大肠埃希菌对阿莫西林_克拉维酸耐药机制的研究
文章编号:1001-8689(2009)07-0437-04
大肠埃希菌对阿莫西林/克拉维酸耐药机制的研究
丁娟娟
1,2
吕晓菊
1,＊
陈筱纯1 吴疆1 高燕渝1 马晓波
1
(1四川大学华西医院感染性疾病中心, 成都610041;2河南省人民医院, 郑州450003)
摘要: 目的 探讨大肠埃希菌对阿莫西林/克拉维酸的耐药特点和机制,为临床合理用药提供依据。方法 收集四川大学华西医院2005年5月至12月临床分离的544株大肠埃希菌经微量肉汤稀释法确认对氨苄西林/舒巴坦耐药的大肠埃希菌,从中随机选取276株用药敏纸片检测,仅52株对阿莫西林/克拉维酸耐药。对符合耐酶抑制剂β-内酰胺酶耐药表型的2株大肠埃希菌进行T E M 型β-内酰胺酶基因的克隆表达。采用多重P C R 技术检测耐阿莫西林/克拉维酸大肠埃希菌的T E M 、S H V 、O X A 型3种β-内酰胺酶。结果 52株大肠埃希菌含T E M 型46株,S H V 型1株,O X A 型6株。其中同时含T E M 型和S H V 型1株以及含T E M 型和O X A 型5株。结论 T E M -1型广谱酶的高产是华西医院大肠埃希菌对阿莫西林/克拉维酸耐药主要机制,另外本次研究首次在西南地区发现O X A -1型E S B L s ,也是造成耐药的重要机制。
关键词: 大肠埃希菌; 阿莫西林/克拉维酸; 耐药性; 耐酶抑制剂T E M 型β-内酰胺酶 中图分类号:R 378.2+1 文献标识码:A
Me c h a n i s m s o f r e s i s t a n c e t o a m o x i c i l l i n /c l a v u l a n a t e i n E s c h e r i c h i a c o l i i s o l a t e s
D i n g J u a n -j u a n 1,2
, L ǜX i a o -j u 1
, C h e n X i a o -c h u n 1
, W u J i a n g 1
, G a o Y a n -y u 1
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1
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A B S T R A C T O b j e c t i v e T os t u d ya m o x i c i l l i n /c l a v u l a n a t e -r e s i s t a n t E s c h e r i c h i ac o l i i s o l a t e df r o m W e s t C h i n a H o s p i t a l o f S i c h u a nU n i v e r s i t y ,a n da n a l y z e t h e r e s i s t a n t m e c h a n i s m s o f t h e s e i s o l a t e s ,s o a s t o p r o v i d e e v i d e n c e f o r
c l i n i c a l t h e r a p y i n i n f e c t i o n s c a u s e
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f f u s i o n m e t h o d (i n h i b i t i o nz o n ed i a m e t e r ≤13m m ).T h e
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收稿日期:2008-12-22 修回日期:2009-04-27
作者简介:丁娟娟,女,生于1979年,主治医师。研究方向:感染性疾病。 ＊通讯作者,E -m a i l :l v x j 3396@y a h o o .c o m .c n
β-内酰胺酶是革兰阴性菌产生耐药的最重要和常见机制之一。为了控制耐药菌株的感染,相应的对策有:(1)临床使用不易被β-内酰胺酶水解的新型广谱抗生素;(2)应用β-内酰胺类/β-内酰胺酶抑制剂复合
制剂。除酶抑制剂可使β-内酰胺酶失活外,两者合用还有协同作用[1]
。现含β-内酰胺酶抑制剂的复合制
剂主要有:氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸、替卡西林/克拉维酸、哌拉西林/三唑巴坦、美洛西林/舒
·
437·中国抗生素杂志2009年7月第34卷第7期
巴坦和头孢哌酮/舒巴坦。随着β-内酰胺类/β-内酰胺酶抑制剂复合制剂的广泛临床应用,细菌对其耐药性也逐年增加。阿莫西林/克拉维酸有较广的抗菌谱。随着它在临床上的广泛应用,耐药性也逐年增加,研究较多的是大肠埃希菌对阿莫西林/克拉维酸的耐药机制,其主要耐药机制
[1]
有:(1)质粒介导的T E M -1、
T E M -2或S H V -1广谱β-内酰胺酶的高产;(2)质粒介导A m p C 酶;(3)产O X A 酶;(4)O m p F (o u t e r
m e m b r a n e p r o t e i n )和/或O m p C 孔道蛋白的缺失;(5)耐酶抑制剂的β-内酰胺酶(i n h i b i t o r -r e s i s t a n tβ-l a c t a m a s e s ,I R B L )。主要为T E M 型(i n h i b i t o r -r e s i s t a n t T E M β-l a c t a m a s e ,I R T ),S H V 型少见(i n h i b i t o r -r e s i s t a n t S H V β-l a c t a m a s e ,I R S )。其中I R T 是T E M -1和T E M -2经过数个点突变而成的,主要来源于T E M -1,源于T E M -2的较少。本研究就大肠埃希菌对阿莫西林/克拉维酸主要耐药机制中的3种机制进行探讨。1 材料
1.1 菌株与载体来源
收集四川大学华西医院2005年5月至12月临床分离的对氨苄西林/舒巴坦耐药的大肠埃希菌544株,剔除同一患者相同部位的重复菌株。菌种经M i c r o S c a n W a l k A w a y -40型全自动细菌鉴定仪鉴定。产T E M -l 酶菌株、大肠埃希菌J M 109、质控大肠埃希菌A T C C 25922、A T C C 35218由四川大学华西医院感染性疾病中心实验室提供,产I R T -2的大肠埃希菌由法国波尔多第二大学(U n i v e r s i t y o f B o r d e a u x Ⅱ)C l a u d i n e Q u e n t i n -N o u r y 教授赠送。p E T 30a (+)表达载体购自上海英骏公司。
1.2 抗菌药物纸片
阿莫西林/克拉维酸药敏纸片(20/10μg )为O x o i d 公司产品。
1.3 抗菌药物头孢西丁(广州博州药业,效价为90.0%)、哌拉西林/三唑巴坦(惠氏制药,效价为86.1%)、阿莫西林(中国药品生物制品检定所,效价为8
2.1%),克拉维酸(中国药品生物制品检定所,效价为95.0%)、亚胺培南/西司他丁(杭州默沙东制药有限公司,效价为50.0%)、头孢唑林(哈尔滨制药总厂,效价为94.2%)、头孢他啶(深圳九新药业,效价为77.5%)。1.4 培养基和试剂
M H 琼脂为杭州天和微生物试剂有限公司产品,小量质粒抽提纯化试剂盒为成都天泰生命科技有限公司提供,H o t S t a r M a s t e r m i x 和胶回收试剂盒为成都博瑞克公司提供。琼脂糖凝胶电泳D N A M a r k e r 为
M a r k e r Ⅰ。1.5 主要仪器设备
英国D e n l e y 公司生产的多点接种仪,法国B i o -M e r i e u x 公司生产的细菌比浊仪,德国E p p e n d o r f 生产的
P C R 扩增仪,美国B I O -R A D 公司生产的凝胶成像系统。2 方法2.1 药敏试验
采用C L S I 推荐的纸片扩散法(K B 法),对所有大肠埃希菌作阿莫西林/克拉维酸耐药的初筛,按C L S I 推荐的琼脂平皿对倍稀释法测定抗菌药物对实验菌株的M I C 值。以C L S I 2006版常规标准判断。2.2 T E M 型β-内酰胺酶编码基因的P C R 扩增
根据大肠埃希菌的T E M -1基因序列进行设计,引物序列如下:引物
A :(H i n d Ⅲ)5'-G C G A A G C T T A T G A G T A T T C A A C A T T T T C G T G T C -3';引物
B :(B a m H Ⅰ)5'-G
C G G G A T C C T T A C C A A T G C T T A A T C A G T G A G -3'。上下游引物5'端分别引入B a m H Ⅰ、H i n d Ⅲ的酶切位点和保护碱基,引物由上海英骏公司合成,目的片段为861b p 。采用质粒提取试剂盒,操作过程按试剂盒说明进行,P C R 扩增条件:先95℃预变性5m i n ,然后进入循环,循环参数为:98℃变性30s ,55℃复性15s ,72℃延伸1m i n ,共30个循环,末次循环再延伸7m i n 。反应结束后取5μl 扩增产物于0.8%琼脂糖凝胶中电泳检测结果。
2.3 P C R 产物的纯化和克隆
将耐药菌株的P C R 扩增产物和质粒p E T 30a (+)用B a m H I 和H i n d Ⅲ双酶切后,用D N A 连接试剂盒进行连接,转化大肠埃希菌J M 109株感受态细胞,含卡那霉素(50m g /L )的M H 培养基筛选。随机挑取转化后生长出的重组菌提取质粒,用质粒提取试剂盒提取重组菌株中的质粒,经B a m H Ⅰ和H i n d Ⅲ酶切鉴定。2.4 多重P C R 扩增
根据文献[2]
T E M 、S H V 、O X A 型基因特异性引物见T a b .1(引物均为上海英骏公司合成)。P C R 反应体系(25μl ):2×H o t S t a r M a s t e r m i x 12.5μl 、O X A -1上下游引物各1.875μl 、T E M -1上下游引物各1.25μl 、S H V -1上下游引物各0.625μl (引物浓度均为20m m o l /L )、质粒模板D N A 2μl 、重蒸水3μl 。P C R 扩增条件参见文献
[2]
。
2.5 P C R 产物分析与测序
P C R 产物在含0.5m g /LE B 的1.5%琼脂糖凝胶上电泳,在凝胶成像系统上成像,出现预期目的条带判为阳性,保存图像,并在紫外灯下切胶回收。随机抽取15株大肠埃希菌的阳性(T E M 、S H V 、O X A 型基因)扩
·
438·大肠埃希菌对阿莫西林/克拉维酸耐药机制的研究 丁娟娟等
增纯化产物和3株大肠埃希菌的扩增阳性(A m p C酶基因)纯化产物直接测序,测序工作委托上海英骏生物技术有限公司用3730测序仪完成。
3 结果
3.1 细菌及其临床流行病学特点
2005年5月至12月期间,从四川大学华西医院临床微生物室共分离出总分离出727株大肠埃希菌,经微量肉汤稀释法确证其中544株对氨苄西林/舒巴坦耐药,随机选取276株用药敏纸片扩散法检测有52株对阿莫西林/克拉维酸耐药。细菌标本的主要来源是痰液(41.6%),其次为尿液(25.1%)。患者的平均年龄为:55±20岁,以男性多见(56.6%)。
3.2 药敏结果
上述52株大肠埃希菌经琼脂对倍稀释法的药敏结果如T a b.2。虽然所有菌株纸片药敏法确定对阿莫西林/克拉维酸耐药,但仍有21.2%的菌株经琼脂对倍稀释法确认为敏感。同样作为复合制剂的哌拉西林/三唑巴坦,大多数菌株(80.8%)对其仍然敏感。而绝大多数菌株(98.1%)对亚胺培南/西司他丁敏感。仅2株对头孢唑林敏感。对头孢西丁和头孢他啶耐药率分别为73.1%和26.9%。
3.3 耐药菌株中T E M型β-内酰胺酶编码基因的P C R结果
符合I R T耐药表型(对阿莫西林/克拉维酸耐药, T a b.1 S e q u e n c e s o f P C Rp r i m e r s
P r i m e r s S e q u e n c e s(5'-3')S i z e(b p)R e f e r e n c e S H V-F A G G A T T G A C T G C C T T T T T G392[2]
S H V-R A T T T G C T G A T T T C G C T C G
T E M-F A T C A G C A A T A A A C C A G C516[2]
T E M-R C C C C G A A G A A C G T T T T C
O X A-F A T A T C T C T A C T G T T G C A T C T C C619[2]
O X A-R A A A C C C T T C A A A C C A T C C
T a b.2 S u s c e p t i b i l i t yt e s t o f52E.c o l i s t r a i n s a g a i n s t
a n t i m i c r o
b i a l a g e n t s
A n t i m i c r o b i a l a g e n t s
S
n(%)
I
n(%)
R
n(%)
A m o x i c i l l i n/c l a v u l a n a t e11(21.2)1(1.9)40(76.9) P i p e r a c i l l i n/t a z o b a c t a m42(80.8)8(15.4)2(3.8) C e f a z o l i n2(3.8)0(0)50(96.2) C e f o x i t i n9(17.3)5(9.6)38(73.1) C e f t a z i d i m e24(46.2)14(26.9)14(26.9) I m i p e n e m/c i l a s t a t i n51(98.1)0(0)1(1.9) S:s u s c e p t i b i l i t y;I:i n t e r m e d i a t e;R:r e s i s t a n t.对头孢唑林敏感)的两株耐药菌株(E c-A、E c-B)为研究对象,提取的质粒D N A为模板,以引物A和引物
B 进行P
C R扩增,扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后显示出一条大小约为861b p的
D N A条带,与预计目的基因片段大小相符(F i g.1)。
3.4 p E T30a(+)/T E M型酶基因重组质粒的构建及鉴定
p E T30a(+)/T E M阳性重组质粒分别经B a m HⅠ和H i n dⅢ进行双酶切,琼脂糖凝胶电泳分别见大小约为861b p和5.5k b的两条D N A条带,见F i g.2。表明T E M编码基因已经正确接入载体中,重组质粒经大连宝生物工程有限公司测序,测序结果在国际互联网上进行B L A S T检索分析,与G e n B a n k中T E M-1基因序列的同源性为100%。
3.5 耐药菌株与重组菌株耐药性分析
重组细菌仅对氨苄西林耐药,对阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林/三唑巴坦敏感。对头孢菌素类和亚胺培南均敏感。参照C L S I抗菌药物对大肠埃希菌M I C值判定标准(μg/m l)(2006年)。
3.6 多重P C R结果
对阿莫西林/克拉维酸耐药的52株大肠埃希菌中,各型β-内酰胺酶情况是:只含T E M型40株;只含O X A型1株;同时含T E M型和S H V型1株,同时含T E M型和O X A型5株。总计含T E M型46株,含S H V 型1株,含O X A型6株,P C R产物电泳结果见F i g.3
。
M:D L2000;1:p o s i t i v e c o n t r o l;
2、3:E c-Aa n dE c-B;4:n e g a t i v e c o n t r o l
F i g.1 b l a
T E M
P C Ra m p l i f i c a t i o no f t h ei s o l a t e dE c-Aa n d
E c-
B
M1:M a r k e rⅣ;M2:D L2000;
1:p E T30a(+)-I R Td i g e s t e db yH i n dⅢa n dE c o RⅠ;
2、3:p E T30a(+)-T E M i n Aa n d Bd i g e s t e db y H i n dⅢa n dE c o RⅠ
F i g.2 C h a r a c t e r i z a t i o n o f p E T30a(+)w i t hT E M g e n e
·
439
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中国抗生素杂志2009年7月第34卷第7期
M :M a r k e r Ⅰ;1、7:b l a T E M -1a n d b l a O X A -1;
2、3a n d 8:i s o l a t e s p r o d u c i n g n e g a t i v e r e s u l t ;4、5、6、9～11:i s o l a t e s p r o d u c i n gb l a T E M -1
F i g .3 A g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f p r o d u c t s a m p l i f i c a t e d
b y m u l t i p l e x P C R
3.7 测序结果
送检的T E M 型14份均为T E M -1型,为广谱β-内酰胺酶;1份S H V 型阳性扩增产物为S H V -1型;O X A
型6份均为O X A -1型。4 讨论
(1)大肠埃希菌对3种含酶抑制抗生素的敏感性 本次研究发现,大肠埃希菌对氨苄西林/舒巴坦复合制剂的耐药率为74.8%(544/727),对阿莫西林/克拉维酸复合制剂的耐药率为19.5%,不难看出大肠埃希菌对氨苄西林/舒巴坦耐药情况并不能代表其对阿莫西林/克拉维酸的耐药状况,这与文献[3～5]
报道也基本
一致。H e n q u e l l 等[6]
认为大肠埃希菌对氨苄西林/舒巴坦和阿莫西林/克拉维酸的敏感性都受β-内酰胺酶的产量的影响,但对后者的影响程度较轻,产少量β-内酰胺酶的大肠埃希菌对后者依然敏感。本文52株大肠埃希菌对哌拉西林/三唑巴坦复合制剂的耐药率最低3.8%。充分显示了哌拉西林/三唑巴坦复合制剂的优良特性,可能与哌拉西林对产耐酶抑制剂β-内酰胺酶大肠埃希菌有内在的杀菌活性有关[7]
。含不同酶抑制剂的3种抗生素之间相比较,除了有抗生素抗菌能力及酶抑制剂抑酶能力、菌素产酶数量等因素之外,本文还涉及几种不同检测方法,也会有一定影响,但总的来看在氨苄西林/舒巴坦耐药的情况下,临床尚可考虑选用后两者,其中对哌拉西林/三唑巴坦的耐药率最低。
(2)产T E M 型β-内酰胺酶送检测序14株均为T E M -1型 T E M 型酶T E M -1型广谱酶是革兰阴性菌中最常见的β-内酰胺酶,超过90%大肠埃希菌含
T E M -1型广谱酶耐氨苄西林[8]
。
(3)I R T 耐药表型 在T E M -1编码基因的基础上发生一个或数个点突变,大部分突变酶成为E S B L s ,目
前报道的有100多种[9]
,T E M -1经过数个点突变也能成为I R T ,已报道的有20多种。I R T 是耐酶抑制剂β-内酰胺酶的T E M 型,不受酶抑制剂抑制。产I R T 菌株
拉维酸(通常包括哌拉西林)、替卡西林/克拉维酸耐药;对窄谱头孢菌素、头霉素类、超广谱头孢菌素(在大多数情况下包括哌拉西林/三唑巴坦)敏感,与O X A
型β-内酰胺酶耐药表型极其类似[1]
。本次实验仅发
现2株大肠埃希菌对阿莫西林/克拉维酸耐药,对头孢唑林敏感。符合I R T 的耐药表型。通过对这2株菌
T E M 型β-内酰胺酶编码基因的克隆表达,B L A S T 比对发现T E M -1型基因序列符合率为100%,也未发现任何突变位点,并没有发现耐酶抑制剂的β-内酰胺酶。可能的原因:①I R T 在本次分离的菌株中确实不存在;②本课题研究中只是靠耐药表型来筛查I R T ,要受其它耐药机制的影响,等电点测定、酶动力学参数和酶抑制剂50%抑菌浓度(I C 50)都是筛查β-内酰胺酶比较特异的方法,因此有待进一步研究。
(4)O X A 型酶 本次实验在西南地区首次在大肠埃希菌中发现O X A -1型E S B L s 。由于同一种细菌同时产多种来源的E S B L s 较为多见,O X A -1型E S B L s 的耐药表型与酶的特征需要进一步克隆表达才能明确。O X A 型E S B L s 不同类型之间同源性差,本次仅设计扩增O X A -1的引物,其它类型的O X A 型E S B L s 有待进一步研究。
(5)含2种以上耐药基因 本次研究有6株可检出≥2种耐药基因,其中检出T E M -1+S H V -1酶1株、T E M -1+O X A -1酶5株。因此造成这些菌株对阿莫西林/克拉维酸耐药可能是两种酶的共同作用,也可能是单独作用,具体机制需要进一步克隆表达分析酶的活性、分析上游启动子序列等研究明确。由于多种耐药基因的并存,许多菌株显示出多重耐药的趋势,给临床用药造成一定困难。
参 考 文 献
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