恶性肿瘤血瘀证型血栓前状态分子标志物测定及其意义

恶性肿瘤血瘀证型血栓前状态分子标志

物测定及其意义

（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）

作者：金伟,哈木拉提·吾甫尔,沙吉旦·阿不都热衣木,热娜古丽·艾则孜,张洪亮

【摘要】目的探讨恶性肿瘤血瘀证患者血栓前状态变化和意义。方法选择恶性肿瘤患者69例,其中血瘀证组56例,非血瘀证组13例,另选33例健康人作为正常对照组。分别采用流式细胞仪、ELISA法、CLAUSS法等检测血小板膜表面糖蛋白CD41和CD62P、组织型纤溶酶原激活物(t-PA)、组织型纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)以及凝血4项指标[血浆凝血酶原时间(PT)、纤维蛋白原(Fib)、凝血酶时间(TT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)]。结果与正常对照组比较,血瘀证组和非血瘀证组CD41表达、TT差异均无统计学意义(P＞0.05),CD62P表达、PAI-1含量、Fib含量均升高(P＜0.01),PT、APTT 时间缩短(P＜0.01)；血瘀证组t-PA含量下降(P＜0.05),与非血瘀证组比较,t-PA含量差异无统计学意义(P＞0.05)；与非血瘀证组比较,血瘀证组CD62P表达、Fib含量也有所升高(P＜0.05)。结论恶性肿

瘤血瘀证和非血瘀证组均存在不同程度的血栓前状态,CD62P、t-PA、PAI-1、PT、Fib、APTT等的改变可能是其血栓前状态的部分物质基础。

【关键词】恶性肿瘤；血瘀证型；血栓前状态；分子标志物

Abstract：Objective To explore the changes and significance of prethrombotic state on blood-stasis syndrome of cancer patients. Methods Sixty-nine cancer patients were divided into blood-stasis syndrome group (56 cases) and non-blood-stasis syndrome group (13 cases), with 33 healthy people as control group. The expression of CD41, CD62P on platelets, the level of plasma tissue plasminogen activator (t-PA), plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1), activated partial thromboplastin time (APTT), fibrinogen (Fib), prothrombin time (PT) and thrombin time (TT) of the three groups were tested by using flow cytometer, ELASA method and auto coagulometer. Results Compared with control group, there was no significant difference on the expression of platelet CD41 and TT in blood-stasis syndrome group and non-blood-stasis syndrome group (P＞0.05), however the expression of platelet CD62P was higher (P＜0.01), the level of plasma PAI-1 and Fib were higher (P＜0.01), PT and APTT was shortened (P＜0.01) in blood-stasis syndrome group. The level of plasma t-PA was lower (P＜0.05) in blood-stasis syndrome group, and there was no

significant difference in non-blood-stasis syndrome group (P＞0.05). Compared with non-blood- stasis syndrome group, the expression of platelet CD62P and the level of plasma Fib were higher (P＜0.05) in blood-stasis syndrome group. Conclusion There is a different degree of prothrombotic state in blood- stasis syndrome and non-blood-stasis syndrome of cancer patients. The changes of the expression of platelet CD62P, the level of plasma t-PA, PAI-1, PT, Fib and APTT may be the part of fundation in prethrombotic state of cancer patients.

Key words：cancer；blood-stasis syndrome；prethrombotic state；molecular marker

现代研究已经明确,恶性肿瘤发病机制及病理与其他疾病有着本质的不同,研究发现血栓前状态(prethrombotic state, PTS)在恶性肿瘤中较为常见[1-2],并且与止凝血功能改变有着密切的相互联系。PTS既往称血液高凝状态(hypercoagulable state,HCS),是多种因素引起的止血、凝血和抗凝系统失调的一种病理过程,具有易导致血栓形成的多种血液学变化。大量的基础和临床研究工作表明,血栓形成是在血管内皮细胞、血小板、凝血、抗凝、纤溶系统以及血液流变学等多种因素改变的综合作用下发生的,这些因素在血栓形成之前已发生不同程度的变化[3]。而中医研究认为,血瘀证与恶性肿瘤存在密切关系[4],在肿瘤的发生、增殖和转移等病理过程中,均有不同的表现。

肿瘤病血瘀证患者更容易发生明显的止凝血功能紊乱、纤溶亢进及血小板活化,并且常处于血栓前状态,还可引起弥漫性血管内凝血(DIC)、栓塞等严重并发症,如不早期诊断和治疗,往往会因出血而失去治疗时机,甚至造成死亡[5-6]。因此,早期发现血栓前状态、防止DIC发生、降低出血发生率是提高恶性肿瘤患者生存率的重要相关因素[7]。本研究试图通过对一些反映血栓前状态指标进行观察,阐明肿瘤血瘀证与血栓前状态的关系,为进一步研究恶性肿瘤血瘀证提供客观依据。

1 资料与方法

1.1 诊断标准

恶性肿瘤诊断标准按照《临床诊疗指南·肿瘤分册》诊断[8],并经影像学、B超、CT、胃镜及病理活检或细胞学确诊。

中医血瘀证诊断标准依照第二届全国活血化瘀研究学术会议修订的“血瘀证诊断标准”有关内容[9],具体如下：⑴舌紫黯或有瘀斑瘀点；⑵典型涩脉或无脉；⑶痛有定处(或久痛、椎刺性疼痛或不喜按)；⑷瘀血腹证；⑸癥积；⑹离经之血(出血或外伤瘀血)；⑺皮肤黏膜瘀斑、脉络异常；⑻痛经,伴色黑有血块或闭经；⑼肌肤甲错；⑽偏瘫麻木；⑾瘀血狂躁；⑿理化检查血液、循环瘀滞表现。气虚血瘀证、气滞血瘀证、痰凝血瘀证、阴虚血瘀证的辨证则依据《中医诊断学》(高等医药院校教材,第六版)中的有关内容进行,不属于上述血瘀证型者归属非血瘀证组。

1.2 纳入标准

所有入选病例的西医诊断应符合规定的疾病诊断标准；入选病例的中医证候诊断应符合规定的证候诊断标准。正常对照组选择与病例组性别、年龄等相匹配的无心、肺、肝、肾及血液等系统疾病的健康人,年龄大于18岁,性别、民族不限。

1.3 排除标准

检测前2周内服用过阿司匹林、华法林、皮质醇激素、儿茶酚胺、噻氯匹定、波立维、肝素等,以及其他可影响凝血和纤溶的药物者；服用过活血化瘀类的中药者；有血液系统疾病及精神病患者；单纯急性疾病患者、外伤患者；妊娠、哺乳期妇女；资料不全等影响判断者。

1.4 临床资料

1.4.1 恶性肿瘤组

均为2006年2－6月在新疆医科大学附属中医医院住院的恶性肿瘤患者,共69例,均为术后患者；转移23例,未转移46例；其中男性40例,女性29例；平均年龄(64.14±12.09)岁；其中肺癌13例,肠癌10例,膀胱癌9例,胃癌9例,肝癌8例,食道癌4例,乳腺癌6例,肾癌2例,宫颈癌3例,胆囊癌2例,输尿管癌3例。血瘀证组56例,其中男33例,女23例；非血瘀证组13例,其中男7例,女6例。血瘀证中医证候学观察：根据临床表现,将患者分为气虚血瘀组18例,其中男10例,女8例；气滞血瘀组11例,其中男7例,女4例；痰凝血瘀组17例,其中男10例,女7例；阴虚血瘀组10例,其中男6例,女4例。

1.4.2 正常对照组

选健康人33例,其中男13例,女20例,平均年龄(59.24±10.34)岁,均无高血压、冠心病、糖尿病和肿瘤,无心、肝、肾及血液疾病。

恶性肿瘤组及正常对照组间年龄、性别经方差分析和卡方检验,差异无统计学意义(P＞0.05),具有可比性。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 血小板膜表面糖蛋白CD41和CD62P

清晨采肘静脉血,全血由EDTA抗凝。各管加稀释液70 μL,全血5 μL,分别加入荧光染料CD41-PE 5 μL、CD62P-FITC 8 μL 进行染色,轻揉混匀,避光孵育30 min,待测。选择氩离子激光激发,激发波长为488 nm,测定以前向角散射(FSC)对侧向散射(SSC)设门,调整电压,圈出血小板群,获取20 000个血小板黄光信号(FITC、PE),用PMT1、PMT2收集,转化成log信号散点图,以Expo软件进行处理,得出CD41、CD62P阳性血小板百分数。

1.5.2 组织型纤溶酶原激活物和组织型纤溶酶原激活物抑制物

取清晨空腹静脉血2 mL,置于枸橼酸钠抗凝真空管,4 ℃、3 000 r/min离心10 min,取出上清血浆,-80 ℃保存待测。收集好标本后将待测血浆分别加入包被抗人组织型纤溶酶原激活物(t-PA)抗体和组织型纤溶酶原激活物抑制物-1 (PAI-1)抗体的反应条内,充分混匀,37 ℃孵育150 min,然后进行洗板机洗涤,每孔加OPD底物稀释液100 μL,37 ℃孵育15～20 min使其显色,每孔加终止液50 μL终止反应,

最后由550酶标仪检测,在492 nm处测定各孔OD值,以OD492对t-PA、PAI-1标准品含量(ng/mL)在坐标上作标准曲线,待测样本含量(ng/mL)可从标准曲线上查出。

1.5.3 凝血4项指标

包括血浆凝血酶原时间(PT)、纤维蛋白原(Fib)、凝血酶时间(TT)及活化部分凝血活酶时间(APTT)的测定。取清晨空腹静脉血2 mL,置于枸椽酸钠抗凝真空管,以3 000 r/min离心15 min,其中Fib的测定采用CLAUSS比浊法,其余指标采用相应配套试剂及方法,然后由自动血凝分析仪检测。由机器自动将待测血浆用缓释液作1∶10稀释,并取待测稀释血浆200 μL,然后37 ℃预温30 min,最后加入凝血酶溶液100 μL,测定各项指标。

1.6 统计学方法

所有数据采用SPSS13.0统计软件处理,用x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析；组间两两比较采用SNK法。百分比数据进行平方根反正弦变换,数据转换公式为DEGREES {ASIN[SQRT(X)]},即将百分比转换成弧度后进行检验,最后的统计结果再将弧度转换成百分比。取检验水准α＝0.05(双侧)。

2 结果

恶性肿瘤血瘀证、非血瘀证组与正常对照组CD41、CD62P、t-PA、PAI-1以及凝血4项指标的检测结果见表1,恶性肿瘤血瘀证各型与正常对照组各项指标检测结果比较见表2。表1 恶性肿瘤血瘀证、非血瘀证组与正常对照组CD41、CD62P、t-PA、PAI-1、PT、Fib、TT、

APTT检测结果(略)注：与正常对照组比较,*P＜0.05,**P＜0.01；与非血瘀证组比较,▲▲P＜0.01

表2 恶性肿瘤血瘀证各型与正常对照组CD41、CD62P、t-PA、PAI-1、PT、Fib、TT、APTT检测结果(略)注：与正常对照组比较,*P ＜0.05,**P＜0.01；与气滞血瘀组比较,△P＜0.05

表1结果显示,与正常对照组比较,血瘀证组和非血瘀证组CD41表达差异均无统计学意义(P＞0.05),CD62P的表达水平均升高。血瘀证组血小板CD62P的表达水平显著高于非血瘀证组(P＜0.01),提示血瘀证比非血瘀证患者血小板活化和破坏更严重。血瘀证组t-PA含量下降(P＜0.05),PAI-1含量升高(P＜0.01)；非血瘀证组PAI-1含量升高(P＜0.01)。与正常对照组相比,恶性肿瘤血瘀证组和非血瘀证组PT、APTT时间缩短(P＜0.01),Fib含量升高(P＜0.01)；与非血瘀证组比较,血瘀证组Fib含量升高(P＜0.01)；TT组间差异均无统计学意义(P＞0.05)。在各项指标检测结果中,CD62P、t-PA、PAI-1、PT、Fib、TT和APTT都有不同程度的梯度变化,在t-PA含量和PT、TT、APTT时间长短中依次为正常对照组＞非血瘀证组＞血瘀证组,CD62P表达、Fib含量高低依次为血瘀证组＞非血瘀证组＞正常对照组。

根据表2所示,气虚血瘀组、气滞血瘀组、痰凝血瘀组、阴

虚血瘀组分别与正常对照组比较,CD41表达差异均无统计学意义(P ＞0.05),CD62P的表达水平均显著升高(P＜0.01), PAI-1含量升高(P ＜0.05)；气虚血瘀组、痰凝血瘀组t-PA含量下降(P＜0.05)。各指标在血瘀证各证型中都以痰凝血瘀组变化最为明显。与正常对照组相比,气虚血瘀组、气滞血瘀组、痰凝血瘀组、阴虚血瘀组Fib含量均升高(P＜0.01),且痰凝血瘀组较气滞血瘀组Fib含量也升高；气虚血瘀组、气滞血瘀组、痰凝血瘀组PT时间缩短(P＜0.05),气虚血瘀组、痰凝血瘀组、阴虚血瘀组APTT时间缩短(P＜0.05)。在凝血4项指标检测结果中,以痰凝血瘀组的变化最为明显。

3 讨论

血小板是研究血瘀证的重要内容,研究表明,血小板在肿瘤增殖和转移中可能起重要作用[10]。肿瘤的转移是复杂的多环节过程,其中癌细胞与肿瘤原发灶局部转移靶器官的血管内皮细胞粘附及在血循环中与血小板中性粒细胞的粘附是一个关键环节,并且细胞粘附分子起着十分重要的作用。CD41(GPⅡb/Ⅲa)是血小板之间互相连接的桥梁,与血小板的活力密切相关,其中GPⅡb/Ⅲa受体与纤维蛋白原等的结合是各种血小板激动剂导致血小板凝集过程中的最后共同途径。CD41在静息和活化的血小板上均表达且能恒定,血小板活化时CD41/CD61复合物作为纤维蛋白受体可出现变化,但总CD41的数量无改变。正如本研究结果显示：CD41表达在恶性肿瘤血瘀证以及各证型组和非血瘀证组、正常对照组中均呈高表达(P＞0.05),可能是

CD41在静息状态时已在血小板表面表达大量的CD41/CD61复合物,血小板活化时膜内外转位的糖蛋白对CD41总的影响不大；故CD41可作为血小板的特异性膜抗原来鉴别血小板群,以排除流式细胞仪分析时红细胞、白细胞及碎片的干扰[11]。CD62P又名α-颗粒膜蛋白(GMP-140)或简称P选择素,是血小板活化的标志。血小板经凝血酶和组胺等刺激活化后,α颗粒膜与细胞膜融合,P选择素因而表达于细胞膜上。活化血小板上的P选择素可以介导血小板与中性粒细胞、单核细胞和血管内皮细胞等细胞间的粘附,促进炎症和血栓形成,从而导致组织损伤。另外,可以介导肿瘤细胞和血小板的粘附,对于肿瘤细胞在血管中的滚动和浸润作用,具有重要意义[12]。研究表明,肿瘤患者血小板CD62P的表达明显高于正常人群,反映肿瘤患者血小板活化程度较高,促进了肿瘤细胞和血小板之间的相互作用[13]。本研究结果显示,恶性肿瘤血瘀证组血小板CD62P的表达水平显著高于非血瘀证组(P＜0.01),提示血瘀证比非血瘀证患者血小板活化和破坏更严重,而且CD62P在血瘀证各证型中表达也升高,而且以痰凝血瘀组改变最为明显,提示痰凝血瘀的病变程度更为严重。总之,恶性肿瘤患者存在血小板活化程度增强、血栓形成倾向增强的过程,血小板在肿瘤血瘀过程中起重要作用,可能直接参与肿瘤的血行转移,其功能失常将与凝血纤溶失控而促进肿瘤增殖、转移,促进血瘀证。恶性肿瘤血瘀证患者和非血瘀证患者都存在血栓前状态,血瘀证者则更为明显。

纤溶系统功能与血栓前状态形成有密切关系。t-PA和PAI

是体内调节纤溶系统功能的重要生理活性因子,两者均由血管内皮细胞合成,t-PA能活化纤溶酶原变成纤溶酶,从而降解沉积的纤维蛋白,而PAI则能与t-PA快速结合成复合物,使t-PA失去活性。t-PA和PAI 维持动态平衡是纤溶功能正常发挥的保证。t-PA血液含量及活性能直接反映纤溶系统功能,可预测血栓形成的危险程度。Brunner等[14]对良性、恶性乳腺肿瘤进行t-PA和尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)活性测定,良性肿瘤呈显著t-PA活性增高,恶性肿瘤uPA活性高于良性肿瘤,证明在肿瘤细胞中,具有侵袭能力的恶性肿瘤细胞,通常uPA 水平是增高的,而t-PA是正常或低水平的。本研究显示,恶性肿瘤血瘀证患者血浆t-PA含量较正常人降低(P＜0.05),PAI-1含量增高(P＜0.01),说明恶性肿瘤血瘀证患者有一定的纤溶功能减退。在血瘀证各组中,PAI-1含量较对照组均升高(P＜0.01),气虚血瘀组、痰凝血瘀组t-PA含量较对照组降低(P＜0.05),而且痰凝血瘀组变化更为明显。说明其t-PA和PAI的正常平衡状态被打破,提示恶性肿瘤患者血瘀证各证型组均存在纤溶功能减退,有明显的内皮细胞损伤及纤溶活性下降,使纤维蛋白过多沉积,致使血液趋向凝滞,导致血粘度升高,从而引起微循环阻力增大,血液运行不畅,影响气体与物质的交换而导致血瘀证的发生。血浆t-PA水平的降低和PAI-1水平的升高提示恶性肿瘤患者纤溶活性降低,纤维蛋白不能被及时溶解,使血液处于高凝状态,形成血栓前状态,从而促进肿瘤组织的生长。

PT、Fib、TT、APTT是反映凝血功能状况的4个指标。恶性肿瘤与凝血功能改变有密切关系。肿瘤细胞能通过组织因子或其他促凝血

因子的作用直接激活凝血酶原进而激活Fib。Fib的含量增高和异常激活导致血液高凝状态,为癌细胞的聚集、附着、浸润形成继发瘤创造了有利条件[15]。研究表明,50%的肿瘤患者和约90%的已有转移的肿瘤患者可检测到凝血指标的异常。而APTT、PT、TT在恶性肿瘤的阳性率亦可达10%以上[12]。本研究显示,恶性肿瘤血瘀证组和非血瘀证组PT、APTT时间缩短(P＜0.01),Fib含量升高(P＜0.01)；与非血瘀证组比较,血瘀证组Fib含量升高(P＜0.05)；TT在各组间差异均无统计学意义(P＞0.05)。提示恶性肿瘤血瘀证组和非血瘀证组均存在血液凝固增强倾向,形成明显的血栓前状态,升高的Fib水平可能是恶性肿瘤的重要危险因素之一,促进恶性肿瘤的血栓形成,而血瘀证组较非血瘀证组病变程度更为严重,这与病情的深入发展密切相关。在血瘀证组的各证型组中,同样存在血液的高凝状态,容易导致血栓的形成,其原因可能是恶性肿瘤细胞分泌粘蛋白、组织因子,破坏血管内皮细胞,诱导因子激活剂形成,促进凝血活性,而使Fib升高；肿瘤患者血小板聚集、释放功能增加,其释放的颗粒含有Fib等分子,可释放入血循环使Fib升高。以上因素综合作用,使肿瘤患者易形成血栓,而继发纤溶亢进所生成的纤维蛋白降解产物,又能反馈地刺激血浆Fib升高,这就易导致心脑血管疾病及恶性肿瘤。所以,凝血指标的异常改变是形成恶性肿瘤血瘀证血栓前状态的重要危险因素。故PT、Fib、TT、APTT参与了恶性肿瘤血瘀证的发生发展的病理生理过程,是其血栓前状态的部分物质基础。

综上所述,恶性肿瘤血栓形成时的止凝血机制异常在肿瘤转移中起着重要作用。对肿瘤患者进行凝血、纤溶、血小板及血管方面指标的检测,不仅可以监测肿瘤时的血栓前状态,而且对及时发现肿瘤的扩散、转移也有一定的意义。本研究结果显示,恶性肿瘤血瘀证和非血瘀证均存在不同程度的血栓前状态,而且血瘀证患者其血小板、凝血、抗凝和纤溶系统功能的异常改变程度比非血瘀证患者更为严重,而这些因素则为恶性肿瘤血瘀证血栓前状态共同的病理物质基础之一。我们选择上述指标,可以作为具有一定特异性和敏感性的恶性肿瘤血瘀证血栓前状态的早期诊断标志,其检测对于辅助诊断恶性肿瘤血瘀证、评估预后有一定的临床意义。

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