逆转录PCR讲义
逆转录—巢式PCR（nested RT-PCR）
一、实验目的：
学习RT-PCR反应的基本原理。
掌握血液等液体标本中提取RNA并逆转录的技术。
了解其他标本（如组织块）中提取RNA的技术。
二、实验原理
RT-PCR是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经逆转录酶的作用以RNA为模板合成cDNA，再以cDNA为模板扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。
巢式PCR是一种特殊的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物（外引物）扩增片段与普通PCR相似；第二对引物（内引物）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次继续在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR特异性非常高。
三、主要仪器
PCR扩增仪、高速冷冻离心机/台式高速离心机、Vortex震荡混匀器、水平电泳仪、凝胶成像系统、电热恒温水浴锅
四、主要试剂
TRIzol Reagent TM、AMV逆转录酶、RNA酶抑制剂、Taq DNA聚合酶（MgCl2）、dNTP Mixture，10 mmol/L、琼脂糖、溴化乙锭*、DNA Marker、三氯甲烷（氯仿）、异丙醇DEPC*（焦碳酸乙二酯）处理水：加100μl DEPC于100ml超纯水中，使DEPC的体积分数为0.1%，室温震荡至少4h；然后高压蒸汽灭菌20min。溶解RNA所需的DEPC水
用无RNase的1.5ml 微量离心管分装，-20℃保存；用于配置75%乙醇的DEPC水则直接置于4℃保存。
75%乙醇溶液：取75ml无水乙醇用DEPC处理水定容至100ml，4℃保存。所用容器及量筒均需洗净后200℃干烘8h。
5×TBE：Tris碱54g，硼酸27.5g，0.5mol/L EDTA（pH8.0）20ml，加蒸馏水定容至1L，室温保存。
0.5×TBE缓冲液：用蒸馏水将50×TBE缓冲液稀释10倍，于室温下保存。
五、操作步骤
病毒RNA的提取：
1. 将待测标本、阴阳性对照取出解冻；再取出2套RNase-free（无RNase）的1.5ml微
量离心管和2支RNase-free的0.5ml微量离心管，并进行标记；
2. 取一套标记好的离心管，每管加入TRIzol 500μl，再加入100μl血清/细胞培养液等液
体标本和对照（阴性对照最先加，标本居中，阳性对照最后加；注意将枪尖伸至TRIzol 中），用Vortex震荡混匀5sec（液体无明显分层），室温静置5min；
3. 每管加入氯仿100μl（注意沿着管壁加液，避免液体飞溅），用Vortex震荡混匀15sec
（液体无明显分层），室温静置3min；
4. 4℃、12000rpm离心15min；待离心结束后，小心吸取上层水相至另一套标记好的
RNase-free的1.5ml 微量离心管，加入等体积异丙醇（根据吸取的量估算，可适当多加一些；注意沿着管壁加液，避免液体飞溅），颠倒混匀，室温静置15-30min；同时，确认恒温水浴锅已打开；
5. 4℃、12000rpm离心10min；待离心结束后，直接倒去上清，每管加入75%乙醇500μl
重悬沉淀（注意沿着管壁加液，避免液体飞溅），轻柔颠倒混匀5次；与此同时，取出特异性引物/寡核苷酸引物/随机引物、RNasin、5×RT Buffer、dNTP Mixture解冻；
6. 4℃、8000rpm离心5min；待离心结束后，小心倒去上清；用瞬时离心机简短离心1-2s，
仔细观察沉淀位置，沿管壁吸出底部残余液体；室温晾干5-10min（应防止过分干燥）；
7. 最后加入20μl DEPC处理水溶解RNA沉淀，直接用于后续实验，或保存于-80℃备用。
逆转录（RT）：
在0.5ml RNase-free（无RNase）的微量离心管中依次加入：
DEPC处理水9.0μl
外循环下游引物（20pmol/μl）0.6μl
RNA酶抑制剂（40U/μl）0.1μl
总体积9.7μl 再加入RNA溶液5μl，70℃水浴5min，再冰浴5min；
再依次加入：
5×AMV逆转录反应缓冲液 4.0μl
dNTP Mixture（10mol/L） 1.0μl
RNA酶抑制剂（40U/μl）0.1μl
AMV逆转录酶（5U/μl）0.2μl
总体积 5.3μl 42℃温育40min。
巢式PCR（nested PCR）：
第一轮PCR扩增体系为：
10×PCR反应缓冲液 2.0μl
MgCl2（25mol/L） 1.2μl
dNTP Mixture（10mol/L）0.2μl
上游引物（20 pmol/μl）0.2μl
下游引物（20 pmol/μl）0.2μl
Taq DNA聚合酶（5U/μl）0.2μl
cDNA 2.0μl
dd H2O补足反应体积至20μl 第二轮PCR扩增体系为：
10×PCR反应缓冲液 2.0μl
MgCl2（25mol/L） 1.2μl
dNTP Mixture（10mol/L）0.2μl
上游引物（20 pmol/μl）0.2μl
下游引物（20 pmol/μl）0.2μl
Taq DNA聚合酶（5U/μl）0.2μl
第一轮PCR产物 2.0μl
dd H2O补足反应体积至20μl
PCR仪扩增条件为：
94℃预变性5min
94℃变性30s
53℃复性30s 35个循环
72℃延伸40s
72℃再延伸5min
PCR产物的检测（琼脂糖凝胶电泳）：
1. 琼脂糖凝胶板的制备：称取
2.0g琼脂糖，加入100ml 0.5×TBE，于微波炉中加热融化
均匀，冷却到60-70℃加EB至终浓度0.5μg/ml，倒入封好的凝胶槽，厚度约3-5mm，在距底板0.5-1mm的位置放置样品梳，待冷却成形后取出梳子及隔板，放入水平电泳槽中，缓冲液没过胶面1-2mm即可；
2. 加样：样品中加入1/5体积的6×凝胶上样缓冲液，混匀，取5-6μl加入凝胶点样孔中，
同时加入DNA Marker；
3. 电泳：100V恒压，电泳30min，使PCR产物向阳极移动。待溴酚蓝移至凝胶的2/3
距离时，关闭电源；
4. 取出凝胶，置于紫外交联透射仪上检测扩增条带并在凝胶成像系统下拍照。
首先，你要确认切胶后是否回收到了RT—PCR的产物（方法、操作不当会导致回收失败）。是否用了分光光度计、电泳测定过有没有回收到。如果没有回收到，当然扩增不出来。
其次，如果RT—PCR的产物少，加上回收损失，得到的回收量很少，也不能扩增出来。另外还有可能就是回收的RT—PCR的产物保存是否得当，可能已经降解了。
对cDNA稀释的倍数不大的话，应该没问题。