毕业论文(生物制药)[1]
甘肃省职业技术学院毕业论文(设计)
题目土霉素的生产工艺
学生姓名孙双吉
学号 22
院系生物技术与制药
专业生物制药
指导教师王鏴菊
二〇一二年四月二十九日
土霉素的生产工艺
孙双吉甘肃省职业技术学院750001
摘要：目的：土霉素生产工艺的概述。方法：土霉素提取工艺是通过黄血盐-硫酸锌作净化剂协同去除蛋白质等高分子杂质，然后用122-2树脂脱色进一步净化土霉素滤液，最后调pH 至4.8左右结晶得到土霉素碱产品。
关键词：生产工艺；土霉素；黄血盐-硫酸锌
1 土霉素概述
土霉素又称为地霉素或氧四环素，英文名称（Terramycin Oxytetracycline)属于抗菌素的一种，对多种球菌和杆菌有抗菌作用，对立克次体和阿米巴病原虫也有抑制作用，用来治疗上呼吸道感染﹑胃肠道感染﹑斑疹伤寒等，现今主要用于畜禽药及饲料添加剂。土霉素是一个典型的利用生物工程技术生产的产品，生产工艺涉及种子培养、发酵、提取、过滤、脱色、结晶、离心和干燥等重要的单元操作和工程概念，通过对联邦制药（内蒙古)有限责任公司土霉素的生产工艺的实习，可以提高理论联系实际与综合应用所学知识的能力。
1.1 土霉素简介
1.1.1 名称与化学结构式
中文名：土霉素
英文名：OXYtetracycline
化学名：(4s,4аR，5S，5аR，6S，12аS）-N-4-二甲胺基-1，4，4а，5，5а，6，11，12а-八氢，5, 6，10，12，12а- 六羟基-6-甲基-1，11-二氧代并四苯-2-甲酰胺。
分子式：C22H24N2O9 相对分子质量：460.58
1.1.2 性状与理化性质[1]
土霉素又名氧四环素，为灰白色至黄色的结晶粉末，无臭，味苦，熔点是180℃，在日光下颜色变暗在碱性溶液中易破坏失效。土霉素盐酸盐为黄色结晶，味苦，熔点190～194℃，有吸湿性，但水分和光线不影响其效价，在室温下长期保存不变质，不失效。盐酸盐易溶于
水，溶于甲醇，微溶于无水乙醇，不溶于三氯甲烷和乙醚，在酸性条件下不稳定。添加到饲料中，在室温下保存四个月，效价下降4%～9%，制粒时效价下降5%～7%。
1.2土霉素生产菌种
土霉素是由放线菌（龟裂链霉菌）所产生的抗生素。土霉素钙盐是发酵培养液中入碳酸钙，经过滤，干燥而制得。
2 土霉素生产工艺
2.1土霉素的生产工艺流程概述
土霉素生产工艺主要分为：发酵、酸化过滤、脱色结晶、离心干燥四个阶段。其生产工艺流程，如图2.1：
图2.1 土霉素的生产工艺流程简图
2.2 发酵工艺流程
2.2.1 斜面孢子制备
首先培养三支斜面孢子, 斜面孢子的培养基是由麸皮和琼脂组成，用水配制。培养孢子条件：斜面孢子在36.5～36.8℃培养，不得高于37℃。若36℃超过2小时则生产能力明显下降，不可用于生产。而且在袍子培养过程中还需保持一定相对湿度，湿度55%～60%。培养时间96个小时。将三支斜面孢子加入无菌水之后制成悬浮液。将悬浮液放置于4℃～6℃的冰箱中备用。
2.2.2 一级种子罐发酵
一级种子罐采用实罐蒸汽灭菌法灭菌。培养温度为31℃，采用夹套式换热（自动温度调
节），罐内生长弱，无动力设备，设备密封。发酵约28h，培养液可趋于浓厚，并转黄色，种子培养液pH值为6.0～6.4时，移入二级种子罐。
2.2.3 二级种子罐发酵
二级种子罐采用实罐蒸汽灭菌法灭菌。培养温度为31℃，采用夹套式换热（自动温度调节），有搅拌动力设备。二级罐发酵约28h，培养液外观深粽、稠、有气泡，pH大于6.0移入三级发酵罐。
2.2.4 三级发酵罐发酵
三级发酵罐采用实罐蒸汽灭菌法灭菌，接种量为15～20%，发酵全程温度控制在30～31℃，分段培养。采用列管式换热（自动温度调节），有搅拌动力设备。发酵过程，菌体大量生长，培养基快速消耗，需要对其进行补料控制。发酵导致pH降低，需补氨水调节pH。产生的大量泡沫，需加消沫剂进行消沫。发酵过程消耗氧气，需通氧补充，通气量为：0.8～1.0v/m。发酵过程通氨、补糖的工艺具体控制的方法不甚相同。接种后发酵pH低于6.4时，开始通氨，通氨量的多少参考pH。要求100h前pH在6.3～6.5，100h后pH6.2～6.3，放罐前8小时停止通氨。根据发酵液的残糖值补入总糖(即淀粉酵解液)，一般在100h前残糖控制4.0～5.0%，100h至150h控制3.5～4.0%，150h至放罐前6h控制3.0%。在菌丝接近自溶期前放罐。
2.3 酸化过滤工艺流程
2.3.1 酸化
土霉素能和钙、镁等金属离子，某些季胺益、碱等形成复合物沉淀(即不溶性络合物)。在发酵过程中，这些复合物积聚在菌丝中，在液体中的浓度不高。发酵结束后，土霉素大部分沉积在菌丝中，发酵液中很少。因此，应对土霉素发酵液进行酸化等处理，使菌丝中的单位释放出来，以保证产品收率和质量。
2.3.1.1酸化剂的选择
酸化剂一般可采用盐酸、硫酸、草酸、磷酸等，但根据土霉素滤液质量的要求，若滤液中有钙离子存在，则对直接沉淀是否完全有一定的影响，通过生产实践认为采用草酸作酸化剂较好。因为草酸去钙较完全，析出的草酸钙还能促进蛋白质的凝结，提高滤液质量。草酸属于弱酸，比盐酸、硫酸等对设备腐蚀性较小，但其价格较贵，并可促使差向土霉素等异构物的产生。在采用草酸作酸化剂时，必须降低温度，要求15℃以下，尽量缩短操作时间，避免或减少差向异构化。在有条件的情况下，应进行草酸回收工作。鉴于以上因素，酸化剂采用草酸和盐酸。
2.3.1.2酸化pH的控制
加草酸酸化调pH的目的是为释放菌丝中的单位，同时还得考虑土霉素的稳定性、成品质量及提炼成本，故对酸化pH要严格控制。目前工艺上控制在1.6～1.9范围内，若pH过高，则对释放单位不利，而且会促进差向土霉素的产生；若pH过低，则土霉素的稳定性差，影响成品质量，且草酸用量加大，将增加单耗和成本。
2.3.1.3发酵液的纯化
发酵液中同时存在着许多有机和无机的杂质，为了进一步提高滤液质量，为直接沉淀法创造有利条件，必须在发酵液的预处理过程中添加纯化剂。目前生产上是利用黄血盐和硫酸锌的协同作用来去除蛋白质，同时去除铁离子，并加入硼砂，以提高滤液质量。在不影响滤液质量的前提下,纯化剂的加入量应尽量减少，以降低成本。
2.3.2 过滤
过滤工艺采用板框过滤机过滤。滤布可以去除一些杂质。正批液经过板框过滤机后直接进入正批液储罐。为了提高过滤机中土霉素的利用率，采用三级过滤和顶洗的方法。顶洗的要求是高于4000单位的滤液才能够进入过滤机后进入正批液的储罐。低于的进入其它储罐以备下一次顶洗之用。
2.4 脱色结晶工艺流程
2.4.1 脱色
为了进一步去除滤液中的色素和有机杂质，以提高滤液质量，将滤液通入脱色罐，由其中的122-2树脂进行脱色。该树脂在酸性滤液中氢离子不活泼，不能发生电离及离子交换作用，但能生成氢键。其生成的氢键可吸附溶液中带正电的铁离子、色素及其它有机杂质，从而提高土霉素滤液的色泽和质量。树脂在氢氧化钠溶液中，由氢型变成钠型，失去氢键的活性，使其吸附的色素和杂质解离出来，再经酸作用可恢复其氢键的活性，重复使用。
其有关反应式如下：
2.4.2 结晶
土霉素发酵液经过上述预处理后，即可在酸性脱色液中用碱化剂调节pH至等电点，使土霉素直接从滤液中沉淀结晶出来。
2.4.2.1碱化剂的选择
碱化剂一般可采用氢氧化钠、氢氧化铵、及碳酸钠、亚硫酸钠等，各有其特点。例如，氢氧化钠价格便宜、用量少，但由于碱性较强，根据土霉素的稳定性，单独使用会造成局部过碱而破坏土霉素，影响产量和产品质量；又如亚硫酸钠具有抗氧化和脱色作用，可使产品色泽鲜艳，但其碱性极弱，调pH时反应缓慢，用量大，且价格较贵，影响成本；而氨水其碱性较氢氧化钠弱但比亚硫酸钠又强，价格便宜，用量适中等。故目前生产上多采用氨水(内含
2～3%NaHSO
3，Na
2
CO
3
及尿素等)作为碱化剂，这样既能节约成本，又能起到抗氧脱色作用，效
果较好。因为亚硫酸钠是弱酸强碱盐，能起部分碱化作用．但它主要是还原剂，在酸性溶液中能防止土霉素遇氧化物被破坏，起稳定剂的作用，同时还起脱色作用。
2.4.2.2 pH的控制与产量和质量关系
在连续结晶过程中，pH的高低对产品质量有一定影响。土霉素的等电点为pH4.6～4.8，在pH4.5～7.5之间，游离碱在水中的溶解度几乎不变。若pH控制在接近等电点时，虽然沉淀结晶较完全，收率也高，但会有大量杂质(主要是接近等电点pH的蛋白质)同时沉淀析出，影响产品的色泽和质量；若pH控制得较低一些，对提高产品质量虽有好处(即上述蛋白质等杂质不同时析出，而残留在母液中)，但沉淀结晶不完全，收率要低些，影响产量。因此，在选择沉淀结晶pH值时，就必须同时考虑到产、质量的效果。在正常情况下，工艺上控制pH 值在4.7左右。若沉淀结品质量发现较差时，pH值可控制得稍低些，有利于改善结晶质量，但不能低于4.5，否则收率低，影响产量。
2.4.2.3 影响晶体大小的其它条件
要使土霉素高产优质以及所得晶体均匀，好分离，便于过滤和洗涤等操作，除了严格控制pH条件外，对滤液质量、加碱化剂的速度，结晶的温度，搅拌转速和结晶时间等条件都须加以考察，选择最佳条件。
2.4.2.4 连续结晶法
连续结晶的原理是根据土霉素的结晶速度，结晶基本完成一般需要2h，2.5h后母液中土霉素含量下降幅度基本稳定。故可以结晶最大流量为基准，安排一套连续进行2.5h的结晶设备，使调好pH的结晶液在流动情况下有一段晶体成长的足够时间，即可达到结晶完全的目的。
2.5 离心干燥工艺流程
2.5.1 离心
利用多个三足式离心机联合的方式离心。
2.5.2 干燥
2.5.2.1离心工艺出来的湿成品仍含有较多水分，未达到成品要求，因此要经过摇摆机过40目的筛网，制成颗粒后进入三级旋风干燥器中，干燥后得到成品。
2.5.2.2湿成品干燥记录：干燥时间8h；风压0.04MP；投料温度185℃；卸料温度80℃。
3 土霉素生产的废水处理
3.1 废水处理原因
联邦制药（内蒙古）厂地位于国家重点保护流域——黄河流域的敏感地区。其生产废水浓度高、色度高，且水质不稳定，为使出水能够达标排放。该工程的废水处理系统是用来处理土霉素生产废水。土霉素生产过程中产生大量的高浓度有机废水(结晶母液)，水中有机物来自发酵的残存培养基和发酵代谢产物有碳水化合物、脂肪、蛋白质、纤维素、有机酸、色素、酶、放线酮、残余土霉素碱及其他代谢产物。其中残余土霉素碱、草酸等物质抑菌性较强，干扰蛋白质的合成从而抑制细菌生长，废水需作适当的预处理在降低杀菌性后再进入生化处理系统.
3.2该生产废水处理方案[4]
废水的治理难点在于：制药废水对废水处理过程中的生物菌种有很强的杀伤力，含有部分不可生化和对微生物有抑制作用的有机物，进水有机浓度、色度高，水质不稳定；同时受现场占地面积小的限制，导致改造难度增大。通过分析，确定了工程处理方案，决定采用“高压脉冲电凝系统物化处理一合絮凝技术(气浮)一组合兼氧一A／一加药沉淀一生物活性炭滤池”为主要处理单元的组合工艺路线。
3.2.1 高压脉冲电凝水处理技术进行预处理
高压脉冲电凝法(HVES)采用设计独特的高电压、小电流的电解技术，利用电化学原理，借助外加高电压作用产生电化学反应，把电能转化为化学能，经单电凝设备即可对制药废水中的有机或无机物进行氧化还原反应，进而凝聚浮除，将污染物从水体中分离，可有效去除废水中的SS、油、磷酸盐等各种有害污染物。采用高压脉冲电凝技术具有的特点是：①酸性条件下的有机废水可直接电解，出水pH接近中性，可大幅度降低加碱量，进而减少污泥量，降低运行费用；②集电解与气浮作用于一体，不需另外加药；③与传统的低电压、大电流的电解模式不同，极板消耗较少，更换方便，池内设搅动设施预防堵塞；④运行稳定，治理效果好，占地少，沉渣量少；⑤电凝设备的运行费用略高于生物法但比化学法低得多，且污泥量远低于化学法。但电凝设备的一次性投资稍大。
3.2.2 复合絮凝(气浮)技术降低抗生素残余效价
该废水中含有土霉素，具有一定毒性，抗生素残余效价会影响生物生化，在本工程中，采用复合混凝技术去除抗生素残余效价，即采用硫酸铝、聚硫酸亚铁、PAM及石灰对土霉素废水进行絮凝气浮预处理。其作用机理是絮凝剂中的Ca抖、AI计、Fe。+及其氢氧化物和有机聚合物PAM等，与抗生素分子的活性基团，如一NH。、一OH等，形成难溶复合体理后，会使废水中的微生物种类和数量增多，生长正常，废水性质趋于普通有机废水。同时，通过混凝气浮除渣后，为后续好氧生物降解减轻有机负荷。在本工程中，采用一体式自吸高效气浮系统实现固一液分离。该系统主要由一体式自吸高效溶气机、箱体、刮渣机、电控无堵塞释放器和排渣系统组成，它利用高效紊流容器装置，产生强烈负压，同时将空气和水吸人主机的溶混室内，在压力的作用下，形成优质溶气水，并由无堵塞释放器将溶气水直接释放到接触室内，再将絮凝后的污水引人分离室，在分离室内使溶气水与污水混合吸附，并把悬浮物浮至水面，固液分离后，由刮渣机把悬浮物刮人排渣槽，处理净化后的水经集水管排出。
3.2.3 组合兼氧技术进行水解酸化
采用推流式兼氧接触池，把反应控制在水解酸化阶段。内部悬挂组合填料，可根据水质水量情况，调整DO及回流值。兼氧阶段有中温菌和低温菌进行协调作用，故受外界气温和水温的影响小，且兼氧菌不同于专性厌氧菌种甲烷菌它是一种兼性菌种，在自然界中存在的量较多，容易培养，一旦废水中有机物发生变化，处理装置也能很快适应。这完全不同于厌氧处理中的甲烷菌，对于甲烷菌而言，由于它是单一性菌种，只要底物发生变化，甲烷菌就要衰亡。对于企业而言，其产品有可能不断更新转换，废水中的有机物成分亦会相应发生变化。兼氧菌种的易殖性及其强适应性，使兼氧工艺较厌氧工艺更能适应企业产品结。
3.2.4生物活性炭滤池进行深度处理
本工程出水要求达到GB8978一l996一级标给水排水准，若完全使用生化处理至达标，则投资成本很高，且占地面积很大。考虑到经济性和土地限制，采用生物活性炭滤池进行废水深度处理，利用活性炭的巨大比表面积，使微生物生长在活性炭表面去除生化工艺中未去除的微量污染物，确保CODcr％100 mg／L。
3.3 生产废水处理设备及参数[5]
表1 主要构筑物及设备参数
构筑物及设备名称构筑物及设备参数
综合调节池钢筋混凝土结构,8 m×16 m×2．9 m利用原有调节池改造,HRT 14 h
高压脉冲电凝机型号：HVES一2300,浮池钢结构2 mX4．2 mX4 m，新建
组合兼氧池钢筋混凝土结构,8．6 mX30 mX6．5 m，新建，HRT 60 h，DO 0．2～O．5 mg／L
中沉池钢筋混凝土结构，3．8 m×7．9 m×
6．5m，新建，表面负荷0．85m3／(rn2·d) 钢筋混凝土结构，l1．8 m×7．9 m×
A／0池6.5 m，新建，HRT 48 h，DO 2～4 mg／L，混合液回流比150
二沉池钢筋混凝土结构，3．8 mX7．6 mX5 m，新建，表面负荷0．85 m3／(m ·d)
终沉池钢筋混凝土结构， 8 mX4 m，新建，表面负荷0．41 m ／(m ·d)
生物活性炭滤池钢筋混凝土结构，3．1 m×15 m×4 m，新建，DO 3～5 mg／L
污泥浓缩池钢筋混凝土结构，3．1 mX3 mX2．5 m，利用原有低浓度废水集水池改造
板框压滤机型号：BS315，2台
4 讨论
根据对联邦制药土霉素生产工艺的分析，土霉素的生产工艺流程主要经过发酵、酸化过滤、脱色结晶、离心干燥四个阶段。其提取工艺为用草酸(或磷酸)做酸化剂调节pH值，是通用黄血盐-硫酸锌作净化剂协同去除蛋白质等高分子杂质，然后用122-2树脂脱色进一步净化土霉素滤液，最后调pH至4.8左右结晶得到土霉素碱产品。并了解了主要生产设备，并搜集了大量生产相关数据。