酶的测定方法

酶的测定方法
酶的测定方法

一、脲酶测定(比色法)

1、试剂配制:

(1)pH6.7柠檬酸盐溶液:取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中,另取295g氢氧化钾溶于水,再将两种溶液合并,用1N氢氧化钠将pH调至6.7,并用水稀释至

2L。

(2)苯酚钠溶液:称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中,加2mL甲醇和18.5mL丙酮,后用乙醇稀释至100mL(A液),保存再冰箱中。称取27g氢氧化钠溶于100mL

水中(B液),保存于冰箱中。使用前,取A、B两液各20mL混和,并用蒸馏

水稀释至100mL备用。

(3)次氯酸钠溶液:用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9%,溶液稳定。

(4)10%尿素溶液:10g尿素溶于100mL水中。

(5)N的标准溶液:精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L,则得1mL含0.1mgN 的标液,再将此液稀释10倍制成氮工作液(0.01mg/mL)。

2、操作步骤

称取5g土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15min;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(pH6.7),仔细混匀。在37℃恒温箱中培养24h。然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。取滤液1mL 置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液,加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20min后,将混合物稀释至刻度,在波长578nm处测定吸光值。脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。

标准曲线绘制:分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中,加蒸馏水至20mL,再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液,随加随摇匀,20min后显色,定容。1h内再分光光度计上于578nm处比色。

3、结果计算

以24小时后1g土壤中NH3-N的质量(mg)表示脲酶活性(Ure)

Ure=a·V·n/m

式中:a为由标准曲线求得的NH3-N浓度(mg/mL);V为显色液体积(50mL);n为分取倍数;m为烘干土重(g)。

土壤脲酶活性测定(NH 4+释放量法)

脲酶是酰胺水解酶的一种,在自然界中分布广泛,植物、动物和微生物细胞中均含有此酶。土壤中的脲酶主要来源于微生物和植物。脲酶催化尿素的水解反应:

22232H NCONH +H O 2NH +CO ???→脲酶

在反应过程中,氨基甲酸盐是中间产物。脲酶还能够催化羟基脲、二羟基脲、半卡巴脲等化合物的水解。脲酶含有镍,分子量在151,000 Da ~480,00 Da 之间。能够抑制脲酶活性的化合物有含硼化合物、尿素衍生物、甲醛、原子量大于50的重金属的盐、含氟化合物、醌和多元酚、抗代谢剂、杂环硫醇等。

1. 试验原理

通过对新鲜土壤与尿素溶液在37℃培养2h 后测定氨释放量,估计脲酶的活性 (Tabatabai, 1994)。

2. 试验仪器

50mL 容量瓶;培养箱或恒温水浴;蒸馏定氮仪。

3. 试验试剂(所用试剂均为分析纯)

a. 甲苯(C 6H 5CH 3);

b. 缓冲液:三(羟甲基)氨基甲烷[c (C 2H 8O 3N 3)=0.05mol ·L -1, pH9.0]:称取6.1g 三(羟甲基)氨基甲烷(Tris (hydroxymethyl) aminomethane )溶入700mL 蒸馏水中,用c (H 2SO 4)=0.2mol ·L -1的硫酸溶液调pH 至9.0,再用蒸馏水定容至1000mL;

c. 尿素溶液{c [CO(NH 2)2]=0.2 mol ·L -1}:称取1.2g 尿素溶入约80mL 缓冲液中,后用该缓冲液定容至100mL 。尿素溶液要当天配制,并在4℃下保存备用;

d. 氯化钾硫酸银混合溶液[c (KCl )=2.5mol·L -1]-[ρ(Ag 2SO 4)=100mg·L -1]:先将100mg Ag 2SO 4溶于700mL 蒸馏水中,再加入188g 的KCl (分析纯)使之溶解,在定容至1000mL ;

e. 氧化镁(MgO ):于高温电炉中,将氧化镁在600℃-700℃温度下灼烧2h ,再放置于干燥器中冷却,贮于瓶中;

f. 混合指示剂:溶解0.099g 的溴甲酚绿和0.066g 甲基红于100mL 的乙醇(95%纯度)中;

g. 硼酸指示剂溶液[ρ(H 3BO 3)=20g·L -1]:溶解20g 硼酸于950mL 的热蒸馏水中,冷却,加入20mL 的混合指示剂,充分混匀后,小心滴加氢氧化钠溶液[c (NaOH)=0.1mol·L -1],直至溶液呈红紫色(pH 约4.5),稀释成1L ;

h. 硫酸标准溶液[c (1/2H 2SO 4)=0.005mol ·L -1

]。

4. 试验步骤

将5.00g 新鲜土样(<2mm )放置于50mL 容量瓶中,加入0.2mL 甲苯(试剂a )和9mL 缓冲溶液(试剂b ),轻摇混匀后加入1.0mL 尿素溶液(试剂c ),再次轻摇混匀并塞上瓶塞。在37℃下培养2h 。然后加入约35mL 的KCl-Ag 2SO 4溶液(试剂d ),轻摇容量瓶几秒钟后,放置至室温(约5min ),用KCl-Ag 2SO 4溶液定容,摇匀。同时要仪同样步骤做空白,只是培养2h 后先加35mL 的KCl-Ag 2SO 4溶液,然后加入1.0mL 尿素溶液。

蒸馏法测氨:取土壤悬浮液20mL 至蒸馏瓶中,加入0.2g 的MgO ,用硼酸指示溶液吸收,蒸馏液的体积约为30mL 。用c (1/2H 2SO 4)=0.005 mol ·L -1的H 2SO 4标准溶液滴定。

5. 结果计算 c ts N 1000m k 2ω??????V 14

()=

式中:ω(N )-单位时间内氨态氮的释放量,mg ·kg -1h -1;

c -1/2H 2SO 4标准溶液的浓度,mol ·L -1

V -H 2SO 4标准溶液的体积,mL ;

ts -分取系数,2.5;

14-氮的摩尔质量,mg ·mmol -1;

2-培养时间,2h ;

m -样品质量,g ;

k -水分系数。

6. 注意:

a. 与其他缓冲液(如磷酸盐缓冲液)相比,三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液优点在于它能够有效地防止铵的固定。在配制该缓冲液时必须用硫酸而不是盐酸来调pH ,因为后者能够促进脲酶的活性;

b. 在配制KCl-Ag 2SO 4溶液时,应将KCl 溶于溶解后的Ag 2SO 4溶液中,因为Ag 2SO 4在KCl 溶液中不溶。加入KCl-Ag 2SO 4混合溶液后脲酶的活性停止,因此该悬浮液在测定氨之前可以放置2h 。

方法来源:鲁如坤. 土壤农业化学分析方法. 北京: 中国农业科技出版社, 2000.

二.过氧化氢酶测定(容量法)

1. 分析意义

过氧化氢酶广泛存在于土壤中和生物体内。土壤过氧化氢酶促过氧化氢的分解有利于防止它对生物体的毒害作用。过氧化氢酶活性与土壤有机质含量有关,与微生物数量也有关。一般认为,土壤中催化过氧化氢分解的活性,有30%或40%以上是耐热的,即非生物活性,常由锰、铁引起催化作用。土壤肥力因子与不耐热的即过氧化氢酶活性成正比例。

2. 试验原理

Kappen(1913)首先介绍硫酸存在下用高锰酸钾滴定剩余的过氧化氢测定酶活性。此法根据过氧化氢与土壤相互作用时,未分解的过氧化氢的数量用容量法(常用高锰酸钾滴定未分解的过氧化氢)测定过氧化氢酶活性。反应方程式如下:

2KMnO+5H O+3H SO→2MnSO+K SO+8H O+5O

4222442422

3. 试剂配制

a. 0.3%过氧化氢溶液:按1:100将30%H2O2用水稀释

b. 3N 硫酸;

c. 0.1N 高锰酸钾(1/5KMnO4)溶液:称取化学纯高锰酸钾3.161g,溶于1升无CO2蒸馏水中,贮于综色瓶中,备用。

4. 操作步骤

(1)取2g风干土,置于100mL三角瓶中,并注入40mL蒸馏水和5mL 0.3%过氧化氢溶液。

(2)同时设置对照,即三角瓶中注入40mL蒸馏水和5mL 0.3%过氧化氢溶液,而不加土样。

(3)将三角瓶放在振荡机上振荡20min。而后加入5mL 3N硫酸,以稳定未分解的过氧化氢。再将瓶中悬液用慢速滤纸过滤。然后,吸取25mL 滤液,用0.1N高锰酸钾滴定至淡粉红色终点。

5. 结果计算

用于滴定土壤滤液所消耗的高锰酸钾量(毫升数)为B,用于滴定25mL原始的过氧化氢混合液所消耗的高锰酸钾量(毫升数)为A。

(A-B)×T即为过氧化氢酶活性。以20min后1g土壤的0.1N高锰酸钾的毫升数表示。式中T为高锰酸钾滴定度的校正值。

方法来源:关松荫. 土壤酶及其研究法. 北京: 农业出版社, 1986.

高锰酸钾溶液的配制与标定

1、配制

称取3.3g高锰酸钾,溶于1050ml水中,缓缓煮沸15min,冷却后置于暗处保存2周。

以4号玻璃滤埚过滤于干燥的棕色瓶中。

过滤高锰酸钾溶液所用的玻璃滤埚预先应以同样的高锰酸钾溶液缓缓煮沸5min。收集瓶

也应用此高锰酸钾溶液洗涤2~3次。

2、标定

称取0.2g于105~110℃烘至恒重的基准草酸钠,称准至0.0001g。溶于100ml(8+92)

硫酸溶液中,用配制好的高锰酸钾溶液[c(KMnO4)=0.1mol/l]滴定,近终点时加热至6 5℃,继续滴定至溶液呈粉红色保持30s,同时作空白试验。

3、计算

高锰酸钾溶液标准浓度按下式计算

c(1/5KMnO4)=m/(V1-V2)*0.06700

式中c(1/5KMnO4)=——高锰酸钾标准液之物质的量浓度,mol/l;

m——草酸钠之质量,g;

V1——高锰酸钾溶液之用量,ml;

V2——空白试验用高锰酸钾溶液之用量,ml;

0.06700——与1.00ml高锰酸钾溶液c(1/5KMnO4)=1.000mol/l相当的以克表示的草酸钠的质量。

KMnO4标准溶液的标定

准确称取0.15~0.2g预先干燥过的Na2C2O4,加80mL水,20mL 3mol·L-1的H2SO4使其溶解,用水浴慢慢加热至有蒸汽冒出(约343~358K),趁热用待标定的KMnO4溶液进行滴定。开始宜慢,在第一滴KMnO4溶液滴入后,不要搅动溶液,当紫红色褪去后再滴入第二滴。待溶液中有Mn2+产生后,反应速度加快,滴定速度可适当加快,但不能使KMnO4溶液呈线状流下。近终点时,紫红色褪去很慢,应减慢滴定速度并充分搅拌,以防超过终点。最后滴加半滴KMnO4溶液,搅匀后,微红色半分钟不褪,表明已到终点,计算KMnO4的浓度

三、蔗糖酶测定(比色法):

1、试剂配制

(1)3,5-二硝基水杨酸溶液:称0.5g二硝基水杨酸,溶于20mL2N氢氧化钠和50mL水中,再加30g酒石酸钾钠,用水稀释至100mL(不超过7天)。

(2)pH5.5磷酸缓冲液:1/15M磷酸氢二钠(23.876g磷酸氢二钠.12H2O溶于1L蒸馏水中)0.5mL加1/15M磷酸二氢钾(9.078g磷酸二氢钾溶于1L蒸馏水中)9.5mL即成。

(3)8%蔗糖溶液:80g蔗糖溶于1000mL水中

(4)甲苯

(5)标准葡萄糖溶液:将葡萄糖预先在80℃烘至恒重。然后取500mg溶于100mL蒸馏水中,即成标准葡萄糖溶液(5mg还原糖/mL)。再将次液稀释10倍制成葡萄糖工作液(0.5mg/mL)。

2、操作步骤

称取5g过1mm筛的风干土,置于50mL三角瓶中,注入15mL 8%蔗糖溶液,5mL pH 5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。摇匀混合物后,放入恒温箱,在37℃下培养24h。

到时取出,迅速过滤。从中吸取滤液1mL,注入50mL容量瓶中,加3mL3,5-二硝基水杨酸,并在沸腾的水浴锅中加热5min,随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色,最后用蒸馏水稀释至50mL,并在分光光度计上于波长508nm处比色。

每一土壤需做无基质对照,整个试验需做无土壤对照。

在分析样品的同时,取0、1、2、3、4、5、6、7mL葡萄糖工作液,分别注入50mL容量瓶中,并按与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色,比色后以吸光度为纵坐标,葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。

3、结果计算

以24h后1g土壤中葡萄糖的质量(mg)表示蔗糖酶活性(Suc):

Suc=a·V·n/m

式中:a为由标准曲线求得的葡萄糖浓度(mg/mL);V为显色液体积(50mL);n为分取倍数;m为烘干土重(g)。

4.磷酸酶测定(磷酸苯二钠比色法):

1. 分析意义

土壤有机磷转化受多种因子制约,尤其是磷酸酶的参与,可加速有机磷的脱磷速度。在pH4-9的土壤中均有磷酸酶。积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。研究证明,磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关,与有效磷含量及pH也有关。磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。

2. 试验原理

Kroll等(1955)最早提出用苯基磷酸盐作基质,以酚的释放量表示磷酸酶活性。测定磷酸酶主要根据酶促作用生成的有机基团量或无机磷量计算磷酸酶活性。前一种通称为有机基团含量法,是目前较为常用的测定磷酸酶的方法。后一种称为无机磷含量法。

研究证明,磷酸酶有三种最适pH:4-5,6-7和8-10。所以,测定酸性、中性和碱性反应土壤的磷酸酶,要提供相应的pH缓冲液才能测出该土壤的磷酸酶最大活性。测定磷酸酶常采用的pH缓冲体系有醋酸盐缓冲液(pH5.0-5.4),柠檬酸盐缓冲液(pH7.0),三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH7.0-8.5),硼酸缓冲液(pH9-10)。

测定磷酸酶时,用各种磷酸一酯作为基质。常用的基质有苯磷酸二钠、酚酞磷酸钠、甘油磷酸钠、α或β萘酚磷酸钠、ρ-硝基苯磷酸钠等。

1、试剂配制

(1)甲苯

(2)磷酸笨二钠:称取6.75g磷酸笨二钠(C6H5PO4Na2.2H2O)溶于水,并稀释至1L(1毫升含25mg酚)

(3)缓冲液

(4)pH9.0硼酸盐缓冲液

缓冲溶液配制:

(1)酸性磷酸酶:醋酸盐缓冲液(pH=5.0)

A:0.2M醋酸钠溶液:16.4g 无水醋酸钠(C2H3O2Na)溶于1000mL蒸馏水中,或是27.2g三水醋酸钠

(C2H3O2Na.3H2O)溶于1000mL水中。

B:0.2M醋酸溶液:11.55mL醋酸定容于1000mL

醋酸盐缓冲液(pH=5.0):7mLA+3mLB混合即得

(2)碱性磷酸酶:硼酸盐缓冲液(pH10.0)

硼砂-氢氧化钠缓冲液(pH10.0):

A:硼砂液:19.072g硼砂溶于1000mL蒸馏水中

B:氢氧化钠溶液:4g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中

50mLA+43mLB加水稀释至200mL,混匀即得

(3)硼酸盐缓冲液(pH9.0)

A:0.05M硼砂溶液:19.07g硼砂(Na2B4O710H2O)溶于1000mL蒸馏水中

B:0.2M硼酸溶液:12.37g硼酸(H3BO3)溶于1000mL蒸馏水中

硼酸盐缓冲液(pH9.0):80mLA+20mLB混匀即得

(4)中性磷酸酶:柠檬酸盐缓冲液(pH7.0)

A:0.1M柠檬酸溶液:21.01g柠檬酸. H2O(或是19.21gC6H8O7)溶于1000mL蒸馏水中

B:0.2M磷酸氢二钠:35.61g磷酸氢二钠.2 H2O(53.63g磷酸氢二钠.7 H2O或是71.7g磷酸氢二钠.12 H2O)

溶于1000mL蒸馏水中

柠檬酸盐缓冲液(pH7.0):3.63mLA+16.37mLB混匀即得

(5)2.5%铁氰化钾

(6)0.5%的4-氨基安替吡啉溶液

(7)酚原液:2克酚溶液蒸馏水定容致1升(2mg/mL),溶液在暗色中稳定。

(8)酚工作液:取2.5mL原液稀释至100mL(0.05mg酚/mL)

2、操作步骤:

称取5g土于50mL容量瓶中,加1mL甲苯,加塞塞紧轻摇15min。再加入5mL磷酸苯二钠(6.75g溶于1L水)和5mL相应的缓冲液(酸性磷酸酶用pH5.0大醋酸缓冲液,中性磷酸酶用pH7.0的柠檬酸缓冲液,碱性磷酸酶用pH10的硼酸缓冲液),同时对每一土样都设置用5mL水代替基质的对照。仔细摇匀后放入恒温箱,在37℃下培养24h。

用热至38℃的蒸馏水将容量瓶中混合物稀释至刻度(甲苯浮在刻度以上),再用致密滤纸过滤。取1mL滤液于100mL容量瓶中,加5mL pH9.0硼酸盐缓冲液,再加入3mL 2.5%的铁氰化钾和3mL 0.5%的4-氨基安替吡啉溶液,摇动,仔细混匀,这时溶液呈粉红色,然后加水定容。待颜色稳定时(20-30min),在波长570nm处测定各样品的消光值。土壤的磷酸酶活性根据标准曲线求出酚的含量。

磷酸酶活性以每克土壤的酚毫克数表示(若用P的毫克数表示,结果需乘0.32;若用P2O5的毫克数表示,需乘2.29)。

标准曲线:分别向100mL容量瓶中注入1,3,5,7,9,11mL工作液并显色定容(分别相当于0.05,0.15,0.25,0.35,0.45,0.55mg酚),待颜色稳定后,比色绘制标准曲线。

方法来源:关松荫. 土壤酶及其研究法. 北京: 农业出版社, 1986.

5.土壤蛋白酶测定(加勒斯江法)

1. 分析意义

蛋白酶参与土壤中存在的氨基酸、蛋白质以及其他含蛋白质氮的有机化合物的转化。它们的水解产物是高等植物的氮源之一。土壤蛋白酶在剖面中的分布与蔗糖酶相似,酶活性随剖面深度而减弱。并与土壤有机质含量、氮素及其他土壤性质有关。

2. 试验原理

蛋白酶能酶促蛋白物质水解成肽,肽进一步水解成氨基酸。

测定土壤蛋白酶常用的方法是比色法,根据蛋白酶酶促蛋白质产物-氨基酸与某些物质(如铜盐蓝色络合物或茚三酮等)生成带颜色络合物。依溶液颜色深浅程度与氨基酸含量的关系,求出氨基酸量,以表示蛋白酶活性。

3. 试验步骤

取2g过1mm筛的风干土置于50mL容量瓶中,加入10mL 1%用pH7.4磷酸盐缓冲溶液配制的白明胶溶液和0.5mL甲苯(作为抑菌剂抑制微生物活动);在30℃恒温箱中培养24h;培养结束后,将瓶中内容物过滤;取5mL滤液置于试管中,加入0.5mL 0.1N硫酸和3mL 20%硫酸钠以沉淀蛋白质,然后滤入50mL容量瓶,并加入1mL 2%茚三酮溶液;将混合物仔细摇荡,并在煮沸的水浴中加热10min;将获得的着色溶液用蒸馏水稀释定容至刻度线;最后在560nm处进行比色。

用干热灭菌的土壤和不含土壤的基质(如石英砂)作对照,方法如前所述,以除掉土壤原有的氨基酸引起的误差。换算成甘氨酸的量,根据用甘氨酸标液制取的标准曲线查知。

4. 试剂配制

a. 1%白明胶溶液(用pH7.4的磷酸盐缓冲液配制);

b. 甲苯;

c. 磷酸盐缓冲液(pH7.4);

d. 0.1N H2SO4;

e. 20%Na2SO4;

f. 2%茚三酮溶液:将2g茚三酮溶于100mL丙酮,然后将95mL该溶液与1mL CH3COOH 和4mL水混合制成工作液(该工作液不稳定,只能在使用前配制);

g. 甘氨酸标准液:浓度为1mL含100μg甘氨酸的水溶液:0.1g甘氨酸溶解于1L蒸馏

水中。再将该标液稀释10倍得10μg甘氨酸?1mL-1溶液的甘氨酸工作液。

标准曲线绘制:分别吸取0、1、3、5、7、9、11mL 该工作液于50mL 容量瓶中即获得甘氨酸浓度分别为0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2μg ?mL -1的标准溶液梯度,然后加入1mL 2%茚三酮溶液。冲洗瓶颈后将混合物仔细摇荡,并在煮沸的水浴中加热10min 。将获得的着色溶液用蒸馏水稀释至刻度。在560nm 处进行比色,最后绘制标准曲线。

5. 结果计算:

土壤蛋白酶的活性,以24h 后1g 土壤中甘氨酸的微克数表示。

1c 50ts

g g m μ-???甘氨酸()=

甘氨酸(μg ?g -1)-24小时后1g 土壤中甘氨酸的微克数;

c -标准曲线上查得的甘氨酸浓度,μg ?mL -1;

50-显色液体积,mL ;

ts -分取倍数(这里是2=10/5);

m -土壤质量,g 。

方法来源:曹承绵, 张志明, 周礼恺. 几种土壤蛋白酶活性测定方法的比较. 土壤通报, 1982, 13(2): 39-40.

几种水解酶:芳基硫酸酯酶(Arylsulphatase(EC 3.1.6.1)), 葡萄糖苷酶(β-glucosidase(EC 3.2.1.21) )和磷酸单酯酶(phosphmonoesterase(EC 3.1.3))测定: 这三种酶的测定都是依据人工合成底物(p-nitrophenyl sulphate, p-nitrophenyl glucoside and p-nitrophenyl phosphate,respectively )裂解后释放的p-nitrophenol 的量来测定。

Arylsulphatase(EC 3.1.6.1):称取1g 土(湿重),与4ml 500mM 乙酸缓冲液(acetate buffer )(pH5.8)和1ml 底物(25mM )混匀。对照为4ml 乙酸缓冲液加1ml 灭菌蒸馏水。土壤稍作涡旋振荡,置于旋转摇床20℃,200rpm 培养2h 。 然后,往样品中加1ml 无菌蒸馏水,往对照中加1ml 底物。再加入1ml 500mM 氯化钙和4ml 500mM 氢氧化钠以终止反应。悬浮液在旋转摇床上20℃,200rpm 振荡30min 。9464×g 离心5min , 然后在400nm 波长下测定上清夜中所提取的p-nitrophenol 的颜色深度。如果是在中性条件下测定,则用蒸馏水取代乙酸缓冲液。标准曲线制作:用蒸馏水配制p-nitrophenol 溶液,浓度范围0-50ug/ml 。

β-glucosidase(EC 3.2.1.21):缓冲液换为改进的通用缓冲液(modified universal buffer )(pH6.0);底物浓度25mM ,提取液用Tris 缓冲液(pH12.0).

phosphmonoesterase(EC 3.1.3): 缓冲液换为改进的通用缓冲液(modified universal buffer )(pH4.0和9.0)(分别测定酸性和碱性磷酸酯酶),底物浓度为15mM 。

SOD酶活性测定方法

SOD酶活性测定 所需药品: (1)0.1mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液: A液:0.1mol/l磷酸氢二钠液 B液:0.1mol/l磷酸二氢钠液 1毫升B+10.76毫升A (2)0.026mol/l蛋氨酸液(Met):现用现配 称取0.3879克蛋氨酸,用1号液定容至100毫升。 (3)75*10-5mol/l氯化硝基四氮唑蓝(NBT)液:现用现配 称取0.1533克NBT,先用少量蒸馏水溶解,然后定容至250毫升。 (4)1umol/lEDTA-2钠和2*10-5mol/l核黄素混合液 (5)0.05mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液 (6)石英砂 实验步骤: 1.酶液制备:称取0.5克鲜叶,放入研钵中,加入3毫升5号液和少量石英砂,于冰浴中研成匀浆。然后用5号液定容至8毫升,于0~4℃、13000g时离心15分钟,上清液即为酶提取液。酶液可在低于0℃下的环境中保存。 2.按下表加入试剂: 试剂摇匀后,迅速遮光处理1号杯,其余杯在25℃、光强为4000勒克司的条件下照光处理15分钟,然后立即遮光。接着在560nm下,以1号杯作为空白测定其余杯中溶液的光密度。假定2、3号杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率为100%,然后按下式分别计算其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率。 M/N=100/X M——2、3号杯中溶液的光密度的平均值 N——其余杯中溶液的光密度值 X——其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率 然后以酶液量为横坐标,以其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率(X)为纵坐标制作曲线,根据线性好的曲线所得出的函数关系计算抑制NBT光还原的相对百分率为50%时所加入的酶液量,以该酶液量作为1个酶活单位。 结果计算:SOD活力按下式计算: A=V*1000*60/(B*W*T)

土壤纤维素酶测定方法

纤维素酶 一、试剂: 1)醋酸缓冲液(pH 5.5):164.08 g无水醋酸钠(C2H3O2Na)溶于700 ml去离子水,用醋酸(C2H4O2)调节pH至5.5,用去离子水稀释至1 L。 2)CMC溶液(0.7%,w:v):7 g羧甲基纤维素钠盐溶于1 L醋酸缓冲液,45℃下搅拌2 h,此溶液在4℃下可存放7天。 3)还原糖试剂: 试剂A:16 g无水碳酸钠(Na2CO3)和0.9 g氰化钾(KCN)溶于去离子水并稀释至1 L。试剂B:0.5 g六氰铁钾(K4Fe(CN)6)溶于去离子水并稀释至1 L,贮于棕色瓶中。 试剂C:1.5 g 硫酸铁铵(NH4SO4Fe2(SO4)2·H2O)、1 g十二烷基硫酸钠(C12H25O4SNa)和4.2 ml浓硫酸溶于50℃去离子水,冷却后稀释至1 L。 4)水合葡萄糖溶液:28 mg水合葡萄糖溶于少量去离子水中,并定容至1 L。 二、仪器设备 恒温培养箱,水浴锅,分光光度计,搅拌器,三角瓶 三、操作步骤 取10.00 g(耕地)或5.00 g(林地)新鲜土壤(<2 mm)于100 ml三角瓶中,加15 ml 醋酸缓冲液和15 ml CMC溶液,盖上塞子,于50℃下培养24 h,过滤。同时做空白对照,但在培养结束时才加入15 ml CMC溶液,并迅速过滤。 取2.00 ml滤液于50 ml容量瓶中,并用去离子水定容至刻度。吸取2.00 ml稀释液于20 ml试管中,加2.00 ml还原糖试剂A和2.00 ml还原糖试剂B,盖紧混匀,在100℃水浴中加热15 min 后,立即至于20℃水中冷却5 min。加10.00 ml还原糖试剂C,混匀,20℃下静置显色60 min,于690 nm波长处比色测定(要求在30 min内完成)。 标准曲线:吸取0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0 ml水合葡萄糖溶液,用去离子水稀释至2 ml,同上加入还原糖试剂A、B、C后,比色测定还原糖含量。c) 空白: 无土空白:不加土样,其余操作与样品试验相同,整个试验设置一个,重复一次。 无基质空白:以等体积水代替基质,每个土样设置一个。 四、结果计算 土壤纤维素酶活性(μg·g-1·(24 h)-1)=(C*V*f)/ dwt 式中C为样品的葡萄糖含量(μg·ml-1);V为土壤溶液体积(30 ml);f为稀释倍数(25);

抗氧化酶活性等测定方法

叶绿体得提取 一、试剂配置 1、PBS提取液:每L水依次加入MES(195.2×0。05=9、76g)、山梨糖醇(0。33×182。2=60。126g)、NaCl(0、010×58.5=0、585g)、MgCl(0.002×95=0、19g)、EDTA(292、25×0.002=0、5845g)、KH2PO4(200×0.0005=0、1g);使用时加入ASA—Na(198。1×0、002=0、3962g); 2、悬浮液:将PBS提取液中得MES换为238。3×0.05=11、915g得HEPES(238、3×0。05=11。915g); 3、80%Percol:80ml原液+20ml水;40%Percol:40ml原液+60ml水; 实际配制: PBS提取液2000ml(3个处理*2个品种*3个重复*20ml*3次=1080ml), 悬浮液100ml(3个处理*2个品种*3个重复*1ml*3次=54ml); 80%Percol 200ml;40%Percol 200ml。(3个处理*2个品种*3个重复*3ml*3次=162ml) 二、提取步骤 1、10g鲜样加20ml提取PBS(50mM MES PH6、1,含0、33M山梨糖醇,10mM NaCl,2mMMgCl2,2mM EDTA,0.5 mMKH2PO4,2mM ASA—Na,ASA—Na使用前现配现加) 2、快速研磨,使叶片碎成绿豆粒大小,4层纱布过滤,去除残渣(注意过滤时不可用力挤压,以免叶绿体膜破碎) 3、滤液2000g 3min,小心倒出上清液,将离心管放入离心机后,使离心机得加速很快上升到预定值(水平转头,加速度调到9),约经30s后很快使其下降停止,整个离心持续大约2—3min左右完成; 4、沉淀用1ml提取液漂洗表面悬浮物; 5、用1ml悬浮液(50mM HEPES pH7。6,含0、33mM山梨糖醇,10mM NaCl,2mM MgCl2,2mM EDTA,0。5mMKH2PO4,2mM ASA-Na,ASA-Na使用前现配现加)将沉淀悬浮,在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷,或者用手握住离心管在冰块之间搅动,使叶绿体由于震动分散开来,不要用棉球吸滤,以防被膜压破。叶绿体悬浮时要浓点,含叶绿素2mg、ml-1以上,这样有利于保持活性。 6、2000g 1min; 7、沉淀再用悬浮液悬浮;(悬浮液同5,可以不做) 8、用Percol试剂进行梯度离心(将3ml含有80%Percol(原液按100%算)铺在10ml离心管下层,再把3ml 40%Percol铺在离心管中层,然后将1ml叶绿体悬浮液轻轻铺在离心管上层)1500g2-3min(用

土壤酶活性测定方法

土壤酸性磷酸酶活性的测定 1.试剂配制 (1)0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液 取10.67g p-硝基苯磷酸二钠(6H O,分子量为371.1),溶于pH4.5通用缓冲液中并稀释至 2 250ml.4摄氏度冰箱保存。 (2)通用缓冲液(pH4.5)(缓冲液久置会有沉淀) 原液由以下成分组成: 三羟甲基氨基甲烷12.1g 顺丁烯二酸11.6g 柠檬酸14g 硼酸6.3g 溶于500ml 1N NaOH(40g定容1L)中,加蒸馏水至1L。取原液200 ml,再加入0.1N HCL 或浓HCL来调pH为4.5。最后稀释至1L,即得。 (3)甲苯 (4)0.5 mol/L Cacl2.2H2O溶液: 36.75g Cacl2.2H2O定容500ml. (无水CaCl2: 11.1g定容200ml) (5)0.5 mol/L NaOH溶液:20g NaOH定容1L. 2.测定步骤 置于50ml三角瓶中,加4ml通用缓冲液(pH4.5)、0.25ml甲苯和1ml 0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液,摇匀后,置于37℃恒温箱中1h。 培养结束后,加入1ml 0.5 mol/L氯化钙溶液和4ml 0.5 mol/L NaOH溶液,通过致密滤纸过滤到50ml容量瓶,用蒸馏水定容后在410nm处比色. 3.计算方法 土壤酸性磷酸酶的活性用单位时间内每克土中的对硝基苯酚的毫克数表示, W(mg·g-1·h-1)=M1/(m×t) 式中:M1—标准曲线上查得样品中对硝基苯酚的质量(mg); t —反应时间(h);=1h m—样品土壤的重量(g) 无土壤CK: 用1ml蒸馏水代替1g土壤;每批土样做2个;无基质CK: 用1ml蒸馏水代替1ml PNPP。每个处理做1个。 标准曲线的制作: 1)对硝基苯酚标液:1g对硝基苯酚定容1L,低温保存。 2)取标液0、1、2、3、4、5ml于0-6号硬质试管中,分别加pH6.5通用缓冲液4ml,Cacl2.2H2O 溶液1ml,NaOH溶液4ml, ②混匀后,定量滤纸过滤到50ml容量瓶,定容后,再取各浓度标液1ml定容至50ml,以0号试管作为对照,在A410nm波长下测光吸收值,并记录光吸收值A410。 ③以吸光值为横坐标、对硝基苯酚的含量为纵坐标计算直线回归方程y=a+bx及相关系数R,即对硝基苯酚含量n(mg)=a+b×A410.

土壤酶活性测定方法综合

土壤酶活性测定方法 1、土壤脲酶的测定方法(苯酚钠—次氯酸钠比色法) 一、原理 脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专性的,它仅能水解尿素,水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性,与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高,中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。 土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量,也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质,根据酶促产物氨与苯酚—次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚,来分析脲酶活性。 二、试剂 1)甲苯 2)10%尿素:称取10g尿素,用水溶至100ml。 3)柠檬酸盐缓冲液():184g柠檬酸和氢氧化钾(KOH)溶于蒸馏水。将两溶液合并,用1mol/LNaOH将PH调至,用水稀释定容至1000ml。 4)苯酚钠溶液(L):苯酚溶于少量乙醇,加2ml甲醇和丙酮,用乙醇稀释至100ml (A液),存于冰箱中;27gNaOH溶于100ml水(B液)。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合,用蒸馏水稀释至100ml。

5)次氯酸钠溶液:用水稀释试剂,至活性氯的浓度为%,溶液稳定。 6)氮的标准溶液:精确称取硫酸铵溶于水并稀释至1000ml,得到1ml含有氮的标准液;再将此液稀释10倍(吸取10ml标准液定容至100ml)制成氮的工作液(ml)。 三、操作步骤 称取5g土样于50ml三角瓶中,加1ml甲苯,振荡均匀,15min后加10ml10% 尿素溶液和20ml PH 柠檬酸盐缓冲溶液,摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。培养结束后过滤,过滤后取1ml滤液加入50ml容量瓶中,再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液,随加随摇匀。20min后显色,定容。1h内在分光光度计与578nm波长处比色。(靛酚的蓝色在1h内保持稳定)。 标准曲线制作:在测定样品吸光值之前,分别取0、1、3、5、7、9、11、13ml 氮工作液,移于50ml容量瓶中,然后补加蒸馏水至20ml。再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液,随加随摇匀。20min后显色,定容。1h内在分光光度计上于578nm波长处比色。然后以氮工作液浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制标准曲线。 注意事项: 1、每一个样品应该做一个无基质对照,以等体积的蒸馏水代替基质,其他操作 与样品实验相同,以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。 2、整个实验设置一个无土对照,不加土样,其他操作与样品实验相同,以检验 试剂纯度和基质自身分解。

土壤酶活性测定的实验步骤

土壤酶的测定 1.三角瓶用稀HNO 3(3-5%)或用洗衣粉浸泡24h,后刷洗,然后再用蒸馏水润洗,晾干。 2.土样研磨精细后分袋装好。土量需2g+2.5g+5g+5g=14.5g,重复一次,14.5×2=29g。 一、过氧化氢酶(容量法)(关松荫P323) 1.试剂配制: (1)0.3%过氧化氢溶液: ①(1:100 30%的H 2O 2和水) ②(0.5molH 2O 2+49.5ml蒸馏水) ③(1ml30% H 2O 2+99ml蒸馏水) (2)3N硫酸: (10ml硫酸+50ml水) (3)0.1N高锰酸钾溶液: (1.58gKMnO

4+100ml蒸馏水) 2.操作步骤: 2g风干土置100三角烧瓶→注入40ml蒸馏水和5ml 0.3%过氧化氢(现配)→在往复式振荡机上振荡20min→加入5ml3N硫酸(以稳定未分解的H 2O 2)→用慢速型滤纸过滤,→吸取25ml滤液,用0.1N高锰酸钾的滴定至淡粉红色 3.结果计算 过氧化氢酶的活性(M),以20min后1g土壤的0.1N KMnO 4的毫升数表示: M=(A-B)×T 式中: A: 空白消耗的0.1N KMnO 4毫升数 B: 滤液消耗的0.1 N KMnO 4毫升数 T: KMnO 4滴定度的校正值

以容量法测H2O2的酶活: Kappen (1913)首先介绍硫酸存在下用高锰酸钾滴定剩余的过氧化氢测定酶活。此法根据H 2O 2与土壤相互作用时,未分解的H 2O 2的数量用容量法(常用高锰酸钾滴定未分解的H 2O 2)测定H 2O 2的酶活 2 KMnO 4+5H 2O 2+3H 2SO 4→2MnSO 4+K 2SO

纤维素酶活力测定方法_张瑞萍

测试与标准 纤维素酶活力测定方法 张瑞萍 南通工学院(226007) 摘 要 用DN S 为显色剂,分别以滤纸和CM C 为底物,以滤纸糖酶活性(FP A )和羧甲基纤维素酶活性(CM C a se )表征纤维素酶活力。确定酶活测定用波长为530nm,参比溶液应为失活酶、底物和DN S 等共热的反应物;比较了两种底物的酶活力测定方法。结果表明,CM C a se 比FP A 高,说明酶对水溶性底物有较高的活力,也表明吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响;对于不同牌号的纤维素酶,织物的酶减量率与CM C 酶活力关系密切。 叙 词: 测试 纤维素酶 活度中图分类号: TS197 纤维素酶是多组分复合物,各组分的底物专一性不同。纤维素酶作用的底物比较复杂,反应产物不同,致使纤维素酶活力测定方法很多,各国的方法亦不统一。我们选择滤纸、CM C 为底物,原理系利用纤维素酶催化水解纤维素,产生纤维多糖、二糖及葡萄糖等还原糖,与显色剂反应,求出还原糖的浓度,间接求出酶的活力。由不同底物测得的酶活力分别称作FPA (滤纸糖酶活力)和CM C ase (羧甲基纤维素酶酶活力)。本文分析确定酶活力测定的主要条件,比较两种底物的酶活力测定方法的结果,探讨纤维素酶活力与织物减量率的关系,为酶在生产中的利用提供依据。 1 实验方法 1.1 化学药品、材料 纤维素酶(工业品),DNS 试剂(自配),冰醋酸,醋酸钠,葡萄糖(均为分析纯),滤纸(定性),羧甲基纤维素酶CM C (试剂级),纯棉针织物半制品(南通针织厂)。 1.2 FPA 滤纸酶活力和CMC 酶活力的测定 取适当稀释的酶液,分别以滤纸或1%的CM C 溶液为底物,于50℃恒温水解反应1h ;然后加入显色剂DNS,沸水浴中煮沸5min;再加入蒸馏水,于530nm 测定吸光度OD 值。 酶活可定义为:每毫升酶液1min 产生1mg 葡萄糖为一个单位( )。 1.3 针织物酶减量率的测定 将酶处理前后的试样在烘箱中105℃烘至恒重。减量率= 处理前织物干重-处理后织物干重 处理前织物干重 ×100% 2 结果与讨论 2.1 显色剂的选择 选用DNS ,在碱性条件下与还原糖反应,生成有色化合物,用分光光度计比色,确定低分子糖含量。 碱性条件下DNS 与还原糖共热反应如下: O 2N OH O 2N CO OH +还原糖  H 2N OH CO OH O 2N DN S(黄色) 3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色) 生成的棕红色氨基化合物系比色法测定基础。2.2 最大吸收波长的确定 选取490~580nm 波长对显色液进行比色。由图1可知,不同浓度的葡萄糖溶液在490~500nm 处有最大吸收,DNS 在此波长下也有较明显的吸收。为了排除DNS 的干扰,选择在波长 530nm 处进行测定,此波长下的葡萄糖吸收虽有所降低,然而符合“吸收最大、干扰最小”的原则。 图1 D NS 与葡萄糖的吸收曲线 2.3 底物及酶本身含糖量的影响 在实验过程中发现,底物特别是滤纸,也含有一定的还原糖,在碱性的DNS 试剂中也会发色。而且,试验所用的纤维素酶是一种工业级的复合酶,品种不同,其本身含糖量也不同。为了排除这类还原糖的干扰,参比溶液取失活后的酶、底物、DNS 等共热的反应物。2.4 葡萄糖标准曲线 用不同浓度的葡萄糖溶液作为标准溶液,与DNS 共热反应显色后,测出其吸光度OD 值(见图2)。标准曲线的线性相关系数R 2为0.9991(见图2),线性相当好,可以用于酶活力的测定。 38 印 染(2002No .8) www .cdfn .com .cn

土壤酶活性测定

土壤酶活性测定 几种水解酶:芳基硫酸酯酶(Arylsulphatase(EC 3.1.6.1)), 葡萄糖苷酶(β-glucosidase(EC 3.2.1.21) )和磷酸单酯酶(phosphmonoesterase(EC 3.1.3))测定:这三种酶的测定都是依据人工合成底物(p-nitrophenyl sulphate, p-nitrophenyl glucoside and p-nitrophenyl phosphate,respectively)裂解后释放的p-nitrophenol 的量来测定。 Arylsulphatase(EC 3.1.6.1):称取1g土(湿重),与4ml 500mM乙酸缓冲液(acetate buffer)(pH5.8)和1ml底物(25mM)混匀。对照为4ml乙酸缓冲液加1ml灭菌蒸馏水。土壤稍作涡旋振荡,置于旋转摇床20℃,200rpm培养2h。然后,往样品中加1ml 无菌蒸馏水,往对照中加1ml底物。再加入1ml 500mM 氯化钙和4ml 500mM 氢氧化钠以终止反应。悬浮液在旋转摇床上20℃,200rpm振荡30min。9464×g离心5min,然后在400nm波长下测定上清夜中所提取的p-nitrophenol 的颜色深度。如果是在中性条件下测定,则用蒸馏水取代乙酸缓冲液。标准曲线制作:用蒸馏水配制p-nitrophenol溶液,浓度范围0-50ug/ml。 β-glucosidase(EC 3.2.1.21):缓冲液换为改进的通用缓冲液(modified universal buffer)(pH6.0);底物浓度25mM,提取液用Tris缓冲液(pH12.0). phosphmonoesterase(EC 3.1.3): 缓冲液换为改进的通用缓冲液(modified universal buffer)(pH4.0和9.0)(分别测定酸性和碱性磷酸酯酶),底物浓度为15mM。 脲酶Urease (EC 3.5.1.5): 称取5g土(湿土),加2.5ml脲(80mM)和20ml 75mM 硼酸缓冲液(pH10.0)。涡旋振荡,旋转摇床20℃,200rpm振荡反应4h。对照为加2.5ml灭菌蒸馏水和20ml硼酸缓冲液。4h后,处理中加2.5ml灭菌蒸馏水,对照中加2.5ml脲。然后用30ml酸化的2M氯化钾提取。悬浮液在旋转摇床20℃,200rpm振荡30min。9464×g离心5min,取1ml上清夜与9ml 蒸馏水、5ml水杨酸钠(sodium salicylate)/ 氢氧化钠溶液和2ml dichloroisocyanuric acid(Na+盐)混允,20±2℃静置1h,在690nm波长下测定溶液的颜色强度。对于中性土壤用用蒸馏水取代硼酸缓冲液。标准曲线用氯化铵标准溶液制作,浓度范围0-2.5ug/ml。 脱氢酶(Dehydrogenase): INT(2(p-iodophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyl tetrazolium chloride)还原酶活性(既脱氢酶活性)采用Von Mersi 和Schinner(1991)的方法测定。1g鲜土置于带盖的玻璃瓶中,加入1.5ml 1M Tris缓冲液(pH 7.0)和2ml INT(5mg/ml,溶于2%体积比的二甲替甲酰胺(N,N-dimethylformamide)中)。对照土壤加1.5ml Tris缓冲液和2ml蒸馏水。旋转摇床20℃,200rpm培养24h。然后,往样品中加2ml蒸馏水,而往对照土样中加2ml INT。然后加10ml N,N-dimethylformamide/ 甲醇(1:1,v/v)提取液终止反应,20℃,200rpm振荡1h。9464×g离心5min,464nm波长下测定上清夜的吸光值。对于中性土壤用蒸馏水取代Tris缓冲液。用INTF(iodonitrotetrazolium chloride)(Sigma)制作标准曲线,浓度范围0-27ug/ml提取液。 荧光素二乙酸酯水解(Fluorescein diacetate hydrolysis): 称取3g鲜土,悬浮于50ml 磷酸盐缓冲液,加入250ul FDA(2mg/ml,溶于丙酮)。对照加250ul蒸馏水。土壤悬浮液在20℃,200rpm培养4h。培养结束后,样品中加250ul 蒸馏水,而对照中加250ul FDA。悬浮液涡旋振荡,取5ml置于含5ml丙酮的试管中以终

各种酶活性测定方法

抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的测定 过氧化氢酶(CAT)活性测定 过氧化物酶(POD)测定方法 超氧化物歧化酶(SOD)活性测定 小组第一次讨论结果: 一、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的测定 1.原理 APX 是植物体内重要的抗氧化酶, 主要功能是分解H2O2, 此过程通过抗坏血酸- 谷胱甘肽循环来完成。此外, 它还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢, 而抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基。因此,APX被认为与果实的抗热性直接相关。 2.所用方法 (1)采用碘液滴定法: 称取新鲜材料1 g,剪碎置研钵中,加少量石英砂及pH值6.0 的磷酸盐缓冲液,迅速研磨成浆,20 ℃下浸提30 min,中间摇动数次,3000 r /min 离心后保留上清液即为酶液。反应底物为抗坏血酸,加入酶液2 mL,20 ℃下反应10 min 后,立即加入偏磷酸1 mL,终止酶的活动,抗坏血酸被消耗的量,可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来进行测定,加淀粉溶液几滴作指示剂,以碘液滴定出现浅蓝色为止,记录滴定值,用底物被消耗的量来表示APX 的活性。每个处理设3 个重复。(2)紫外吸收法: 称取1g芥蓝叶片组织,加入1.6 mL预冷的磷酸缓冲液(PBS-K)(pH 7.8)提取液(含1 mmol·L-1 AsA,3 mmol·L-1β-巯基乙醇,0.5 mmol·L-1PMSF,

2% PVP,1 mM EDTA)。用液氮研磨,提取液于4℃,12000×g离心20 min,上清液用于酶活性的测定。取0.10 ml 酶液(可视情况调整),加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na

酶活性测定方法

酶活性测定 1、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase) 试剂:0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt(P-硝基苯磷酸二钠) 0.2mol/L 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲溶液(pH: 9.6)——buffer 0.2mol/L NaOH 测定步骤:(1) 加入样品之前,0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min; (2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min; (3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应; (4) 2500g 离心,上清液在410nm测定吸光度。 计算: 每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。 [(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.704 (Eu) 2、酸性磷酸酶(Acid phosphatase) 试剂:0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt(P-硝基苯磷酸二钠) 0.2mol/L HAc/Ac缓冲溶液(pH: 4.8)——buffer 0.2mol/L NaOH 测定步骤:(1) 加入样品之前,0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min; (2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min; (3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应; (4) 2500g 离心,上清液在410nm测定吸光度。 计算: 每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。 [(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.719 (Eu) 3、a-葡萄糖甘酶(a-glucosidase) 试剂:0.1% p-nitrophenyl a-D glucopyranoside(p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷) 0.2mol/L Tris-HCl (pH: 7.6) 测定步骤:(1) 加入样品之前,0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷及Tris-HCl 37°C 孵化30 min; (2) 1mL污泥样品+1mL 0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷+2mL Tris-HCl 37°C孵化

土壤酶活性测定方法

土壤酶活性测定方法 土壤脲酶的测定方法(苯酚钠—次氯酸钠比色法) 一、原理 脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专性的,它仅能水解尿素,水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性,与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高,中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。 土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量,也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质,根据酶促产物氨与苯酚—次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚,来分析脲酶活性。 二、试剂 1)甲苯 2)10%尿素:称取10g尿素,用水溶至100ml。 3)柠檬酸盐缓冲液(PH6.7):184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾(KOH)溶于蒸馏水。将两溶液合并,用1mol/LNaOH将PH调至6.7,用水稀释定容至1000ml。 4)苯酚钠溶液(1.35mol/L):62.5g苯酚溶于少量乙醇,加2ml甲醇和18.5ml丙酮,用乙醇稀释至100ml(A液),存于冰箱中;27gNaOH溶于100ml水(B液)。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合,用蒸馏水稀释至100ml。 5)次氯酸钠溶液:用水稀释试剂,至活性氯的浓度为0.9%,溶液稳定。 6)氮的标准溶液:精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml,得到1ml含有0.1mg 氮的标准液;再将此液稀释10倍(吸取10ml标准液定容至100ml)制成氮的工作液(0.01mg/ml)。 三、操作步骤 称取5g土样于50ml三角瓶中,加1ml甲苯,振荡均匀,15min后加10ml10%尿素溶液和20ml PH 6.7柠檬酸盐缓冲溶液,摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。培养结束后过滤,过滤后取1ml滤液加入50ml容量瓶中,再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液,随加随摇匀。20min后显色,定容。1h内在分光光度计与578nm波长处比色。(靛酚的蓝色在1h 内保持稳定)。 标准曲线制作:在测定样品吸光值之前,分别取0、1、3、5、7、9、11、13ml氮工作液,移于50ml容量瓶中,然后补加蒸馏水至20ml。再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液,随加随摇匀。20min后显色,定容。1h内在分光光度计上于578nm波长处比色。然后以氮工作液浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制标准曲线。 注意事项: 1、每一个样品应该做一个无基质对照,以等体积的蒸馏水代替基质,其他操作与样品 实验相同,以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。 2、整个实验设置一个无土对照,不加土样,其他操作与样品实验相同,以检验试剂纯

各种酶活力测定方法及注意事项

碱性蛋白酶及各种蛋白酶活力测定方法及测定有感 因长期测定碱性蛋白酶酶活力与角蛋白酶活力与胶原酶活力和弹性蛋白酶活力,碱性蛋白酶活力测定还好,因有国家标准,测定按照国标来便可大大减少误差。其余酶活力测定过程中因无统一标准且底物差异大,导致长期酶活力测定的混乱,各种酶活力测定方法与各种试剂添加,最后实际测定的酶活力只能仅作参考。 以下是各种蛋白酶活力测定方法及标曲绘制: 碱性蛋白酶测定方法 根据国标GB/T 23527-2009 附录B 蛋白酶活力测定福林法 以下是方法

碱性蛋白酶的测定方法参考 GB/T 23527-2009 附录 B 中福林酚法进行,即 1 个酶活力单位(U/mL)定义为 1 mL 酶液在 40℃、pH= 10.5 条件下反应 1 min 水解酪蛋白产生 1 μg 酪氨酸所需要的酶量,主要步骤如下。 2.2.6.1 标准曲线的绘制 (1)L-酪氨酸标准溶液:按表 2-6 配制。 表 2-6 L-酪氨酸标准溶液配置表 Table 2-6 L-Tyrosine standard solution form 管号酪氨酸标准溶液的浓度/ (μg/mL) 取 100 μg/mL 酪氨酸标准 溶液的体积/(mL) 取水的体积/ (mL)

0 0 0 10 1 10 1 9 2 20 2 8 3 30 3 7 4 40 4 6 5 50 5 5 (2)分别取上述溶液各 1.00 mL,各加 0.4 mol/L 碳酸钠溶液 5.0 mL,福林试剂使用 液 1.00 mL,置于 40 ℃±0.2 ℃水浴锅中显色 20 min,用分光光度计于波长 680 nm,10 mm 比色皿,以不含酪氨酸的反应管作为空白,分别测定其吸光度值,以吸光度值 A 为纵坐标,酪氨酸浓度 C 为横坐标,绘制 L-酪氨酸标准曲线。 图 2-1 L-酪氨酸标准曲线 Fig. 2-1 L-tyrosine standard curve 根据作图或用回归方程计算出当吸光度为 1 时的酪氨酸的量(μg),既为吸光度常数 K 值。其 K 值应在 95-100 范围内。上图所示标准曲线符合要求,可用于下一步实验。 2.2.6.2 测定方法 (1)计算方法 X = A × K × 4 / 10 × n = 2 / 5 × A × K × n 式(2-1) 式中,X —样品的酶活力,μ/g; A —样品平行实验的平均吸光度; K —吸光常数; 4 —反应试剂的总体积,mL; 10—反应时间 10 min,以 1 min 计; n —稀释倍数。 (2)测定方法 ①先将干酪素溶液放入 40 ℃±0.2 ℃恒温水浴中,预热 5 min。 ②按下列程序操作,进行测定。 于 680 nm 波长,用 10 mm 比色皿测其吸光度。

酶活性测定方法

一、过氧化物酶(POD)活性的测定 POD测定参照李合生等(2003)的愈创木酚法方法进行测定,略加改动。 测定:称取样品0.5g,加入5mL 1/15mol/L PH=7.0的磷酸缓冲溶液,冰浴研磨成匀浆,4℃条件下12000r/min离心15min,上清液为粗酶液。然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml,愈创木酚(0.2%)0.5ml,浓度为0.15%的H2O2 0.5ml,取0.3ml的酶提取液加入到试管中,空白以缓冲液代替。在470nm下测定其吸光度,加入酶液时开始计时,每隔30s读数一次,连续记录5分钟。以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。 △470 ×V T POD活性= 0.01×t×Vs×W 式中:△470----反应时间内吸光度值的变化; V T ----提取酶液的总体积(ml) t----反应的时间(min) Vs ----测定时取用酶液体积(ml) W----样品鲜重(g) 二、多酚氧化酶(PPO)活性的测定 多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法,略加改动。 酶液制备:称取样品0.5g,加入5mL 0.1mol/L PH=6.0的磷酸缓冲溶液,冰浴研磨成浆,4℃条件下12000r/min离心15min后上清液即为粗酶液。 PPO活性测定:反应试管中分别加入0.1 mL酶液+3.9 mL磷酸缓冲液+ 1 mL 1m mol/L的邻苯二酚。混匀后于30℃保温10 min,迅速加入2 mL质量分数为20%的三氯乙酸终止反应,立即于525nm下测定其吸光度值,计算酶活。 PPO活性= O D×V T 0.01×t×0.5g×V s = O D×V T 0.005 OD——反应时间内吸光值的变化; V T ----提取酶液的总体积(ml) Vs ----测定时取用酶液体积(ml) T———反应时间(min);

土壤纤维素酶活性测定(3,5- 二硝基水杨酸比色法)

土壤纤维素酶活性测定(3,5-二硝基水杨酸比色法) 一、原理 纤维素是植物残体进入土壤的碳水化合物的重要组分之一。在纤维素酶作用下,它的最初水解产物是纤维二糖,在纤二糖酶作用下,纤维二糖分解成葡萄糖。所以,纤维素酶是碳素循环中的一个重要的酶。纤维素酶解所生成的还原糖与?3,5-二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关,因而可 用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。 二、试剂 1)甲苯 2)1%羧甲基纤维素溶液:1g羧甲基纤维素钠,用50%的乙醇溶至100ml。 3)pH5.5醋酸盐缓冲液: 0.2mol/L醋酸溶液11.55ml95%冰醋酸溶至1L; 0.2mol/L醋酸钠溶液16.4gC2H3O2Na或27.22gC2H3O2Na.3H2O溶至1L; 取11ml0.2mol/L醋酸溶液和88ml0.2mol/L醋酸钠溶液混匀即成PH5.5醋酸盐缓冲液。4)3,5-二硝基水杨酸溶液:称1.25g二硝基水杨酸,溶于50ml2mol/LNaOH和125ml 水中,再加75g酒石酸钾钠,用水稀释至250ml(保存期不过7天)。 5)葡萄糖标准液(1mg/mL) 预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取50mg葡萄糖于烧杯中,用蒸馏水溶解后,移至50mL容量瓶中,定容,摇匀(冰箱中4℃保存期约一星期)。 若该溶液发生混浊和出现絮状物现象,则应弃之,重新配制。 三、操作步骤 葡萄糖标准曲线:分别吸1mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL 于试管中,再补加蒸馏水至1mL,加DNS溶液3ml混匀,于沸腾水浴中加热5min,

土壤酸性磷酸酶活性测定

2.1土壤酸性磷酸酶活性测定 土壤酸性磷酸酶活性测定 土壤有机磷转化受多种因子制约,尤其是磷酸酶的参与,可加速有机磷的脱磷速度。在pH 4-9 的土壤中均有磷酸酶。积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。研究证明,磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关,与有效磷含量及pH也有关。磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向的强度的指标。 磷酸苯二钠比色法 1.试剂配制 (1)0.5%磷酸苯二钠(用缓冲液配制)。 (2)pH5醋酸盐缓冲液。 a.醋酸盐缓冲液(pH=5.0) A:0.2mol/L 醋酸溶液(11.5mL,稀释至1000mL) B:0.2mol/L 醋酸钠溶液(16.4g C2H3O2Na 或27.2g C2H3O2Na·3H2O 定容至1000mL) 14.8ml A + 35.2ml B混合即得 (3)氯代二溴对苯醌亚胺试剂:取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亚胺,用10ml 96%乙醇溶解,贮于棕色瓶中,存放在冰箱里。保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。 (4)酚的标准溶液: 酚原液——取1g重蒸酚溶于蒸馏水中,稀释至1L,贮于棕色瓶中。 酚工作液——取10ml 酚原液稀释至1L(每毫升含0.01mg酚)。 (5)甲苯。 (6)0.3%硫酸铝溶液。 标准曲线绘制:取1、3、5、7、9、11、13ml 酚工作液,置于50ml容量瓶中,每瓶加入5ml 缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂,显色后稀释至刻度,30min后比色测定。以吸光度为横坐标,浓度为纵坐标(mg)绘成标准曲线。 2.操作步骤 称5g风干土置于200ml三角瓶中,加2.5ml 甲苯,轻摇15min后,加入20ml 0.5%磷酸苯二钠(用醋酸盐缓冲液配制),仔细摇匀后放入恒温箱,在37℃下培养24h后于培养液中加100ml 0.3%硫酸铝溶液并过滤。 吸取3ml 滤液于50ml 容量瓶中,然后按绘制标准曲线所述方法显色。用硼酸缓冲液时,呈现蓝色,在分光光度计上于660nm 处比色。 3.结果计算 磷酸酶活性,以24h后1g土壤中释出的酚的毫克数表示。 酚(mg)=a*8 式中a—从标准曲线上查得的酚毫克数 8—换算成1g 土的系数 1 / 1

土壤酶活性测定方法

土壤酶活性测定方法 一、蔗糖酶: 3,5-二硝基水杨酸比色法 1. 试剂配制 (1)2N氢氧化钠200mL:称取16g 氢氧化钠,用蒸馏水溶解,定溶于200mL容量瓶中。 (2)3,5-二硝基水杨酸溶液1000mL:称5g二硝基水杨酸,溶于200mL2N氢氧化钠和500mL蒸馏水中,再加300g酒石酸钾钠,用蒸馏水稀释至1000mL(不超 过7天)。 (3)1/15M 磷酸氢二钠1000mL:23.867g N a2HPO4·12H2O溶于1000mL蒸馏水中。 (4)1/15M 磷酸二氢钾1000mL:9.078g KH2PO4溶于1000mL蒸馏水中。 (5)pH5.5磷酸缓冲液100mL:5 mL磷酸氢二钠(1/15M)加95mL磷酸二氢钾(1/15M) (6)8%蔗糖1000mL:称取80g蔗糖,用水溶解,稀释至1000mL。 (7)甲苯。 (8)标准葡萄糖溶液(1mg/mL)1000mL:取少量葡萄糖在真空干燥箱中,于55℃条件下真空干燥至恒重。然后取1.00g葡萄糖溶于100ml蒸馏水中成标准葡萄 糖母液(10mg还原糖/ml)。取此母液10ml, 用蒸馏水定容至100mL即成标准 葡萄糖液(1mg/ml); 2. 操作步骤 (1)标准曲线绘制:分别取标准葡萄糖液0.4mL,0.8 mL,1.2mL, 1.6mL, 2.0mL,2.8mL, 3.2mL于50 mL比色管中,另取一管做空白对照。用蒸馏水补足至10mL。加入3.0mL 3,5-二硝基水杨酸,沸水浴5min,随即在自来水流下冷却。最后用蒸馏水稀释至50mL,并在分光光度计上于波长508nm处进行比色。 比色后,以光密度值为纵坐标,葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线。 (2)土壤蔗糖酶活性测定:称5.00g土样,置于50mL三角瓶中,注入15.0mL 8%蔗糖溶液,5.0mL pH5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。摇匀混合物后,放入恒温箱,在37℃下培养24h。到时取出,6000rpm离心10min。取1.0mL上清液(新鲜土样所吸取的上清液体积为1.0mL;风干土及保存1个月的土样所吸取的上清液体积为0.5mL)于50mL比色管中,然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定。 为消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖引起的误差。每一土样需做无基质对照。整个实验需作无土壤对照。 3.结果计算 蔗糖酶活性以24h后1g土壤葡萄糖的毫克数表示。 葡萄糖(mg)=(a-b)×c 式中 a---从标准曲线查得的样品(加了基质)对应的葡萄糖浓度,mg/mL; b---从标准曲线查得的样品对照组的葡萄糖浓度,mg/mL; c---换算成1g土的系数。 二、脲酶: 靛酚比色法 1. 试剂配制 (1)pH6.7柠檬酸盐缓冲液1L:取184g柠檬酸溶于300mL蒸馏水中,另取147.5g KOH溶于水,再将两种溶液合并,用1N NaOH将pH调至6.7,并用水稀至1L。 (2)苯酚钠溶液:称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中,加2mL甲醇和18.5mL丙酮,然后用乙醇稀释至100mL(A液),保存在冰箱中。称取27g NaOH溶于100mL 水中(B液),保存在冰箱中。使用前,取A、B两液各20mL混合,并用蒸馏 水稀释至100mL备用。 (3)次氯酸钠溶液100mL:取10%的次氯酸钠溶液9mL,用水稀释定容于100mL 容量瓶中,即活性氯的浓度为0.9%,溶液稳定。 (4)10%尿素溶液500mL:取50g尿素,用水稀释至500mL。 (5)甲苯。

三种主要酶活测定方法

土壤纤维素酶活性测定(3,5- 二硝基水杨酸比色法)一、原理 纤维素是植物残体进入土壤的碳水化合物的重要组分之一。在纤维素酶作用下,它的最初水解产物是纤维二糖,在纤二糖酶作用下,纤维二糖分解成葡萄糖。所以,纤维素酶是碳素循环中的一个重要的酶。纤维素酶解所生成的还原糖与 3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关,因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。 二、试剂 1)甲苯 2)1%羧甲基纤维素溶液:1g 羧甲基纤维素钠,用50%的乙醇溶至100ml。 3)pH5.5醋酸盐缓冲液: 0.2mol/L 醋酸溶液 11.55ml 95% 冰醋酸溶至1L. 0.2mol/L 醋酸钠溶液 16.4g C2H3O2Na或27.22g C2H3O2Na.3H2O溶至1L. 取11ml 0.2mol/L 醋酸溶液和88ml 0.2mol/L 醋酸钠溶液混匀即成PH 5.5醋酸盐缓冲液. 4)3,5-二硝基水杨酸溶液:称1.25g二硝基水杨酸,溶于50ml 2mol/LNaOH和125ml水中,再加75g酒石酸钾钠,用水稀释至250ml(保存期不过7天), 5)葡萄糖标准液(1mg/mL) 预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取50mg葡萄糖于烧杯中,用蒸馏水溶解后,移至50mL容量瓶中,定容,摇匀(冰箱中4℃保存期约一星期)。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象,则应弃之,重新配制。 三、操作步骤 葡萄糖标准曲线:分别吸1mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL 于试管中,再补加蒸馏水至1mL,加DNS溶液3ml混匀,于沸腾水浴中加热5min,取出立即泠水浴中冷却至室温,以空白管调零在波长540nm处比色,以OD值为纵坐标,以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。 称10g土壤置于50ml三角瓶中,加入1.5ml甲苯,摇匀后放置15min,再加5ml 1%羧甲基纤维素溶液和5ml pH5.5醋酸盐缓冲液,将三角瓶放在37℃恒温箱中培养72h。培养结束后,过滤并取1ml滤液,然后按绘制标准曲线显色法比色测定。(为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差,每一土样需做无基质对照,整个试验需做无土壤对照;如果样品吸光值超过标曲的最大值,则应该增加分取倍数或减少培养的土样。) 四、结果计算 纤维素酶活性以72h,1g干土生成葡萄糖毫克数表示。 纤维素酶活性=(a样品-a无土-a无基质)×n/m a样品、a无土、a无机质分别表示其由标准曲线求的葡萄糖毫克数;n为分取倍数;m 表示烘干土重

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