免疫细胞化学常用试剂
免疫细胞化学常用试剂 一、固定剂 大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。 目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。 1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3） 试剂：多聚甲醛40g 0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml 配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L 磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。 该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。 2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠 试剂：A液：多聚甲醛40g 蒸馏水400ml B液：Na2HPO4·2H2O16.88g 蒸馏水300ml C液：NaOH 3.86g 蒸馏水200m
配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1n NaOH 或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存备用。 该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5%～1%。该固定剂较温和，适于组织的长期保存。组织标本于该固定液中，4℃冰箱保存数月仍可获得满意的染色效果。 3．Bouin’s液及改良Bouin’s液 试剂：饱和苦味酸 40%甲醛250ml 冰醋酸50ml 配制方法：先将饱苦味酸过滤，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后存于4℃冰箱中备用。冰醋酸最好在临用前加入。改良Bouin’s液即不加冰醋酸。 该固定液为组织学、病理学常用固定剂这一，对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整。但因偏酸（pH为3～3.5），对抗原有一定损害，且组织收缩较明显，故不适于组织标本的长期保存。此外，操作时，应避免吸入或与皮肤接触。 4．Zamb oni’s(Stefanini’s)液 试剂：多聚甲醛20g 饱和苦味酸 150ml Karasson-Schwlt’s PB至1000ml 配制方法：称取多聚甲醛20g，加入饱和苦味酸150ml，加热至60℃左右，持续搅拌使充分溶解、过滤、冷却后，加Karasson-Schwlt’s PB至1000ml充分混合（Karasson –Schwlt’s磷酸缓冲液的配制配制方法见后）。 该固定液适于电镜免疫细胞化学，对超微结构的保存较纯甲醛为优，也适于光镜免疫细胞化学研究，为实验室常用固定剂之一。我们在应用中，常采用2.5%的多聚甲醛和30%的饱和苦味酸，以增加其对组织的穿透力和固定效果，保存更多的组织抗原。固定时间为6～18h。 5．PLP液PLP液即过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液 （Periodate-Lysine-paraform-alde－hyde fixative）