蛋白酶酶切位点

木瓜蛋白酶巯基蛋白酶具有广泛特异性TPCK,TLCK,抑蛋白酶醛肽α-巨球蛋白,烷化剂胃蛋白酶酸蛋白酶广泛特异性胃蛋白酶抑制素

胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶在K或R之后TLCK,PMSF,抑蛋白酶醛肽抑肽酶,α巨球蛋白人体20种氨基酸及其英文缩写

名称三字符号单字符号

丙氨酸Ala A

精氨酸Arg R

天冬氨酸Asp D

半胱氨酸Cys C

谷氨酰胺Gln Q

谷氨酸Glu/Gln E

组氨酸His H

异亮氨酸Ile I

甘氨酸Gly G

天冬酰胺Asn N

亮氨酸Leu L

赖氨酸Lys K

甲硫氨酸Met M

苯丙氨酸Phe F

脯氨酸Pro P

丝氨酸Ser S

苏氨酸Thr T

色氨酸Trp W

酪氨酸Tyr Y

缬氨酸Val V

【生化】特异性蛋白酶的酶切位点

胰蛋白酶arg、lys，得到以arg、lys为C末端残基的肽段。胰凝乳蛋白酶phe、trp、tyr 等疏水aa。胃蛋白酶phe、trp、tyr等疏水aa。木瓜蛋白酶arg、lys。葡萄球菌蛋白酶，磷酸缓冲液ph7.8时断裂glu、asp。碳酸氢铵缓冲液ph7.8或醋酸铵缓冲液ph4.0时断裂glu。梭菌蛋白酶arg，用于不溶性蛋白的长时间裂解。CNBr断裂Met。羟胺断裂asn—gly间的肽键。二硫键可以用巯基化合物还原法或者过甲酸氧化法断裂.。

木瓜蛋白酶（Papain），又称木瓜酶，是一种蛋白水解酶。木瓜蛋白酶是番木瓜（Carieapapaya）中含有的一种低特异性蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于巯基蛋白酶，它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，因此在食品、医药、饲料、日化、皮革及纺织等行业得到广泛应用。

木瓜蛋白酶是一种蛋白水解酶，分子量为23406，由一种单肽链组成，含有212个氨基酸残基。至少有三个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位，他们分别是Cys25、His159和Asp158，另外六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键,且都不在活性部位。纯木瓜蛋白酶制品可含有：（1）木瓜蛋白酶，分子量21000，约占可溶性蛋白质的10%；（2）木瓜凝乳蛋白酶，分子量26000，约占可溶性蛋白质的45%；（3）溶菌酶，分子量25000，约占可溶性蛋白质的20%；及纤维素酶等不同的酶。

番木瓜未成熟果实中含有木瓜蛋白酶(Papain)、木瓜凝乳蛋白酶A(Chymopapain A )、木瓜凝乳蛋白酶B(Chym opapain B )、木瓜肽酶B (PapayaPeptidase B ) 等多种蛋白水解酶。且已知四种半胱氨酸蛋白酶的一级结构具有高度的同源性。其中，木瓜蛋白酶属巯基蛋白酶，可水解蛋白质和多肽中精氨酸和赖氨酸的羧基端，并能优先水解那些在肽键的N-端具有二个羧基的氨基酸或芳香L-氨基酸的肽键。

木瓜蛋白酶papain属巯基蛋白酶，具有较宽的底物特异性，作用于蛋白质中L-精氨酸、L-赖氨酸、甘氨酸和L-瓜氨酸残基羧基参与形成的肽键。此酶属内肽酶，能切开全蛋蛋白质分子内部肽链—CO-NH—生成分子量较小的多肽类。

最适合pH值5.7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点I= 8.75；最适合温度55～60℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。

胃蛋白酶为什么不水解自身_百度文库

胃蛋白酶是一种酸性蛋白酶。由胃部中的胃粘膜主细胞释放出没有活性的胃蛋白酶原。酶原在遇到由胃壁细胞所释放的胃酸中的盐酸后切去44个氨基酸残基将被激活，其最适pH值约为1.5～2.2，在中性或碱性pH值的溶液中，胃蛋白酶会发生解链而丧失活性。胃蛋白酶在对蛋白质或多肽进行水解时，具有一定的氨基酸序列特异性，倾向于水解氨基端或羧基端为芳香族氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸）或亮氨酸的肽键。

胰蛋白酶和糜蛋白酶：

糜蛋白酶潜在切点太多了，你联合用的话会出好多峰，要控制好反应时间或者建议glu-C 配合trypsin 切E + K + R

或glu-C + lysyl endopeptidase 切E + K

都很特异，比较好的结果，顺便说一下trypsin太猛不要放太多。

搭配糜蛋白酶反应要彻底点，主要的切点W Y F T

胰蛋白酶分离工艺

1、集落刺激因子（G-CSF ）组成结构：是一种含有二硫键的单链糖蛋白，由175个氨基酸残基组成的单链非糖基化多肽链理化性质：①性状：无色澄明液体 ②分子量：20000，等电点为5.8～6.6 ③溶解度： ④稳定性：生理作用与临床适应症：作用于造血祖细胞，促进其增殖和分化，其重要作用是刺激粒、单核巨噬细胞成熟，促进成熟细胞向外周血释放，并能促进巨噬细胞及噬酸性细胞的多种功能，主要用于预防和治疗肿瘤放疗或化疗后引起的白细胞减少症，分离纯化工艺： G-CSF 为无菌冻干粉剂，由含有10mM 醋酸钠pH 为4的蛋白溶液经0.2um 过滤后分装冻干。由含有高效表达人G-CSF 的原核表达系统（E.coli ）经发酵、分离和高度纯化后经冻干制成。纯化液聚乙二醇浓缩洗脱液柱层析透析液透析缓冲液溶解沉淀沉淀蛋白质盐析洗脱液纤维素柱层析透析液透析缓冲液溶解沉淀饱和度至加入硫酸铵透析液透析滤液超滤浓缩正常成人尿液150 ephadexG -%8020000 S DEAE 2、超氧化物歧化酶（SOD ）：组成结构：理化性质：①性状：淡蓝色冻干粉结晶体 ②分子量：32000左右 ③溶解度： ④稳定性：耐热性强，90℃ 环境120分钟酶活几乎没有损失，100℃环境60分钟酶活保持90%以上；稳定性高，在pH4.0—11.0范围内酶活稳定。生理作用与临床适应症：是一种能够催化超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过氧化氢的酶，是一种重要的抗氧化剂，保护暴露于氧气中的细胞分离纯化工艺：血液预处理,洗涤红细胞和溶血;去除大部分杂蛋白得SOD 粗品;再经柱层析分离得到精品。猪血经血液预处理、洗涤红细胞、溶血、乙醇一氯仿混合液除去血红蛋白，然后用坟柳043HZO 萃取、丙酮沉淀、55一65℃热变性得到粗酶液。粗酶液上阴离子DEAE 一Cellulose52交换层析柱、分子筛SephadexG-75柱,最终获得了纯化的铜锌超氧化物歧化酶。

蛋白酶酶切位点

蛋白酶酶切位点木瓜蛋白酶巯基蛋白酶具有广泛特异性TPCK,TLCK,抑蛋白酶醛肽α-巨球蛋白,烷化剂胃蛋白酶酸蛋白酶广泛特异性胃蛋白酶抑制素胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶在K或R之后TLCK,PMSF,抑蛋白酶醛肽抑肽酶,α巨球蛋白人体20种氨基酸及其英文缩写

名称三字符号单字符号丙氨酸Ala A 精氨酸Arg R 天冬氨酸Asp D 半胱氨酸Cys C 谷氨酰胺Gln Q 谷氨酸Glu/Gln E 组氨酸His H 异亮氨酸Ile I 甘氨酸Gly G 天冬酰胺Asn N 亮氨酸Leu L 赖氨酸Lys K 甲硫氨酸Met M 苯丙氨酸Phe F 脯氨酸Pro P 丝氨酸Ser S 苏氨酸Thr T 色氨酸Trp W 酪氨酸Tyr Y 缬氨酸Val V 【生化】特异性蛋白酶的酶切位点胰蛋白酶arg、lys，得到以arg、lys为C末端残基的肽段。胰凝乳蛋白酶phe、trp、tyr 等疏水aa。胃蛋白酶phe、trp、tyr等疏水aa。木瓜蛋白酶arg、lys。葡萄球菌蛋白酶，磷酸缓冲液ph7.8时断裂glu、asp。碳酸氢铵缓冲液ph7.8或醋酸铵缓冲液ph4.0时断裂glu。梭菌蛋白酶arg，用于不溶性蛋白的长时间裂解。CNBr断裂Met。羟胺断裂asn—gly间的肽键。二硫键可以用巯基化合物还原法或者过甲酸氧化法断裂.。木瓜蛋白酶（Papain），又称木瓜酶，是一种蛋白水解酶。木瓜蛋白酶是番木瓜（Carieapapaya）中含有的一种低特异性蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于巯基蛋白酶，它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，因此在食品、医药、饲料、日化、皮革及纺织等行业得到广泛应用。木瓜蛋白酶是一种蛋白水解酶，分子量为23406，由一种单肽链组成，含有212个氨基酸残基。至少有三个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位，他们分别是Cys25、His159和Asp158，另外六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键,且都不在活性部位。纯木瓜蛋白酶制品可含有：（1）木瓜蛋白酶，分子量21000，约占可溶性蛋白质的10%；（2）木瓜凝乳蛋白酶，分子量26000，约占可溶性蛋白质的45%；（3）溶菌酶，分子量25000，约占可溶性蛋白质的20%；及纤维素酶等不同的酶。番木瓜未成熟果实中含有木瓜蛋白酶(Papain)、木瓜凝乳蛋白酶A(Chymopapain A )、木瓜凝乳蛋白酶B(Chym opapain B )、木瓜肽酶B (PapayaPeptidase B ) 等多种蛋白水解酶。且已知四种半胱氨酸蛋白酶的一级结构具有高度的同源性。其中，木瓜蛋白酶属巯基蛋白酶，可水解蛋白质和多肽中精氨酸和赖氨酸的羧基端，并能优先水解那些在肽键的N-端具有二个羧基的氨基酸或芳香L-氨基酸的肽键。

常用限制性内切酶酶切位点汇总

Acc65I识别位点AccI识别位点AciI识别位点AclI识别位点AcuI识别位点 AfeI识别位点AflII识别位点AflIII识别位点AgeI识别位点AhdI识别位点AleI识别位点AluI识别位点AlwI识别位点AlwNI识别位点ApaI识别位点ApaLI识别位点ApeKI识别位点ApoI识别位点AscI识别位点AseI识别位点AsiSI识别位点AvaI识别位点AvaII识别位点AvrII识别位点BaeI识别位点BamHI识别位点BanI识别位点BanII识别位点

BbvCI识别位点BbvI识别位点 BccI识别位点BceAI识别位点BcgI识别位点 BciVI识别位点 BclI识别位点 BfaI识别位点 BfuAI识别位点 BglI识别位点 BglII识别位点 BlpI识别位点 Bme1580I识别位点BmgBI识别位点BmrI识别位点BmtI识别位点BpmI识别位点Bpu10I识别位点BpuEI识别位点BsaAI识别位点BsaBI识别位点BsaHI识别位点BsaI识别位点BsaJI识别位点BsaWI识别位点BsaXI识别位点BseRI识别位点BseYI识别位点

BsiEI 识别位点BsiHKAI 识别位点BsiWI识别位点BslI 识别位点BsmAI识别位点 BsmBI识别位点BsmFI识别位点BsmI识别位点BsoBI识别位点Bsp1286I识别位点BspCNI识别位点BspDI识别位点BspEI识别位点BspHI识别位点BspMI识别位点BspQI识别位点BsrBI识别位点BsrDI识别位点BsrFI识别位点BsrGI识别位点BsrI识别位点BssHII识别位点BssKI识别位点BssSI识别位点BstAPI识别位点BstBI识别位点BstEII识别位点BstNI识别位点

胰蛋白酶溶液(0.25%)

仅供科研版本号：180320 胰蛋白酶溶液(0.25%) 【产品组成】【保存条件】 -20℃,12个月【产品概述】胰蛋白酶(Trypsin)是由胰脏产生没有活性的胰蛋白酶原分泌到小肠后，小肠内的肠肽酶会活化该酶原，形成胰蛋白酶。胰蛋白酶的特点在于已经活化的胰蛋白酶，能够继续活化更多胰蛋白酶原，这种过程即自动催化。胰蛋白酶在小肠工作，它会将蛋白质水解为肽，进而分解为氨基酸，其最适温度约为37℃。 Trypsin solution(0.25%)主要由0.25%胰酶组成，不含EDTA，经过滤除菌。本试剂可以直接用于培养细胞的消化，或者一些组织的消化，通常室温下1min左右就可以消化下大多数贴壁细胞。【使用方法】 1、贴壁细胞的消化 ①吸除培养液，用无菌PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一次，以去除残余的血清。 ②加入少量Trypsin solution，略盖过细胞即可，室温放置0.5～2min，不同的细胞消化时间有所不同。 ③显微镜下观察，细胞明显收缩，并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化；或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来，吸除胰酶细胞消化液。加入含血清的完全细胞培养液，吹打下细胞，即可直接用于后续实验。 ④如果发现消化不足，则加入Trypsin solution重新消化。 ⑤如果发现细胞消化时间过长，未及吹打细胞，细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落，直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来。1000～2000g离心1min，沉淀细胞，尽量去除胰酶细胞消化液后，加入含血清的完全培养液重新悬浮细胞，即可用于后续实验。 2、组织的消化不同的组织需要消化的时间相差很大，通常以消化后可以充分打散组织为宜。【注意事项】 1、尽量减少反复冻融的次数，以免失效。 2、在Trypsin solution过程中，要特别注意避免消化液被细菌污染。 3、Trypsin solution消化细胞时间不宜过长，否则细胞铺板后生长状况会较差。 4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。南京森贝伽生物科技有限公司网址：https://www.360docs.net/doc/a05795494.html,/ 第1页

常用限制性内切酶酶切位点保护残基

酶切位点保护碱基-PCR引物设计用于限制性内切酶发布: 2010-05-24 20:19| 来源:生物吧| 编辑:刘浩| 查看: 161 次本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列，如AccI，AflIII，AscI，AvaI，BamHI，BglII，BssHII，BstEII，BstXI，ClaI，EcoRI，HaeIII，HindIII，KpnI，MluI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，NsiI，PacI，PmeI，PstI，PvuI，SacI，SacII，SalI，ScaI，SmaI，SpeI，SphI，StuI，XbaI，XhoI，XmaI，为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。该如何添加保护碱基？添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。取1μg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2, 5 mMDTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。20%的PAGE（7M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。

重组人胰蛋白酶

重组人胰蛋白酶 Cat. No.: RHT03 CAS: 9002-07-7 EC:3.4.21.4 来源：人胰蛋白酶，基因工程生产，大肠杆菌表达 1. 重组生产，无动物源性重组人胰蛋白酶，氨基酸序列及性质与人胰蛋白酶完全相同。无动物源性，无病毒污染。可用于干细胞治疗、肿瘤的细胞治疗等过程中，无抗原性。 2. 优势安全性高重组生产，无动物源性的病毒污染，如猪流感病毒、猪细小病毒等；特殊工艺，无内源性病毒污染，无细菌、真菌、支原体污染；冻干粉，运输及储存安全，活性不易损失；不含任何蛋白酶抑制剂，如PMSF等。

?纯度高 HPLC纯化；活性特异，无其它蛋白酶活性。 ?活性高比活性不低于2500 USP u/mg。 3.用途范围胰蛋白酶是一种内肽酶，可用于赖氨酸及精氨酸C末端剪切肽键，从而将大分子蛋白裂解为小肽。胰蛋白酶广泛用于各种生物技术过程中，如：细胞培养各种组织的细胞分离；变性蛋白质的降解；蛋白质的酶解、测序；干细胞、肿瘤的细胞治疗等。 4.特性来源重组大肠杆菌纯化HPLC 产品性状白色或类白色冻干粉纯度（HPLC）≥95% 比活不低于2500 USP u/mg 其他酶含量无糜蛋白酶、羧肽酶A等污染及活性不含任何蛋白酶抑制剂无PMSF、EDTA等任何蛋白酶抑制剂

5.信息产品名称比活包装产地重组人胰蛋白酶≥2500 USP u/mg10mg,100mg,1g上海雅心活力单位：25℃，pH7.6，反应体系3.0ml (1cm 光路)，每分钟酶解BAEE使253nm下的吸收值增加0.003定义为一个USP单位。 6.相关产品重组猪胰蛋白酶；重组胰蛋白酶细胞消化液。

不同的酶切位点

ApaI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5'GGGCC^C 3' BamHI（类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^GATCC 3' BglII （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' A^GATCT 3' EcoRI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^AATTC 3' HindIII （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' A^AGCTT 3' KpnI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GGTAC^C 3' NcoI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' C^CATGG 3' NdeI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' CA^TATG 3' NheI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^CTAGC 3' NotI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GC^GGCCGC 3' SacI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GAGCT^C 3' SalI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^TCGAC 3' SphI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GCATG^C 3' XbaI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' T^CTAGA 3' XhoI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' C^TCGAG 3'

常用限制性内切酶酶切位点

AatII 识别位点 Acc65I 识别位点 AccI 识别位点 AciI 识别位点 AclI 识别位点 AcuI 识别位点 AfeI 识别位点 AflII 识别位点 AflIII 识别位点 AgeI 识别位点 AhdI 识别位点 AleI 识别位点 AluI 识别位点 AlwI 识别位点 AlwNI 识别位点 ApaI 识别位点 ApaLI 识别位点 ApeKI 识别位点 ApoI 识别位点 AscI 识别位点 AseI 识别位点 AsiSI 识别位点

AvaI识别位点 AvaII识别位点 AvrII识别位点 BaeI识别位点 BamHI 识别位点 BanI识别位点 BanII识别位点 BbsI识别位点 BbvCI识别位点 BbvI识别位点 BccI识别位点 BceAI识别位点BcgI识别位点BciVI识别位点BclI识别位点 BfaI识别位点BfuAI识别位点BglI识别位点BglII识别位点BlpI识别位点Bme1580I识别位点BmgBI识别位点BmrI识别位点

BmtI 识别位点 BpmI 识别位点 Bpu10I 识别位点 BpuEI 识别位点 BsaAI 识别位点 BsaBI 识别位点 BsaHI 识别位点 BsaI 识别位点 BsaJI 识别位点 BsaWI 识别位点 BsaXI 识别位点 BseRI 识别位点 BseYI 识别位点 BsgI 识别位点 BsiEI 识别位点 BsiHKAI 识别位点 BsiWI 识别位点 BslI 识别位点 BsmAI 识别位点 BsmBI 识别位点 BsmFI 识别位点 BsmI 识别位点

蛋白酶专一性酶切位点地影响因素分析报告

蛋白酶专一性酶切位点的影响因素分析摘要：生物活性肽(bioactive peptides)是具有特殊生理功能的肽。酶法水解蛋白质广泛用于制备生物活性肽，但酶解法存在目标肽得率低、副产物过多的缺点。蛋白酶和蛋白质的选择是关键步骤，局部构象、三维结构、实验条件以及其它偶然因素也会影响蛋白水解酶的酶切效果。本文综述了温度、pH值、温度和pH值共同作用、金属离子对酶切位点的影响，旨在为研究酶切规律、制备高得率活性肽提供理论基础。关键词：生物活性肽；蛋白酶；水解条件；酶切位点 Influencing Factors Analysis of Protease Specific Cleavage Sites Abstract:Bioactive peptides are fragments with specific amino acid sequences that exert a positive physiological influence on the body. Many reported Bioactive peptides are produced by enzymatic hydrolysis,but there are disadvantages of by-product and low yield.The choice of protease and protein source is a key step,and many factors such as local conformation,tertiary structure, experimental conditions and causal interference can influence the protease hydyolysis.This article presents the influencing fators,temperature,pH values,temperature combined pH values and metal ions included,to provide theoretical basis for enzymatic law analysis and higher yield bioactive peptides production. Key words:bioactive peptides;protease;hydrolysis conditions;protease cleavage sites 1.前言生物活性肽(bioactive peptides)是具有特殊生理功能的肽，是氨基酸以不同组成和排列方式构成的不同肽类的总称（氨基酸数目一般小于100）。生物活性肽有的是天然存在的，如谷胱甘肽、催产素、加压素、舒缓激肽、部分抗菌肽等，有的生物活性肽是以非活性的状态存在于某些蛋白质中，当用特定的蛋白酶水解后被释放出来，才成为有特定生理活性的肽。同种蛋白质经不同的蛋白酶酶解后，可以产生具有不同氨基酸序列、不同生理功能的生物活性肽，如大豆蛋白、

胰蛋白酶活力测定

实验胰蛋白酶活力测定一、原理福林—酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物（钨蓝和钼蓝）。蛋白质中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应，生成蓝色化合物，在一定的范围内，蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。二、实验仪器试管 7220分光光度计恒温水浴锅三、实验试剂福林试剂B：见福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度部分(冰箱中) 0.55mol/L碳酸钠溶液：58.3g无水碳酸钠溶于蒸馏水，稀释并定容至1000ml 10%三氯乙酸溶液 0. 2mol/L磷酸缓冲液(pH7.5)： 0.5% 酪素溶液：称取0.5g酪素，以0.5mol/L氢氧化钠1ml湿润，再

加少量0. 2mol/L 磷酸缓冲液稀释。在水浴中煮沸溶解，冷却，稀释并容至100ml ，冷藏在(冰箱)里。 500ug/L 酪氨酸溶液胰蛋白酶溶液(冰箱中) 四、实验步骤标准曲线的制作：按下表加入试剂： 0.20.40.60.81.0蒸馏水 1.0 0.80.60.40.20500ug/L 酪氨酸溶液6 54321管号各管中加0.5%酪素2ml ，于37℃水浴中反应15分钟，然后加入10%三氯乙酸3ml ，过滤除去沉淀，取清液1ml ，加入0.55mol/L 碳酸钠5ml ，再加入福林试剂1ml ，于37 ℃水浴中显色15分钟，测OD 680。以光密度为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标绘制标准曲线。样品测定：取干燥的试管2支，按下表加入试剂

0 OD6801 1福林试剂B 5.0 5.0 0.55mol/L碳酸钠溶液 37水浴中显色15分钟1 1上清液过滤3.0 3.0 10%三氯乙酸溶液1.0 0 2mg/ml胰酶溶液0 1.0 0. 2mol/L磷酸缓冲液 37水浴中酶解15分钟2.0 2.0 0.5%酪素溶液备注2 1 管号五、结果计算酶活力：在37℃下每分钟水解酪素产生lug酪氨酸为一个活力单位。样品中含酶活力单位=A/15 ╳F A—样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数 F—酶液稀释倍数原始数据：（注：7号为待测液）液体编号 0 1 2 3 4 5 7 分光光度计值 0 0.057 0.172 0.201 0.255 0.373 0.919 分光光度计值 0 0.057 0.173 0.194 0.263 0.386 0.928 分光光度计值 0 0.068 0.174 0.194 0.271 0.391 0.934

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Acc65I识别位点 AccI识别位点 AciI识别位点 AclI识别位点 AcuI识别位点 AfeI识别位点 AflII识别位点 AflIII识别位点 AgeI识别位点 AhdI识别位点 AleI识别位点 AluI识别位点 AlwI识别位点 AlwNI识别位点 ApaI识别位点 ApaLI识别位点 ApeKI识别位点 ApoI识别位点 AscI识别位点 AseI识别位点 AsiSI识别位点 AvaI识别位点 AvaII识别位点 AvrII识别位点 BaeI识别位点 BamHI识别位点 BanI识别位点 BanII识别位点

BbvCI识别位点 BbvI识别位点 BccI识别位点 BceAI识别位点 BcgI识别位点 BciVI识别位点 BclI识别位点 BfaI识别位点 BfuAI识别位点 BglI识别位点 BglII识别位点 BlpI识别位点 Bme1580I识别位点 BmgBI识别位点 BmrI识别位点 BmtI识别位点 BpmI识别位点 Bpu10I识别位点 BpuEI识别位点 BsaAI识别位点 BsaBI识别位点 BsaHI识别位点 BsaI识别位点 BsaJI识别位点 BsaWI识别位点 BsaXI识别位点 BseRI识别位点 BseYI识别位点

BsiEI识别位点 BsiHKAI识别位点 BsiWI识别位点 BslI识别位点 BsmAI识别位点 BsmBI识别位点 BsmFI识别位点 BsmI识别位点 BsoBI识别位点 Bsp1286I识别位点 BspCNI识别位点BspDI识别位点 BspEI识别位点 BspHI识别位点 BspMI识别位点 BspQI识别位点 BsrBI识别位点 BsrDI识别位点 BsrFI识别位点 BsrGI识别位点 BsrI识别位点 BssHII识别位点 BssKI识别位点 BssSI识别位点 BstAPI识别位点 BstBI识别位点 BstEII识别位点 BstNI识别位点

胰蛋白酶

胰蛋白酶简介一、介绍胰蛋白酶（C6H15O12P3）为蛋白酶的一种。在脊椎动物中，作为消化酶而起作用。在胰脏是作为酶的前体胰蛋白酶原而被合成的。作为胰液的成分而分泌，受肠激酶，或胰蛋白酶的限制分解成为活化胰蛋白酶，是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具。牛的胰蛋白酶氨基酸残基223个，分子量23800，活性部位的丝氨酸残基是不可缺少的丝氨酸蛋白酶。除存在于脊椎动物外，还存在于蚕、海盘车、蝲姑、放线菌等范围广泛的生物体中。另外与高等动物的血液凝固和炎症等有关的凝血酶、纤溶酶、舒血管素等蛋白酶在化学结构和特异性等方面与胰蛋白酶具有密切的关系，可以认为这些酶是从共同的祖先酶在进化过程中分化而来的。胰糜蛋白酶与弹性蛋白酶在结构和催化机制方面也具有密切关系，但其特异性则完全不同。胰蛋白酶系自牛、羊或猪胰中提取的一种蛋白水解酶。中国药品标准规定按干燥品计算，每1mg 的效价不得少于2500单位。由牛、羊、猪胰脏提取而得的一种肽链内切酶，只断裂赖氨酸或精氨酸的羧基参与形成的肽键。白色或米黄色结晶性粉末。溶于水，不溶于乙醇、甘油、氯仿和乙醚。分子量24 000，pI 10.5，最适pH值7.8～8.5左右。pH>9.0不可逆失活。Ca2+对酶活性有稳定作用；重金属离子、有机磷化合物、DFP、天然胰蛋白酶抑制剂对其活性有强烈抑制。临床用于抗炎消肿，工业上用于皮革制造、生丝处理、食品加工等。胰蛋白酶的分子量与其酶原接近（23300），其等电点约为pH10.8，最适pH7.6～8.0，在pH=3时最稳定，低于此pH时，胰蛋白酶易变性，在pH>5时易自溶。Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用。重金属离子，有机磷化合物和反应物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰脏、卵清和豆类植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。最近发现在一些植物的块基（如土豆、白薯、芋头等）中也存在有胰蛋白酶抑制剂。胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。胰蛋白酶对这些键的敏感性次序为：酯键> 酰胺键> 肽键。因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作为底物来测定胰蛋白酶的活力。目前常用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（简称BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（简称BANA）测定酰胺酶活力。用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（简称BAEE）和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（简称TAME）测定酯酶活力。本实验以BAEE为底物，用紫外吸收法测定胰蛋白酶活力。酶活力单位的规定常因底物及测定方法而异。从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来，然后再根据等电点沉淀的原理，调节pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原）沉淀析出。经溶解后，以极少量活性胰蛋白酶激活，使其酶原转变为有活

(人)胰蛋白酶

重组人胰蛋白酶 Cat.No.:RHT03 CAS:9002-07-7 EC:3.4.21.4 来源：人胰蛋白酶，基因工程生产，大肠杆菌表达 1.重组生产，无动物源性重组人胰蛋白酶，氨基酸序列及性质与人胰蛋白酶完全相同。无动物源性，无病毒污染。可用于干细胞治疗、肿瘤的细胞治疗等过程中，无抗原性。 2.优势安全性高重组生产，无动物源性的病毒污染，如猪流感病毒、猪细小病毒等；特殊工艺，无内源性病毒污染，无细菌、真菌、支原体污染；冻干粉，运输及储存安全，活性不易损失；不含任何蛋白酶抑制剂，如PMSF等。上海雅心生物技术有限公司

?纯度高 HPLC纯化；活性特异，无其它蛋白酶活性。 ?活性高比活性不低于2500USP u/mg。 3.用途范围胰蛋白酶是一种内肽酶，可用于赖氨酸及精氨酸C末端剪切肽键，从而将大分子蛋白裂解为小肽。胰蛋白酶广泛用于各种生物技术过程中，如：细胞培养各种组织的细胞分离；变性蛋白质的降解；蛋白质的酶解、测序；干细胞、肿瘤的细胞治疗等。 4.特性纯化HPLC 产品性状白色或类白色冻干粉纯度（HPLC）≥95% 比活不低于2500USP u/mg 其他酶含量无糜蛋白酶、羧肽酶A等污染及活性不含任何蛋白酶抑制剂无PMSF、EDTA等任何蛋白酶抑制剂上海雅心生物技术有限公司

5.信息产品名称比活包装产地重组人胰蛋白酶≥2500USP u/mg10mg,100mg,1g上海雅心活力单位：25℃，pH7.6，反应体系3.0ml(1cm光路)，每分钟酶解BAEE使253nm下的吸收值增加0.003定义为一个USP单位。 6.相关产品重组猪胰蛋白酶；重组胰蛋白酶细胞消化液。上海雅心生物技术有限公司

提取与重组胰蛋白酶的不同

胰蛋白酶与重组胰蛋白酶药典标准比较胰蛋白酶药典标准历史 2014年之前，只有从猪或牛胰腺提取的胰蛋白酶的标准，活性标准为2500USP units/mg，目前临床已不应用。在2011年左右，通过了胰蛋白酶:糜蛋白酶（6:1）配方，用于消化道疾病的治疗。在2013年12月出版了修订稿的“用于生物医药制造过程的辅助材料”，重组胰蛋白酶作为一个例子，给出标准。2017年2月，FDA正式颁布胰蛋白酶的药典标准。 2010版中国药典第二部规定: 药品的安全性保障得到进一步加强。凡例中规定所有来源于人或动物的供注射用的原料药均增订“制法要求”。在总则十四规定：（1）来源于动物组织提取的药品，其所用动物种属要明确，所用脏器均应来自经检疫的健康动物，涉及牛源的应取自无牛海绵状脑病地区的健康牛群；来源于人尿的药品，均应取自健康人群。上述药品均应有明确的病毒灭活工艺要求以及质量管理要求。（2）直接用于生产的菌种、毒种、来自人和动物的细胞、DNA重组工程菌及工程细胞，来源途径应经国务院药品监督管理部门批准并应符合国家有关的管理规范。 2010版中国药典第三部规定: 2010版药典对安全性问题更加重视。增修订细菌内毒素检查的品种达112种；药典三部增订了逆转录酶活性检查法等。培养细胞用牛血清应来源于无牛海绵状脑病地区的健康牛群，其质量应符合本药典的有关规定；在生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程中，应提供细胞培养液的详细成分，如使用人或动物源成分，如血清、胰蛋白酶、乳蛋白水解物

胰蛋白酶重组胰蛋白酶

外观形状白色或类白色溶解性可溶溶解性可溶生物载量NMT100CFU/ml 微生物限量- 比活力 (USP units/mg pro.) NLT3800 金黄色葡萄球菌阴性纯度（HPLC） NLT70%β-trysin, NMT20%α -trypsin 绿脓假单胞菌阴性沙门氏菌阴性干燥失重不高于5.0% 灼烧残渣不高于2.5% 糜蛋白酶限量不高于5.0% 活性不低于2,500USP units/mg 美国药典中，两种胰蛋白酶的标准的主要不同点: 项目胰蛋白酶2014美国药典来源动物来源：从猪或牛的胰腺提取重组（无动物源性）：DNA来源产品纯度检测方法无HPLC 活性2,500USP units/mg比活性：3800USP units/mg pro.

胰蛋白酶(Trypsin)试剂盒说明书

货号: QS2303 规格：50管/48样胰蛋白酶（Trypsin）试剂盒说明书紫外分光光度法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。测定意义：胰蛋白酶选择性水解变性蛋白质中由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，是一种重要的消化酶。此外，胰蛋白酶还广泛应用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等的辅助治疗。测定原理：胰蛋白酶催化水解BAEE的酯键，生成BA，BA在253nm处有吸收峰，通过测定253nm 吸光度增加速率，即可计算出胰蛋白酶的活性。自备实验用品及仪器：紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。试剂组成和配制：试剂一：液体50mL×1瓶，4℃保存。试剂二：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加5mL蒸馏水充分溶解。试剂三：液体50mL×1瓶，4℃保存。粗酶液提取：组织样品：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）冰浴匀浆，8000g，4℃离心10min，取上清，即粗酶液。测定操作： 1. 分光光度计预热30 min，调节波长到253 nm，蒸馏水调零。 2. 试剂二置于37℃水浴预热30min。 3. 空白管：取1mL石英比色皿，加入10μL蒸馏水，100μL试剂二，900μL试剂三，迅速混匀于253nm测定0s和60s的吸光度A1和A2，△A空白= A2-A1。 4. 测定管：取1mL石英比色皿，加入10μL粗酶液，100μL试剂二，900μL试剂三，迅速混匀于253nm测定0s和60s的吸光度A3和A4，△A测定= A4-A3。胰蛋白酶活性计算公式： (1) 按照蛋白浓度计算活性单位定义：37℃每毫克蛋白质每分钟催化253nm处吸光值增加1为1个酶活单位。胰蛋白酶（U/mg prot）= (△A测定-△A空白) ×V反总÷（Cpr×V1）÷T =101×(△A测定-△A空白) ÷Cpr Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；V1：加入反应体系中粗酶液体积（mL），10μL=0.01 mL；V反总：反应总体积，1.01mL；T：反应时间（min），1min。（2）按照样本质量计算活性单位定义：37℃每克组织每分钟催化253nm处吸光值增加1为1个酶活单位。胰蛋白酶（U/g鲜重）= (△A测定-△A空白) ×V反总÷（W×V1÷V2）÷T 第1页，共2页

重组胰蛋白酶

Cat.No.：RPT0201 CAS：9002-07-7 EC：3.4.21.4 储存温度：2-8℃ 来源：重组猪胰蛋白酶，基因工程生产，大肠杆菌表达。蛋白序列：氨基酸序列与猪胰腺来源的胰蛋白酶完全一致。 1.产品简介胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，可特异切割赖氨酸及精氨酸C末端肽键。雅心重组猪胰蛋白酶是由重组大肠杆菌表达生产，氨基酸序列与猪胰腺来源的胰蛋白酶完全一致，重组猪胰蛋白酶具有与动物源性猪胰蛋白酶相同的酶学性质，可替代猪胰腺来源胰蛋白酶应用于各种生物技术过程中。重组胰蛋白酶分子量24kD，最适pH为7.0-11.0。活性受丝氨酸蛋白酶抑制剂如PMSF等的抑制，金属离子螯合剂如EDTA等抑制酶活。 2.产品特性来源重组大肠杆菌产品外观白色、类白色、类黄色粉末比活≥3800USP units/mg pro. 纯度（蛋白电泳）单一主条带分子量（蛋白电泳）24.0±2.4kDa 活力单位：25℃，pH7.6，反应体系3.0ml(1cm光路)，每分钟酶解BAEE使253nm下的吸收值增加0.003定义为一个USP单位。 3.使用方法 1mMHCl溶解，重组胰蛋白酶浓度为1-10mg/ml。使用时，酶量：目的蛋白=1：50-1：1000，最适pH为7.0-11.0。 4.储存和运输稳定性储存稳定性：重组胰蛋白酶冻干粉存于2-8℃，24个月稳定； 1mM盐酸或50mM醋酸溶解后储存于-20℃，反复冻融10次，无活性损失。运输稳定性：蓝冰保温运输，活性稳定。 5.产品优势 ●无动物源性：重组生产，无外源性的病毒污染，生产过程不使用任何动物源原料。 ●质量稳定：批量生产，可保证稳定连续的批次生产；产品批次间无差异，质量稳定。 ●纯度高：比活高；宿主蛋白残留小于生物制品限度要求。 ●冻干粉：易于储存和运输。 ●符合法规要求：生产设备和生产环境符合相关法规要求，生产过程完全遵循NSF ISO9001:2008质量体系并符合GMP指导原则。 ●质量文件完整：按客户需求，可提供相关法规支持文件。

蛋白酶专一性酶切位点的影响因素分析

蛋白酶专一性酶切位点的影响因素分析内部编号：（YUUT-TBBY-MMUT-URRUY-UOOY-DBUYI-0128）

蛋白酶专一性酶切位点的影响因素分析摘要：生物活性肽(bioactive peptides)是具有特殊生理功能的肽。酶法水解蛋白质广泛用于制备生物活性肽，但酶解法存在目标肽得率低、副产物过多的缺点。蛋白酶和蛋白质的选择是关键步骤，局部构象、三维结构、实验条件以及其它偶然因素也会影响蛋白水解酶的酶切效果。本文综述了温度、pH值、温度和pH值共同作用、金属离子对酶切位点的影响，旨在为研究酶切规律、制备高得率活性肽提供理论基础。关键词：生物活性肽；蛋白酶；水解条件；酶切位点 Influencing Factors Analysis of Protease Specific Cleavage Sites Abstract: Bioactive peptides are fragments with specific amino acid sequences that exert a positive physiological influence on the body. Many reported Bioactive peptides are produced by enzymatic hydrolysis,but there are disadvantages of by-product and low yield.The choice of protease and protein source is a key step,and many factors such as local conformation,tertiary structure, experimental conditions and causal interference can influence the protease hydyolysis.This article presents the influencing fators,temperature,pH values,temperature combined pH values and metal ions included,to provide theoretical basis for enzymatic law analysis and higher yield bioactive peptides production. Key words:bioactive peptides;protease;hydrolysis conditions;protease cleavage sites

胰蛋白酶的制备及其在细胞培养中的应用研究

天然产物研究与开发N at Prod R es D ev 2009,21:101121014 文章编号:100126880(2009)0621011204 　　　收稿日期:2009202216 接受日期:2009206202　基金项目:西北民族大学校级中青年项目(XBMU 220062BD 282)3通讯作者Tel:862931229383112609;E 2mail:li m ingsheng@xb mu .edu .cn 胰蛋白酶的制备及其在细胞培养中的应用研究李明生 13 ,李　倬1,乔自林1,冯若飞1,马忠仁1,冯玉萍1,侯兰新1,张福梅 2 1 西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室;2西北民族大学理科实验中心,兰州730030 摘　要:无菌采集健康牛胰脏,用0.125mol/L 的硫酸对牛胰脏进行预处理和保存,并对原材料的细菌、真菌、内毒素、支原体、噬菌体和一些病毒外源因子进行检测,筛选合格原料。通过盐析、C M 2Sephar ose 2FF 层析、超滤等方法对胰蛋白酶进行提取和纯化。结果表明:经筛选原料提纯的胰蛋白酶通过细胞传代实验240h 后,细胞生长良好,形态正常,而未经筛选直接提取的胰蛋白酶通过细胞传代实验144h 后,细胞出现拉丝、病变等异常情况。关键词:胰蛋白酶;原料;控制中图分类号:Q814.1;Q814.9;R285 文献标识码:A Prepara ti on and Trypsi n i n Cell Culture Appli ed Research L IM ing 2sheng 13,L I Zhuo 1,Q I A O Zi 2lin 1,FE NG Ruo 2fei 1 ,MA Zhong 2ren 1,FE NG Yu 2p ing 1,HOU Lan 2xin 1,ZHANG Fu 2mei 2 1 Key B io 2engineering &Technology L aboratory of S tate Ethnic A ffairs Co mm ission of N orthw est U niversity for N ationalities ; 2 Science Experi m ent Center of N orthw est U niversity for N ationalities,L anzhou 730030,China Abstract:A sep tic acquisiti on healthy cattle pancreas,with 0.125mol/L sulfate of bovine pancreas p r ocessing and p res 2ervati on,and the ra w material of bacteria,fungi,endot oxin,Mycop las ma,phage and s ome virus detecti on of exogenous fact ors,screening qualified ra w materials .Thr ough salting 2out,FF 2C M 2Sephar ose chr omat ography,ultrafiltrati on method of tryp sin t o extract and purify,the results showed that the selecti on of ra w materials thr ough the purificati on of tryp sin and experi m ental cells 240h (5generati ons ),the cell gr owth good,nor malmor phol ogy,and without screening tryp sin di 2rectly fr om the cells thr ough the experi m ental 144h,the cells were drawing lesi ons such as abnor mal .Key words:tryp sin;ra w materials;contr ol 胰蛋白酶是一种动物来源的蛋白水解酶,广泛存在于动物的胰脏,是一些生物制药的主要原辅材料。随着生物制药的不断发展,因胰蛋白酶质量问题造成生物制药的质量安全问题也越来越引起人们的关注。目前,胰蛋白酶在细胞工程方面的应用主要体现在疫苗的生产与研究,最终产品直接或间接的用于人体,因此,胰蛋白酶的质量好坏直接关系到人类的健康,甚至生命安全。要控制好胰蛋白酶的质量安全,对原材料的把关是关键,由于胰蛋白酶来源于生物体,其成分复杂,单靠检验标准很难达到质量安全。一旦由胰蛋白酶途经带入,会大大影响到细胞培养,甚至影响到疫苗的产量和质量。国内对细胞培养用胰蛋白酶制备尚不成熟,且大都对原材料没有进行严格的筛选,质量控制的研究内容也不够全面。本实验选择健康的牛源,在无菌环境下进行采集牛胰脏;采用合理、有效、安全的方法对原材料进行处理和保存,并对采集的原料进行细菌、真菌、内毒素、支原体、噬菌体和一些病毒外源因子的检测,通过检验筛选合格的原料,为后续的胰蛋白酶提取工艺和质量控制提供保障。 1　材料和方法 1.1　材料 1.1.1　主要材料试剂牛胰脏、实验用所有细胞、实验用所有培养基(均由兰州民海生物工程有限公司提供)、N 2苯甲酰2L 2精氨酸乙酯盐酸盐(上海如吉科技发展有限公司)、胰蛋白酶1:250(Hycl one )、鲎试剂(湛江,安度斯)