病毒载体pLVX-puro
PLVX-Puro载体信息如下：
pLVXpuro载体基本信息
出品公司: Clontech
载体名称: pLVX-Puro , pLVXpuro
质粒类型: 哺乳动物细胞慢病毒表达载体高拷贝/低拷贝: 高拷贝
启动子: CMV
克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶
载体大小: 8102 bp
5' 测序引物及序列: CMV-F：CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG
3' 测序引物及序列: --
载体标签: --
载体抗性: 氨苄
筛选标记: 嘌呤霉素
备注: 含有组成型CMV启动子的慢病毒载体产品目录号: 632164
稳定性: /
组成型: --
病毒/非病毒: 慢病毒
pLVXpuro载体质粒图谱和多克隆位点信息
pLVXpuro载体简介
Description
pLVX-Puro is an HIV-1-based, lentiviral expression vector. Lentiviral particles derived from the vector allow you to express your gene of interest in virtually any cell type, even primary cells. Expression of your gene is driven by the constitutively active human cytomegalovirus immediate early promoter (PCMV IE), located just upstream of the multiple cloning site (MCS), allowing constitutive, high level expression of your protein of interest.
pLVX-Puro contains all of the viral processing elements necessary for the production of replication-incompetent lentivirus, as well as elements to improve viral titer, transgene expression, and overall vector function. The woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element (WPRE) promotes RNA processing events and enhances nuclear export of viral and transgene RNA (1), leading to increased viral titers from packaging cells, and enhanced expression of your gene of interest in target cells. In addition, the vector includes a
Rev-response element (RRE), which further increases viral titers by enhancing the transport of unspliced viral RNA out of the nucleus (2). Finally, pLVX-Puro also contains a central polypurine tract (cPPT) element that increases nuclear importation of the viral genome during target cell infection, resulting in improved vector integration and more effi cient transduction (3). In addition to lentiviral elements, pLVX-Puro contains a puromycin resistance gene (Puror) under the control of the murine phosphoglycerate kinase (PGK) promoter (PPGK) for the selection of stable transductants. The vector also contains a pUC origin of replication and an E. coli ampicillin resistance gene (Ampr) for propagation and selection in bacteria.
Use
pLVX-Puro constitutively expresses your gene of interest from PCMV IE when transduced into target cells. Before the vector can be transduced into cells, however, it must be transfected into 293T packaging cells with our Lenti-X? HT Packaging System (Cat. Nos. 632160 and 632161). This packaging system allows you to safely produce high titer, infectious, replication-incompetent, VSV-G pseudotyped lentiviral particles that can infect a wide range of cell types, including non-dividing and primary cells (4).
pLVXpuro载体序列
LOCUS pLVX-Puro 8102 bp DNA circular SYN DEFINITION pLVX-Puro
ACCESSION
KEYWORDS
SOURCE
ORGANISM other sequences; artificial sequences; vectors. COMMENT This file is created by Vector NTI
https://www.360docs.net/doc/ae8583286.html,/
COMMENT VNTAUTHORNAME|https://www.360docs.net/doc/ae8583286.html,|
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..8102
/organism="pLVX-Puro"
/mol_type="other DNA"
misc_feature 454..634
/label="HIV-1_5_LTR"
misc_feature 454..634
/label="truncHIV-1_3_LTR"
misc_feature 745..789
/label="HIV-1_psi_pack"
CDS complement(1015..1476)
/label="ORF frame 3"
CDS 1181..2032
/label="ORF frame 2"
misc_feature 1303..1536
misc_feature 2031..2046
/label="cPPT"
promoter 2198..2702
/label="CMV_immearly_promoter" misc_feature 2205..2492
/label="CAG_enhancer"
misc_feature 2659..2679
/label="CMV_fwd_primer"
promoter 2660..2729
/label="CMV_promoter"
misc_feature 2703..2722
/label="pCEP_fwd_primer"
misc_feature 2705..2729
/label="LNCX_primer"
misc_feature complement(2925..2948)
/label="MSCV_rev_primer"
CDS 3170..4009
/label="ORF frame 2"
misc_feature 3322..3341
/label="mPGK_F_primer"
gene 3410..4009
/label="puro (variant)"
/gene="puro (variant)"
misc_feature 4025..4600
CDS 4113..4640
/label="ORF frame 3"
misc_feature 5271..5451
/label="HIV-1_5_LTR"
misc_feature 5271..5451
/label="truncHIV-1_3_LTR"
promoter complement(5576..5594)
/label="M13_reverse_primer" misc_feature complement(5593..5615)
/label="M13_pUC_rev_primer" promoter complement(5629..5658)
/label="lac_promoter"
gene complement(6741..7601)
/label="Ampicillin"
/gene="Ampicillin"
CDS complement(6741..7601)
/label="ORF frame 1"
promoter complement(7643..7671)
/label="AmpR_promoter"
terminator 7757..7888
/label="SV40_PA_terminator" misc_feature 7845..7864
/label="EBV_rev_primer" ORIGIN
1 tggaagggct aattcactcc caaagaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 61 cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac 121 tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agataaggta gaagaggcca 181 ataaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg 241 agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac gtggcccgag 301 agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gatatcgagc ttgctacaag ggactttccg 361 ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 421 cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 481 gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 541 tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 601 agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacttgaaag 661 cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg 721 caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga 781 aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg gagaattaga tcgcgatggg 841 aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa attaaaacat atagtatggg 901 caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct gttagaaaca tcagaaggct 961 gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac aggatcagaa gaacttagat 1021 cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca aaggatagag ataaaagaca 1081 ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa aagtaagacc accgcacagc 1141 aagcggccgg ccgctgatct tcagacctgg aggaggagat atgagggaca attggagaag 1201 tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc 1261 aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag agcagtggga ataggagctt tgttccttgg 1321 gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc 1381 cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc 1441 gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg caagaatcct
1501 ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa 1561 actcatttgc accactgctg tgccttggaa tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca 1621 gatttggaat cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa attaacaatt acacaagctt 1681 aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt 1741 ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta 1801 tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt 1861 actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc agacccacct 1921 cccaaccccg aggggacccg acaggcccga aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga 1981 cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg atctcgacgg tatcgccttt aaaagaaaag 2041 gggggattgg ggggtacagt gcaggggaaa gaatagtaga cataatagca acagacatac 2101 aaactaaaga attacaaaaa caaattacaa aaattcaaaa ttttcgggtt tattacaggg 2161 acagcagaga tccagtttat cgataagctt gggagttccg cgttacataa cttacggtaa 2221 atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 2281 ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 2341 aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg 2401 tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 2461 ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc 2521 agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca 2581 ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta 2641 acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa 2701 gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc 2761 tccatagaag acaccgactc tactagagga tcgctagcgc taccggactc agatctcgag 2821 ctcaagcttc gaattctgca gtcgacggta ccgcgggccc gggatcccgc gactctagat 2881 aattctaccg ggtaggggag gcgcttttcc caaggcagtc tggagcatgc gctttagcag 2941 ccccgctggg cacttggcgc tacacaagtg gcctctggcc tcgcacacat tccacatcca
3001 ccggtaggcg ccaaccggct ccgttctttg gtggcccctt cgcgccacct tctactcctc 3061 ccctagtcag gaagttcccc cccgccccgc agctcgcgtc gtgcaggacg tgacaaatgg 3121 aagtagcacg tctcactagt ctcgtgcaga tggacagcac cgctgagcaa tggaagcggg 3181 taggcctttg gggcagcggc caatagcagc tttgctcctt cgctttctgg gctcagaggc 3241 tgggaagggg tgggtccggg ggcgggctca ggggcgggct caggggcggg gcgggcgccc 3301 gaaggtcctc cggaggcccg gcattctgca cgcttcaaaa gcgcacgtct gccgcgctgt 3361 tctcctcttc ctcatctccg ggcctttcga cctgcagccc aagcttacca tgaccgagta 3421 caagcccacg gtgcgcctcg ccacccgcga cgacgtcccc agggccgtac gcaccctcgc 3481 cgccgcgttc gccgactacc ccgccacgcg ccacaccgtc gatccggacc gccacatcga 3541 gcgggtcacc gagctgcaag aactcttcct cacgcgcgtc gggctcgaca tcggcaaggt 3601 gtgggtcgcg gacgacggcg ccgcggtggc ggtctggacc acgccggaga gcgtcgaagc 3661 gggggcggtg ttcgccgaga tcggcccgcg catggccgag ttgagcggtt cccggctggc 3721 cgcgcagcaa cagatggaag gcctcctggc gccgcaccgg cccaaggagc ccgcgtggtt 3781 cctggccacc gtcggcgtct cgcccgacca ccagggcaag ggtctgggca gcgccgtcgt 3841 gctccccgga gtggaggcgg ccgagcgcgc cggggtgccc gccttcctgg agacctccgc 3901 gccccgcaac ctccccttct acgagcggct cggcttcacc gtcaccgccg acgtcgaggt 3961 gcccgaagga ccgcgcacct ggtgcatgac ccgcaagccc ggtgcctgac cgcgtctgga 4021 acaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt aactatgttg 4081 ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct attgcttccc 4141 gtatggcttt cattttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt tatgaggagt 4201 tgtggcccgt tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac gcaaccccca 4261 ctggttgggg cattgccacc acctgtcagc tcctttccgg gactttcgct ttccccctcc 4321 ctattgccac ggcggaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc 4381 tgttgggcac tgacaattcc gtggtgttgt cggggaagct gacgtccttt ccatggctgc 4441 tcgcctgtgt tgccacctgg attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc ccttcggccc
4501 tcaatccagc ggaccttcct tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct cttccgcgtc 4561 ttcgccttcg ccctcagacg agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg cctggaatta 4621 attctgcagt cgagacctag aaaaacatgg agcaatcaca agtagcaata cagcagctac 4681 caatgctgat tgtgcctggc tagaagcaca agaggaggag gaggtgggtt ttccagtcac 4741 acctcaggta cctttaagac caatgactta caaggcagct gtagatctta gccacttttt 4801 aaaagaaaag aggggactgg aagggctaat tcactcccaa cgaagacaag atatccttga 4861 tctgtggatc taccacacac aaggctactt ccctgattag cagaactaca caccagggcc 4921 aggggtcaga tatccactga cctttggatg gtgctacaag ctagtaccag ttgagccaga 4981 taaggtagaa gaggccaata aaggagagaa caccagcttg ttacaccctg tgagcctgca 5041 tgggatggat gacccggaga gagaagtgtt agagtggagg tttgacagcc gcctagcatt 5101 tcatcacgtg gcccgagagc tgcatccgga gtacttcaag aactgctgat atcgagcttg 5161 ctacaaggga ctttccgctg gggactttcc agggaggcgt ggcctgggcg ggactgggga 5221 gtggcgagcc ctcagatcct gcatataagc agctgctttt tgcctgtact gggtctctct 5281 ggttagacca gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccca ctgcttaagc 5341 ctcaataaag cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc ccgtctgttg tgtgactctg 5401 gtaactagag atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc agtagtagtt 5461 catgtcatct tattattcag tatttataac ttgcaaagaa atgaatatca gagagtgaga 5521 ggccttgaca ttgctagcgt tttaccgtcg acctctagct agagcttggc gtaatcatgg 5581 tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc 5641 ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg 5701 ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc 5761 ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact 5821 gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta 5881 atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag 5941 caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc
6001 cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta 6061 taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg 6121 ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc 6181 tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac 6241 gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac 6301 ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg 6361 aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga 6421 agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt 6481 agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag 6541 cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct 6601 gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg 6661 atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat 6721 gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc 6781 tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg 6841 gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct 6901 ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca 6961 actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg 7021 ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg 7081 tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc 7141 cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag 7201 ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg 7261 ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag 7321 tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat 7381 agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg 7441 atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca
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过表达慢病毒载体构建和包装手册 version1
过表达慢病毒载体构建和包装手册 Version1.0 吉凯基因 二零一一年五月
目录 简介 (3) 第一部分过表达慢病毒载体的制备 实验流程 (4) 实验材料 (5) 过表达克隆制备 (6) 第二部分慢病毒包装与滴度检测 实验流程 (17) 实验材料 (18) L e n t i v i r u s病毒包装 (21) 病毒的收获及浓缩 (22) L e n t i v i r u s滴度测定 (24) 参考文献 (33)
简介 慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内较长期的表达且安全性高。吉凯基因提供的慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，吉凯基因建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒，除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。 吉凯基因慢病毒载体系统由GV慢病毒载体系列、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体三质粒组成。GV慢载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件，例如WRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。通常根据不同的实验目的针对GV载体改造以进行基因功能研究。pHelper 1.0载体中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper 2.0载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。 吉凯基因过表达慢病毒产品可通过对GV慢病毒载体的改造和病毒包装，获得带有特定基因序列的慢病毒颗粒，以满足不同的实验需求。 本手册为吉凯基因RNAi慢病毒载体的构建和病毒包装的通用操作流程，目的是为了方便大家交流使用，部分细节内容未能做到一一详述，敬请谅解。同时希望大家能够针对手册中的错误和问题，提出宝贵的意见。
转思路迪博客：慢病毒载体发展
转思路迪博客：慢病毒载体发展 和“简单型”逆转录病毒载体的设计类似，对慢病毒载体的改造也是基于将其病毒基因组分成三个载体分别表达 包膜蛋白，病毒包装蛋白和外源表达载体。当使用慢病毒载体用于临床基因治疗时，有些系统甚至使用4或者5质粒系统以降低产生复制性病毒(RCR, replicative-competent retrovirus)的可能性从而增加体内使用的安全性。与“简单型”逆转录病毒不同的是，慢病毒由于存在辅助蛋白和调控蛋白，其载体改造涉及更多的对这些反式作用因子的去除以及相应的顺式作用元件的改造。第一代慢病毒载体使用三质粒系统，将包膜蛋白单独置于一个质粒中表达，包装载体含有除包膜蛋白编码基因的全病毒基因组，使用CMV启动基因表达，并用人胰岛素基因的polyA替代3’LTR作为加尾信号，同时将外源插入片段以及所有相关顺式作用元件(包装信号y，LTRs，RRE和引发结合位点(PBS, primer binding site))置于外源表达载体中。第二代慢病毒载体去除了辅助蛋白编码基因Vif，Vpr，Vpu和Nef，以减少产生RCR的风险。第三代慢病毒载体则去除了对Tat和Rev蛋白因子的依赖作用。通过将5’LTR中的U3区替换成CMV，可以消除对Tat的依赖；通过对gag-pol编码基因的密码子进行优化，可以解除对Rev的依赖。许多顺式作用元件(DNA序列)对病毒的包
装效率影响也很大，比如cPPT和来源于Igk的MAR (matrix attachment region)，以及WPRE(土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件)，其可以有效帮助mRNA的polyA加尾效率。同时通过失活3’LTR区的U3区，可以减少病毒载体整合后对宿主整合位点附近基因的表达干扰，而且还可以有助于引入诱导表达或者组织特异性表达系统。包膜蛋白表达载体：慢病毒载体改造中一个重大突破是将慢病毒自身的包膜蛋白 替换成其它病毒的包膜蛋白，尤其是VSV-G。VSV-G包膜蛋白赋予慢病毒载体三个非常重要的特性：1)，稳定慢病毒载体颗粒，使得其可以承受超离心的剪切力，因此可以进行浓缩，从而可以获得超高滴度(1011IU/ml)以用于体内实验(动物实验和基因治疗)；2)，其受体为细胞膜上的磷脂酰丝氨酸分子，因此极大拓展慢病毒载体的侵染谱系；3)，介导慢病毒载体进入胞吞途径，从而使得整个侵染整合过程减少了对慢病毒自身辅助蛋白的依赖。当然，VSV-G蛋白也有一些缺点：1)，用于动物体内实验时，有报道出现针对VSV-G蛋白的补体和抗体介导的免疫反应从而阻碍慢病毒载体的功能 发挥；2)，体内少数组织，比如气管上皮细胞的顶端面缺乏VSV-G受体，因此携有VSV-G的慢病毒载体在体内对其侵染性极低。通过使用埃博拉病毒的包膜蛋白可以解决这个问题，从而使得囊性纤维化疾病的基因治疗(其主要靶底是气管组织)成为可能。因此，显然为了进一步拓展慢病毒载体的侵
慢病毒载体及其应用的研究进展_毛颖佳
中国图书分类号Q782R392.11文献标识码A文章编号1004-5503（2009）02-0196-05【综述】 慢病毒载体及其应用的研究进展 毛颖佳综述郑源强石艳春审校 【摘要】与其他载体相比，慢病毒载体具有携带基因片段容量大、转染效率高、可感染分裂细胞及非分裂细胞、目的基因可在宿主细胞中长时间稳定表达以及安全性好等诸多优点，现已成为转移目的基因的理想载体。本文主要就慢病毒载体及其在基因治疗、生物医药与科学研究等领域的研究进展作一综述。 【关键词】慢病毒载体；基因治疗 Progress in Study on Lentiviral Vectors and Their Application MAO Ying-jia,ZHENG Yuan-qiang,SHI Yan-chun（Research Center of Molecular Biology,Inner Mongolia Medi－cal College,Huhehot010059,China） 【Abstract】Nowadays lentiviral vectors（LVs）is the only desire ideal genetic vector system which affords both efficient and sta－ble gene delivery.In contrast to other vectors,LVs can persist in dividing and non-dividing cells.Their virtues also include large ca－pacity of interested gene fragment and satisfied safety.The development of LVs and their application in gene therapy,biological prod－ucts and scientific research are reviewed in this paper. 【Key words】Lentiviral vector;Gene therapy 慢病毒（Lentivirus）属逆转录病毒科（Retrovidae），为RNA病毒。慢病毒载体（Lentiviral vector／len-tivector，LV）来源于包括人类免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒、猴免疫缺陷病毒、马传染性贫血病毒在内的许多物种，由于与其他载体相比有诸多优势，现已成为理想的基因转移载体，广泛应用于基因治疗、疫苗生产以及科学研究等领域。 1.慢病毒载体的发展 1.1病毒载体概述：载体是供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达或复制的运载工具。目前所用的载体按来源，可分为病毒载体和非病毒载体。与非病毒载体相比，病毒载体具有转染效率高、可在体内稳定表达等优点。目前，最常用的病毒载体是经过人工改建、携带有正常人类DNA的病毒。它充分利用了病毒高度进化所具有的靶细胞定向感染性、宿主细胞寄生性以及高转导效率的特点，因而成为基因治疗研究和临床应用的主要工具。但目前常用的病毒载体如逆转录病毒载体，由于可因随机整合引起插入突变、病毒颗粒可经免疫反应而迅速降解、经其携带进入宿主基因组的外源基因容易发生基因沉默等原因，限制了其应用；而腺相关病毒由于感染效率低，目的基因瞬时表达以及单链基因组在整合之前需要形成双链DNA而限制了其应用。因此，很多学者把目光投向了以Ⅰ型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）为代表的慢病毒载体的研究［1］。 1.2慢病毒载体：慢病毒属逆转录病毒科，为二倍体RNA病毒。早期的慢病毒载体主要来源于HIV-1［2］，之后出现了以猫免疫缺陷病毒（Feline imm-unodeficiency virus，FIV）为代表的非灵长类慢病毒载体系统［3］。随着生物技术的发展，慢病毒载体系统得到了极大的发展，相继发现了各种有蹄类动物的慢病毒，包括马传染性贫血病毒（Equine infectious anemiavirus，EIAV）［4］、山羊类关节炎-脑炎病毒（Caprine arthritis-encephalitis virus，CAEV）［5］、牛免疫缺陷病毒（Bovineimmunodeficiency virus，BIV）［6］和绵羊髓鞘脱落病毒（Visna virus）［7］等。非灵长类慢病毒载体在人类基因治疗中的相关生物安全性问题尚需进一步研究和证实，例如亲代病毒能否在人体完成复制或引起人类疾病。而随着人们对HIV-1更加深入的了解，现已有20多种抗逆转录病毒药物可以用于抑制HIV-1来源的具复制活性的逆转录病毒（Re-plication competent retrovirus，RCR）［8］。因此，目前最令人关注的是以HIV-1为基础构建的慢病毒载体。 慢病毒载体是以慢病毒基因组为基础，除去其复制所需的基因，以治疗性基因和选择性标记物构建而成，转移基因片段容量大，无毒性且不易诱发宿主免疫反应，安全性较好，不仅能感染分裂细胞，且能 基金项目：教育部"春晖计划"（Z2007-1-01004）；内蒙古医学院重大项目（NY2006ZD005）. 作者单位：内蒙古医学院分子生物学研究中心（呼和浩特010059）. 通讯作者：石艳春，E-mail：ycshi5388@https://www.360docs.net/doc/ae8583286.html,
人HIF1α基因重组逆转录病毒载体构建及鉴定
文章编号:100025404(2004)1821639204 论著 人HIF1α基因重组逆转录病毒载体构建及鉴定 段小军1,杨 柳1,董世武2,周 跃3,唐康来1,胡 鸢1 (第三军医大学:1西南医院骨科,2基础医学部解剖学教研室,重庆市生物力学实验室,重庆400038,3新桥医院骨科,重庆400037) 提 要:目的 构建人缺氧诱导因子21α(HIF21α)基因重组逆转录病毒载体,并观察其对NIH3T3细胞感染效率。方法 采用基因工程技术,经过2次亚克隆将HIF21α基因片段克隆至含IRES2EG FP逆转录病毒载体上,鉴定后用脂质体法转染PT67细胞进行包装、扩增,最后用重组逆转录病毒感染NIH3T3细胞。其中采用PCR方法对重组载体进行鉴定,利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检测。结果 酶切鉴定及PCR结果与HIF21α基因重组逆转录病毒载体的预期结果一致,病毒滴度达(114×106pfu/ml),并对NIH3T3细胞有强感染能力。结论 应用基因工程技术,成功构建了含人HIF21α基因重组逆转录病毒载体,为应用于治疗性血管生成创造了条件。 关键词:逆转录病毒;缺氧诱导因子21;基因克隆 中图法分类号:R782;R394233;R394.3 文献标识码:A Construction and identification of human hypoxia2inducible factor21αgene recombinant retrovirus DUAN X iao2jun1,Y ANGLiu1,DONG Shi2wu2,ZH OU Y ue3,T ANG K ang2lai1,H U Y uan1(1Department of Joint Surgery,S outh2 west H ospital,2Department of Anatomy,C ollege of Medicine,3Department of Orthopedics,X inqiao H ospital,Third Military Medical University, Chongqing400038,China) Abstract:Objective T o construct the recombinant retrovirus of human hypoxia2inducible factor21α(HIF21α) gene and to observe its ability to in fect NIH3T3fibroblasts.Methods The full2length human HIF21αcDNA was cloned into the retroviral vector containing internal ribos omal entry site(IRES)and enhanced green fluorescent pro2 tein(EG FP)by the method of gene engineering.Then the retroviral vector with HIF21αwas trans fected into PT67 cells using the lipofectine DOT AP and NIH3T3cells was in fected by the recombinant retrovirus.The target gene was detected by polymerase chain reaction(PCR).The titer and its in fection rate were determined using the EG FP ex2 pression with a fluorescent microscope.Re sults Restriction endonuclease and PCR analyses con firmed that the hu2 man HIF21αcDNA was success fully inserted into the retroviral vector.The titer of recombinant retrovirus with HIF21αgene was114×106pfu/ml and the retrovirus had a strong effect on NIH3T3cells.Conclusion The recombinant retrovirus containing HIF21αgene has been success fully constructed by the method of gene engineering,which lays a foundation for the application in therapeutic angiogenesis. K ey w ords:retrovirus;hypoxia2inducible factor21;gene clone 缺氧诱导因子21(hypoxia2inducible factor21,HIF21)是近年来发现的一种核转录因子,对缺氧状态下的血管生成(Angiogenesis)起核心调控作用,同时还具有调节细胞能量代谢,增强机体氧供给等作用1。HIF21是由α亚基和β亚基组成的异二聚体,属于bH LH2PAS 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30270375) Supported by the National Natural Science F oundation of China(30270375) 作者简介:段小军(1972-),男,四川省渠县人,博士研究生,主治医师,主要从事组织工程学、血管生成方面的研究,发表论文11篇。电话: (023)68754000273007,E2mail:dxj9@https://www.360docs.net/doc/ae8583286.html, 通信作者:杨 柳,电话:(023)68765280,E2mail:jointsurgery@https://www.360docs.net/doc/ae8583286.html, 收稿日期:2004201215;修回日期:2004206221家族成员,其中β亚基在细胞内稳定表达,α亚基在功能调控方面起主要作用2。为此,本实验采用基因工程技术,体外构建表达人HIF21α基因重组逆转录病毒载体,旨在为进一步应用HIF21促进血管生成的研究创造条件。 1 材料和方法 111 质粒和菌株 含人HIF21α质粒(215kb)pBSK hHIF1αT7由瑞士苏伊士大学G assmann教授惠赠。逆转录病毒载体pLEG FP2N1、pIRES22 EG FP购自Clontech公司。大肠杆菌DH5α菌株、病毒包装细胞PT67由创伤、烧伤与复合伤全军复合伤研究所国家重点实验室 9361 第26卷第18期2004年9月 第 三 军 医 大 学 学 报 ACT A AC ADE MI AE ME DICI NAE MI LIT ARIS TERTI AE V ol.26,N o.18 Sep.2004
腺病毒载体的构建-体外连接法快速高效构建表达
体外连接法快速高效构建表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒载体 作者：王家宁, 王传成郭凌郧, 黄永章 [摘要] 目的: 采用体外连接法构建和制备重组腺病毒Adeno-X-LacZ，为构建具有治疗价值的重组腺病毒载体奠定基础。方法: PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切pShuttle2-LacZ穿梭质粒，回收4.6 kb 的LacZ基因表达盒，与经过相同酶切的Adeno-X病毒DNA连接，连接产物用SwaⅠ酶切，最终产物转化DH5α。重组质粒用PCR法和PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切鉴定。pAdeno-X-LacZ用PacⅠ线性化后，用脂质体介导其转染至AD293细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒，采用CsCl 密度梯度离心法纯化重组腺病毒Adeno-X-LacZ。采用X-gal染色观察Adeno-X-LacZ在AD293细胞内包装和HVSMC表达情况。结果: PCR扩增可见312 bp特异性条带，PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切重组质粒后释放出4.6 kb LacZ基因表达盒。X-gal染色证实了在AD293细胞内成功扩增包装出重组腺病毒Adeno-X-LacZ和LacZ基因在HVSMC中得到有效表达。结论: 体外连接法是一种快速、简便、高效的构建重组腺病毒质粒的方法，本研究为构建具有治疗价值的重组腺病毒奠定了基础，Adeno-X-LacZ为研究腺病毒介导的基因转移提供了一良好的对照载体。 [关键词] 体外连接;腺病毒;β－半乳糖苷酶;PI-SceⅠ;I-CeuⅠ Abstract: Objective To construct recombinant adenoviral v ector expressing β-galactosidase by in vitro ligation and provide a basis for construction of recombinant adenovirus vector expressing therapeutic gene of interest.Methods pShuttle2-LacZ was digested with PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰand 4.6 Kb fragment of LacZ gene expression cassette was recovered .This fragment was ligated to predigested Adeno-X viral DNA with PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ. The ligated product was digested with Swa Ⅰ.The resultant DNA was transformed into E. Coli. DH5α.The correct recombinant plasmid, pAdeno-X-LacZ ,was identified by PCR and PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰdigestion. The Pac I-digested, linearized pAdeno-X-LacZ was transfected into AD293 cells by Lipofectamine. Recombinant adenovirus , Adeno-X-LacZ, was purified with CsCl density gradient ultracentrifugation. HVSMC was infected with Adeno-X-LacZ. X-gal staining was performed to monitor the expression of β-galactosidase gene. Results There was a specific band of 312bp when pAdeno-X-LacZ was amplified by PCR. PI-SceⅠ/I-CeuⅠdigestion of pAdeno-X-LacZ released 4.6Kb of LacZ gene fragment. X-gal staining confirmed Adeno-X-LacZ was packaged successfully within AD293 cells and the expression of β-galactosidase gene in HVSMC. Conclusion In vitro ligation is a simple, rapid and efficient method for constructing recombinant adenoviral vector. This study provides a basis for construction of recombinant adenoviral vector carrying therapeutic gene of interest, Adeno-X-LacZ is also a useful control vector for the research of gene transfer mediated by recombinant adenovirus. K ey words: In vitro ligation; Adenovirus; β-galactosidase; PI-Sce Ⅰ; I-Ceu Ⅰ
病毒载体概述
病毒载体概述 引言 基因导入系统(gene delivery system)就是基因治疗的核心技术,可分为病毒载体系统与非病毒载体系统。本章主要论述用于人类基因治疗的病毒载体系统。 用于基因治疗的病毒载体应具备以下基本条件: 1、携带外源基因并能包装成病毒颗粒; 2、介导外源基因的转移与表达; 3、对机体不致病。 然而,大多数野生型病毒对机体都具有致病性。因此需要对其进行改造后才能用于人体。原则上,各种类型的病毒都能被改造成病毒载体。但就是由于病毒的多样性及与机体复杂的依存关系,人们至今对许多病毒的生活周期、分子生物学、与疾病发生及发展的关系等的认识还很不全面,从而限制了许多病毒发展成为具有实用性的载体。近20年来,只有少数几种病毒如反转录病毒(包括HIV病毒)、腺病毒、腺病毒伴随病毒、疱疹病毒(包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)、甲病毒等被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度的应用。 第一节病毒载体产生的原理 病毒载体的产生建立在对病毒的生活周期与分子生物学认识的基础之上。研究病毒载体首先要对病毒的基因组结构与功能有充分的了解,最好能获得病毒基因组全序列信息。病毒基因组可分为编码区与非编码区。编码区基因产生病毒的结构蛋白与非结构蛋白;根据其对病毒感染性复制的影响,又可分为必需基因与非必需基因。非编码区中含有病毒进行复制与包装等功能所必需的顺式作用元件。 各种野生型病毒颗粒都具有一定的包装容量,即对所包装的病毒基因组的长度有一定的限制。一般来说,病毒包装容量不超过自身基因组大小的105～110％。
基因重组技术的发展使病毒载体的产生成为可能。最简单的做法就是,将适当长度的外源DNA插入病毒基因组的非必需区,包装成重组病毒颗粒。比如,本实验室曾将4、5kb的lacZ基因表达盒 (CMV-lacZ-polyA)插入HSV1病毒的UL44(糖蛋白C)基因的XbaI位点中,病毒基因组的其余部分不改变,构建成重组病毒HSV1-lacZ100(吴小兵等,1998)。由于UL44基因产物对于HSV病毒在培养细胞中产毒性感染就是非必需的,因此,该重组病毒可以在细胞中增殖传代。用这种重组病毒感染细胞,能将lacZ基因带入细胞并高效表达。用同样的方法,将AAV-2病毒的rep与cap基因片段(4、3kb)插入HSV1病毒的UL2(编码尿嘧啶DNA糖基化酶)或UL44(编码糖蛋白C)基因中,构建成具有提供重组AAV载体复制与包装所需的全部辅助功能的辅助病毒rHSV-rc(伍志坚等,1999)。 然而,这样的重组病毒作为基因转移载体有许多缺点。首先,许多野生型病毒通过在细胞中产毒性复制而导致细胞裂解死亡;或带有病毒癌基因而使细胞发生转化。因此必须经过改造使其成为复制缺陷性病毒并且删除致癌基因后才能用于基因治疗。其次,插入外源DNA的长度受到很大限制,尤其对于基因组本身较小的病毒如腺病毒伴随病毒(AAV,4、7kb)、反转录病毒(8～10kb)、腺病毒(36kb),如果不去除病毒基因,可供外源DNA插入的容量就十分小。因此,必须删除更多的病毒基因以腾出位置插入较大的外源DNA。为了增加病毒载体插入外源DNA的容量,除了可以删除病毒的非必需基因外,还可以进一步删去部分或全部必需基因,这些必需基因的功能由辅助病毒或包装细胞系反式提供。 病毒载体大体上可分为两种类型: 重组型病毒载体:这类载体就是以完整的病毒基因组为改造对象。一般的步骤就是选择性地删除病毒的某些必需基因尤其就是立早基因或早期基因,或控制其表达;缺失的必需基因的功能由互补细胞反式提供;用外源基因表达单位替代病毒非必需基因区;病毒复制与包装所需的顺式作用元件不变。这类载体一般通过同源重组方法将外源基因表达单位插入病毒基因组中。如在传统的重组腺病毒构建方法中,将外源基因表达盒(exogenous gene expression cassette)插入穿梭质粒(如pXCX2或pFGdX1)的腺病毒同源序列中,与辅助
重组逆转录病毒载体的包装及病毒滴度影响因素
筮四至医太堂堂亟（！里！竺些丛！！塑鲤旦里ｉ！！兰塑！；堑（！兰２丛Ｐ；』４１坚里生：鱼竺旦：！塑：塑 ?研究简报?文章编号：１０００＿２７９０（２００５）１４一封２旬１ 重组逆转录病毒载体的包装及病毒滴度影响因素 杨生玺１，蒋虹２（青海大学：１医学院生物教研室，２附属医院高压氧科，青海西宁８１０００１） 【摘要】目的：探讨产生重组逆转录病毒包装及其病毒滴度（以ｃｆｕ表示）的影响因素．方法：用逆转录病毒载体ｐＭＮｓ—ＴＫ—Ｍ，以脂质体法转染包装细胞ＰＡ３１７细胞，挑选抗性集落（ＰＡ３１７／ｐＭＮＳ—ＴＫ—Ｍ）扩大培养后，进行ＰＡ３１７／ｐＭＮＳ—ＴＫ．Ｍ细胞接种密度、培养温度（３７℃，３２℃）、纯化方法等对其培养上清中重组病毒ｃｆｕ影响的比较性研究．结果：包装细胞的密度是影响ｃｆｕ的关键因素；降低培养温度需延长培养时间方可提高ｃｆｕ滴度．结论：该实验结果为应用逆转录病毒载体进行的基因治疗实验研究提供重要的参考依据． 【关键词】逆转录病毒载体；包装细胞；病毒滴度 【中图号】Ｒ３９４【文献标识码】ＢＧ４１８的ＤＭＥＭ培养液继续培养３ｄ，然后更换含８００ｍ∥Ｌ的Ｇ４１８的培养液，培养约１４ｄ，细胞克隆基本形成．分别以０．５，０．７，０．９，１．２及１．５×１０６不同细胞密度接种产病毒包装细胞，于相同温度及相同培养时间条件下制备含重组逆转录的包装细胞上清，并于相同的条件下测定它们的ｃｆｕ滴度．取最高ｃｆｕ的包装细胞系集落，以相同的密度接种细胞，分别在３７℃及３２℃的条件下培养细胞，并于２４ｈ及４８ｈ分别收集细胞上清测定病毒ｃｆｕ滴度． ２结果采用脂质体法，将逆转录病毒载体ＧＩＮａＴＫ导入ＰＡ３１７细胞，命名为ＰＡ３１７／ＴＫ．根据ＨｓＶ．ＴＫ基因设计的引物ＰｃＲ扩增产物大小为４０４ｂｐ．经ＰｃＲ扩增，载体ＧＩＮａＴＫ和抗性细胞ＰＡ３１７／ＴＫ细胞均出现阳性条带，而ＰＡ３１７细胞未出现相应条带（图１）．分别以０．５，Ｏ．７，Ｏ．９，１．２及１．５×１０６不同细胞密度接种产病毒包装细胞，２４ｈ收集上清测定ｃｆｕ，结果随细胞密度上升而上升．在ＰＡ３１７／ＴＫ包装细胞密度相同条件下降低温度需延长培养时间，我们在３２ｃｃ条件下培养４８ｈ获得了４．０×１０７ｃｆ∥Ｌ的病毒滴度． ０引言在目前众多的基因治疗临床试验方案中，逆转录病 毒载体仍是被广泛应用的载体之一．作为目的基因转运过程 中的逆转录病毒载体和包装细胞，其本身的分子生物学特性４０４ｂｐ已被广泛研究，但对于包装后这些含目的基因的重组逆转录 病毒的生物、物理学特性的研究却较少．为此，我们对产生重 组逆转录病毒的包装细胞系的建立过程及其上清中重组逆转 录病毒集落形成单位（ｃｏｌｏｎｙｆｏｍｉｎｇｕｎｉｔ，ｃｆｕ）影响因素进行 了比较性研究． １材料和方法 １．１材料含有单纯疱疹病毒胸苷激酶基因的小鼠白血病源性逆转录病毒表达载体ｐＭＮＳ—ＴＫ，ＰＡ３１７包装细胞及小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３ｒ１３培养于含胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液中．ＤＭＥＭ，ＲＰＭｌｌ６４０培养基等均为Ｇｉｂｃｏ公司产品，胎牛血清为四季青公司产品．逆转录病毒载体、细胞株ＰＡ３１７，ＮＩＨ３１ｒ３由东南大学医学院遗传中心惠赠． １．２方法按常规方法扩增、抽提、纯化质粒ＤＮＡ片段、回收ＨｓＶ—ＴＫ片段．在Ｔ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ的作用下，定向克隆入逆转录病毒载体ｐＭＮｓＭ中ｓｖ４０启动子下游的多克隆位点．重组质粒转化ＪＭｌ０９菌后经克隆筛选、鉴定获重组质粒ｐＭＮＳ—ＴＫ．Ｍ．以脂质体法将上述重组质粒ＤＮＡ转染至逆病毒包装细胞ＰＡ３１７．以含４００ｍ∥ＬＧ４１８的ＤＭＥＭ选择培养基选择培养１４ｄ，获Ｇ４１８抗性克隆ＰＡ３１７／ＴＫ细胞ＮＩＨ３ｒ１３细胞为靶细胞在Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ存在条件下测定、计算病毒滴度．病毒滴度（ｃｆｈ／Ｌ）＝细胞克隆平均数×病毒液稀释倍数×１０３．将收集到的病毒上清液分别作１０～，１０～，１０，１０。倍稀释．分别吸取１．５ｍＬ稀释的病毒液（８ｍｇ／Ｌ聚凝胺）加入ＮＩＨ３耶细胞培养瓶内，使病毒吸附２．５ｈ后，补加等量含３００ｍｇ／Ｌ 收稿日期：２００５旬２旬７；修回日期：２００５＿０３一ｌｌ 基金项目：国家自然科学基金（３００７０２２９） 通讯作者：杨生玺（１９６３一），男（汉族），青海省西宁市人．学士，副教授，青海大学医学院生物教研室副主任．Ｔｅｌ．（０９７１）６１４３６３１Ｅｍａｉｌ．ｙａｎ百ｉａｎ９６３＠１２６．ｃｏｍ ｌ：ＧＩＮ仅ＴＫ；２：ＰＡ３１７／ＴＫ；３：Ｍａｒｋｅｒ． 图１载体ＧＩＮａＴＫ和抗性细胞ＰＡ３１７／ＴＫ细胞出现的阳性条带 ３讨论将外源基因转入靶细胞是基因治疗的基础和关键步骤，其效率的高低将直接影响整个基因治疗的效果甚至成败，而包装后逆转录病毒滴度的高低是重要参数之一．结果提示在建立稳定产生重组腻转录病毒的包装细胞时，抗性集落数量的挑选应尽可能多一些并需传代培养观察病毒滴度的变化．制备含重组逆转录病毒的包装细胞上清时，细胞密度及培养温度是影响病毒滴度的重要因素，细胞密度与细胞生长状态有关，过低或过高的细胞密度对细胞生长均不利，均不能使病毒滴度达到最佳化．用聚凝胺处理细胞，可提高对逆转录病毒的敏感性’１Ｊ．张惠中等心。报道在细胞培养皿中接种１．２×１０６个包装细胞可获最佳的效果．采用降低培养温度的方法，在工业化培养罐中可以提高细胞病毒滴度．把病毒上清液进行超速离心，透析纯化，浓缩处理，有可能将病毒滴度提高到较高水平，从而满足今后以逆转录病毒载体进行的临床基因治疗的需要． 【参考文献】 ［１］陈道桢，张丽珊，鲁晓萱，等．胸苷激酶基因对乳腺癌细胞的杀伤性研究［Ｊ］．实用癌症杂志，２００３；１８（２）：１２２—１２５． ［２］张惠中，范清宇，杨安钢．产生重组逆转录病毒包装细胞系建立及病毒滴度影响因素［Ｊ］．第四军医大学学报，２００ｌ皿（４）：３１３—３１５． 编辑潘伯荣 万方数据
慢病毒系统简介及应用
慢病毒包装系统简介及应用 一、慢病毒包装简介及其用途 慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体，然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3' 端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。在siRNA表达载体中，构成siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4个U 3 '突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体。 慢病毒载体（Lentiviral vector）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 二、这一系统的目的，主要是为了解决以下问题： 1. 对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi，cDNA克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。 2. 进行稳转细胞株的筛选；
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版 腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章 AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术 7 第五章常用技术 8 5.1 QBI-293A细胞培养 8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖 8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存 8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生 9 5.2.1 感染QBI-293A细胞 9 5.2.2 病毒空斑形成 9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 9 5.3 MOI测定 10 5.4 腺病毒感染力测定 10
5.4.1 X-Gal染色 11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化 11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交 13 5.5.4 Southern杂交和点杂交 13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定 14 5.5.7 功能测定 14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 16 5.7.1 不连续密度梯度离心 17 5.7.2 连续密度梯度离心 17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集 17 5.8 病毒滴度测定 18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法 20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法 20 第六章疑难解答 22 6.1 QBI-293A细胞培养 22 6.2 感染力测定 22 6.3 转移载体克隆 23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞 25 6.6 筛选和测定 25 6.7 在QBI-293A细胞中表达 26 6.8 重组腺病毒的扩增 26 6.9 纯化 26 6.10 病毒滴度测定 27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒 Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒 AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素 β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶 bp Base Pair 碱基对
专题八作业：基因治疗中病毒载体的研究进展
专题八作业：基因治疗中病毒载体的研究进展？ 基因治疗自1990年成功应用于重症联合免疫缺陷综合征(SCID-X1)患者的治疗，已走过了十几个年头，给人类一些疑难杂症如肿瘤的治愈带来了曙光。但其发展却屡遭挫折，比如近来发现经基因治疗的SCID-X1患者之一出现了类白血病反应，可能是基因随机整合染色体所致，使得人们不得不以怀疑的目光审视它的成长。而基因载体是阻碍其发展的主要因素，主要表现为安全性、靶向性、转染效率不高及表达时问短等问题。病毒载体是目前临床基因治疗中应用最多的载体，各种病毒载体有自身的利弊，除了对它们的选择外，病毒载体只有通过自身的不断改造完善，才能更好的服务于基因治疗，进而真正造福于人类。 1 逆转录病毒(retrovirus vectors，RVJ载体 逆转录病毒载体基因转移系统包括两部分：一部分是用外源基因替换病毒结构基因的逆转录病毒载体；另一部分是包装细胞的基因组DNA中整合了逆转录病毒结构基因。1990年世界上首例临床基因治疗采用的就是逆转录病毒载体n]。到目前为止，RV载体是基因治疗临床试验使用最多的载体，较常用的是基于moloney鼠白血病病毒(MMLV)改造而来的各种Rv载体。RV载体具有基因表达持久而稳定、转染效率较高等优点，但只能感染分裂期细胞，载体容量<8kb，与宿主细胞基因组的随机整合可引起基因突变及产生可复制的野生型病毒等危险，故需要进一步的改造完善。将水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)整合于逆转录病毒包膜中能加速各种宿主细胞对其进行膜融合和内吞，具有广泛的宿主范围和更高的转染效率，可高效的转染静止细胞，并能抵抗血清补体灭活的作用。诸多的优点使该载体在造血系统疾病和肿瘤的基因治疗方面有潜在的应用前景。为了提高逆转录病毒感染靶细胞的特异性，降低其潜在的危险性，可以在原来的病毒Env蛋白上接上一段具有特异靶向的多肽，目前应用较多的是单链可变区抗体(acFV)；还可通过插入组织特异启动子实现靶向表达。第三代包装细胞系aF-crip和m 使载体与包装细胞问至少需要发生4次同源重组才可能产生有复制能力的逆转录病毒，提高了RV载体的安全性。 2 腺病毒(adenovirus，AV)载体 腺病毒载体自1993年首次被应用于临床试验以来，迄今为止大约有40％基因治疗临床试验方案采用腺病毒为载体，仅次于RV载体_3 J。至今AV载体已经发展了4代，第2、3代腺病毒去除EI、E2和E4编码序列，与第一代相比，有更低的免疫原性和更大的载体容量。第四代腺病毒仅含有反向末端重复序列
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腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介1 第二章应用重组腺病毒的优点2 第三章AdEasyTM技术3 3.1技术概况3 3.2AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3 第四章主要流程4 4.1将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 缩写英文全称中文全称 AdAdenovirus腺病毒 Ad5Adenovirusserotype5血清5型腺病毒AdVAdenoviralVector腺病毒载体 AmpAmpicillin氨苄青霉素 β-Galβ-Galactosidaseβ-半乳糖苷酶 bpBasePair碱基对 BSABovineSerumAlbumin小牛血清白蛋白cDNAComplementaryDNA互补DNA cccDNAClosedCircularCoiledDNA闭环螺旋DNA CPECytopathicEffect细胞病理效应CsClCesiumChloride氯化铯 DMEMDulbecco’sModifiedEagleMediumDMEM培养基DMSODimethylSulfoxide二甲基亚砜DTTDithiothreitol二硫苏糖醇EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸EtBrEthidiumBromide溴化乙锭FBSFetalBovineSerum胎牛血清 HrHour小时 ITRInvertedTerminalRepeat反向末端重复KanKanamycin卡那霉素 kbKilobases千碱基对 KDaKiloDaltons千道尔顿LBLuria-Bertani(broth)LB培养基MCSMultipleCloningSite多克隆位点 MinMinute分钟 MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell)感染复数mRNAMessengerRNA信使RNA MWCOMOIecularWeightCut-off PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresis聚丙烯凝胶电泳PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液PFUPlaqueFormingUnit空斑形成单位 piPostInfection感染后RCAReplicationCompetentAdenovirus增殖性腺病毒RITRRightInvertedTerminalRepeat右侧反向末端重复SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠TBETrisBorate/EDTA三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸 TCID50TissueCultureInfectiousDose5050%组织培养感染剂量 TCPTotalCellularProtein细胞总蛋白 TETris/EDTATE溶液 wtWildType野生型 X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 第一章简介 当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和治疗性的分析工具。为解决这一问题，基因输送技术(通常使用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒)通过基因工程不断发展，致力于生产基因表型药物。重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂。 1953年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现。迄今为止已发现了40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒，它们通常感染眼、呼吸道或胃肠上皮（Fields等，1996）。1977年，FrankGraham博士建立了一种细胞株，可在无辅助病毒的情况下产生重组腺病毒（Graham等，1977）。此后，腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广