百合的组织培养

百合的组织培养

百合是百合科属多年生草本鳞茎植物，是世界著名的观赏花卉。全世界的本属植物约有94种，主要分布在北半球的温带和寒带地区，少数种类分布在热带高海拔地区。中国是百合属植物分布最多的国家，也是世界百合起源的中心，据调查约有47种18个变种，占世界百合总数的一半以上，其中有36种15个变种为中国特有种。随着我国花卉产业的不断发展20世纪80年代后期大量优良的观赏百合栽培品种陆续从荷兰等国引进我国。现已得到广泛栽培，成为我国花卉市场中的重要高档切花种类。

关于百合的组织培养，国内外不少研究者开展了大量的工作。在优良品种快速繁殖、品种脱毒复壮、新品种培育以及种质资源保存等方面，具有较为成熟的技术。

百合植株的不同部分均采用组织培养的方法，繁殖出新个体并进行快速扩繁。据不完全统计，国内外组织培养成功的百合种及品种已超过几百种。最早是Dobreaux等人（1950）首次用纯白百合（Liliumcandidum）的花蕾成功地诱导出小鳞茎。随后Robb(1957)成功地进行了2个种百合鳞片的培养结果如下。

鳞片腹轴面上、中、下三部分形成小鳞茎的百分率分别为0、3.8%及71.3%。春秋季鳞片形成子球率分别为77%及53%，夏季为2%，冬季为0。

Henser(1976)培养兰州百合（L.davidiivar.unicolor）的花柱和花梗，通过愈伤组织途径得到试管小鳞茎。

黄济明（1979~1984）对25个种或品种进行了组培试验，证明百合的珠芽、鳞片、鳞茎盘、根、茎、叶、茎尖、花梗、花柱和未成熟胚等外植体均能被促进形态发生。新美芳二（1980）对百合鳞片、花被片、花丝、花柄等也组培成功，认为开花时各花器官和茎所形成小鳞茎的能力最高。相增海（1983）用4个种的百合鳞片、茎段进行培养证实。种间分化率存在明显差异。取处于休眠期的外植体进行培养，其分化能力下降。

程治英等人（1991~2001）对30多种或品种的百合进行组培证实的结果如下：

（1）用百合根、叶作为外植体，也与鳞片一样，不同部位分化丛芽的能力都是近轴端大于远轴端。

（2）鳞茎鳞片分化能力（分化苗的频率和速度）都是外部大于内部。

杂种品种的分化能力大于野生种，低海拔种大于高海拔种。鳞片组培得到小鳞茎的试管鳞片其分化能力大于原始培养鳞片的分化能力。

王爱勤（1998）比较了9个品种分化小鳞茎的差异，结果表明不同品种的分化能力有明显的不同，显著高的达86%，低的仅13%。赵祥云（2000）等人报道：由花梗或花柱培养的小苗，虽然其鳞茎的培养途径一样，但从移栽到开花的时间可大大缩短，如麝香百合杂种系花柱培养的试管苗从移栽到开花只需半年多时间。李宝平等人（1992）对平陆百合(L.davidiivar.umicolor)组培中发生小鳞茎的条件及人工种皮包埋效果进行了观察和分析。他认为百合鳞茎既是储藏器官又是无性繁殖器官。从植株的整体结构看，它位于中间偏下部位。从遗传势的角度出发，鳞片中偏下部位发生小鳞茎应有的较强遗传势，组培中小鳞茎发生的能力最强，这既符合生物的遗传优势理论，又符合组培实际情况。屈云慧等人近期对从国外引进的100余个百合品种进行了组培研究及快繁生产，在短期内获得了大量的组培种苗。

有效的培养方法

1、培养基配方

诱导培养基：MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L

增殖培养基：MS+BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L

生根培养基：1/2MS+NAA0.1mg/L

2、培养程序

取材及灭菌优选生长健壮、开花性状好的种球作为外植体。在取材前，最好将准备接种

的鳞茎在4~5℃的低温下处理6~8周，然后经洗衣粉常规清洗后，剥去鳞茎外皮及外部2~3层鳞片，切去少许顶部及基部，先用75%的酒精浸泡30~60S，然后在0.1%升汞溶液中处理15~20分钟，次氯酸钠处理10~15分钟，无菌水洗3~4次，即可进行无菌操作切块（段）接种。花器官等培养时，常取未开放的花蕾，消毒后切开，取其内部器官接种。生长及分化鳞茎切块经20天后，切口便产生白色的小鳞茎突起，这时可将其切成数块进行继代培养。在增殖培养基中小鳞茎有所增殖，并抽出叶片，成为幼苗，将其转入生根培养基中，10天左右便可有根形成。此时即可出瓶移栽。在高NAA低BA的培养基中，通过鳞片培养可一次形成完整植株，但幼苗根部有肿胀现象。相反，在高BA和低NAA时，能形成大量的小鳞茎状突起，从中分化出大量的芽，但无根的分化。赵祥云（1996）提出培养基MS+NAA0.03mg/L能够促进百合鳞茎的发育，说明生长素在诱导百合生根的同时也促进鳞茎的发育；MS+BA0.03mg/L+NAA0.03mg/L对百合鳞茎的生长有利，而NAA与BA配合使用时NAA/BA的比值小则有利于百合鳞茎的形成。同时，温度对组培小鳞茎的生长极为重要。百合组培苗生长的最适温度为18~22℃，随温度升高或降低则生长状况不佳。另外对百合组培苗进行暗处理也有利于诱导百合鳞茎的形成。质量标准及调控技术

利用组培技术快速繁殖百合，除要求具有较高的繁殖系数、芽形成根的时间短和过渡移栽有较高的成活率外，更重要的是新生的子代都必须与母体保持一致的物理、化学和遗传特征。涉及组培遗传稳定性的研究者Sheridan(1975)认为铁炮百合愈伤组织培养6年后，其染色体数和再生能力无变化。Ahloowalia(1978)认为百合愈伤组织经长期培养后，其染色体数目、叶形和大小、花的发育、生长优势、成活率、多年生性状等都有所变化，但这些变化不能有性传递。Stimart(1980)也指出百合愈伤组织经长期循环培养，植株活力、叶斑等发生变化，但改变的特征不能有性传递。细木高志（1981）认为百合科植物在栽培中染色体是不稳定的，但直接从外植体再生的植株就不会发生此类情况。景忠平（1989）报道，铁炮百合叶、花被、花枝和子房等外植体培养3年，其分化能力不下降。李耿光等（1983）培养百合茎段，通过愈伤组织途径进行繁殖，培养8代后其分化能力就已下降，但这种结果的形成可能是在组织培养过程中使用激素不当所致（报道中他所用KT含量为10mg/L）。

关于百合组培的实用化研究，国内外不少研究者为此做出了贡献。Takayma等（1980）研究了百合鳞片组培形成小鳞茎的过程，考察了鳞片生理年龄、活性炭、糖浓度等对培养效果的影响。1982年，他又采用固体和液体培养基结合连续光照等措施，达到了快繁大量小鳞茎的目的。新美芳二（1985）研究了光（0、8、16、24H）和温度（20~30℃）对鳞片分化小鳞茎的影响。Scaramazz等（1988）提出经4℃低温处理4~6周的小鳞片，可提前12~20D 分化小鳞茎，并指出采用定期供氧和营养液的生物反应装置来生产小鳞茎是可行的。唐世富等人（1988~1991）、刘选明等人（1996~1998）通过ABT等新型添加剂在百合组织培养中的应用，探讨了组培条件的优化等。温春秋秀等（1997）在进行新铁炮百合的培养中，用微生物多糖固化剂GellanGum2g/L代替琼脂，节约了组培成本。王爱勤（1998）指出糖浓度为10%和添加10mg/L的多效唑（PP333）可促进小鳞茎的生长。

另外还有许多对试管鳞茎休眠现象做了阐述：如铁炮百合30℃下的小鳞茎不休眠，而25℃下的绝大部分鳞茎休眠；低盐低糖和高氮培养基上的小鳞茎不休眠，而高糖（9%）培养基上的小鳞茎会出现休眠现象。不同的品种在3~6℃的温度下39~120D可打破休眠。一般亚洲百合所需时间短（约30天），而东方百合所需时间长（约2~3个月）。休眠现象还与培养小鳞茎时所用的糖浓度有关（Takayama等1982）；3%糖浓度培养下得到的小鳞茎在5℃下约2个月可打破休眠，而9%糖浓度下培养得到的小鳞茎要冷藏约4个月。我们在培养过程中发现，蔗糖浓度较高（40g/L）对小鳞茎的形成和长大有利。如糖浓度降到20g/L，小鳞茎很快能长成幼苗。因此，可用糖浓度控制小鳞茎的生长，使幼苗生长健壮，提高成活率。也有人在组培前用4℃的低温处理鳞片120D，在经组培所得到的小鳞茎不发生休眠现象。

试管苗或试管小鳞茎在栽培中的开花时间也因种而异，如外引杂交品种和新铁炮百合当年可开花，而毛百合、川百合和透百合等要15~24个月开花，兰州百合需3~4年才开花。

出瓶苗的过渡移栽利用种子发芽箱进行百合组培苗过渡培养，可使移栽苗容易适应外界环境条件。当移栽苗放入种子发芽箱时，通过提高温度和湿度，使环境接近培养瓶的环境。3~4天后将覆盖物稍敞开，使温度和湿度降低，为移栽苗进一步适应外界环境创造条件。根长范围在0~1.0cm之间的幼苗，适应性强，生长快，生命力旺盛，适应性短，根系的生长量大，有利于幼苗的健壮入土；而根系较长的幼苗刚从瓶内出来时虽长的很壮，但它的生长势过旺，适应力有所降低，抗逆性差，环境稍不适宜，就易造成根系的损伤或腐烂，从而影响整个幼苗的生长。因此，应选择组培幼苗的根系刚刚萌生正要生长的时期进行移植。过渡培养的前7天内，在1/4倍浓度培养液的条件下，幼苗的生长量最大；在7~15天的一段时间内，在1/3倍浓度培养液的条件下幼苗的生长量最大；而移植入土后，在1/2倍浓度培养液的条件下幼苗的生长最为迅速。移栽的基质也很重要，必须具有良好的土壤结构，使土壤疏松，有利于植株的生长和扎根。试验证明：1/3沙土±1/3草炭+1/3腐殖土是移栽百合组培幼苗较理想的基质。