心血管疾病中硫氧还蛋白相关的信号通路研究进展
硫氧还蛋白_Trx_的研究进展
分子植物育种，２００６年，第４卷，第６（Ｓ）期，第７８－８２页 ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ，２００６，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．６（Ｓ），７８－８２ 专题介绍 Ｒｅｖｉｅｗ 硫氧还蛋白（Ｔｒｘ）的研究进展 郑琼马旭俊杨传平＊ 教育部林木遗传育种与生物技术重点实验室，东北林业大学林木遗传育种省级重点实验室，东北林业大学林学院，哈尔滨，１５００４０ ＊通讯作者，ｙａｎｇｃｐ＠ｎｅｆｕ．ｅｄｕ．ｃｎ 摘要硫氧还蛋白Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ（Ｔｒｘ）是一类高度保守的低分子量蛋白质。Ｔｒｘ广泛分布于植物、细菌、酵母和动物中。根据氨基酸序列的不同，Ｔｒｘ分为家族Ⅰ和家族Ⅱ２个家族。根据最初结构的不同，Ｔｒｘ家族Ⅰ又被分为６大类型：ｈ，ｆ，ｍ，ｏ，ｘ和ｙ。不同类型的Ｔｒｘ在不同生物以及细胞内的不同区域分布不同。硫氧还蛋白具有多种生物学功能，对维持体内稳定的氧化还原状态具有重要的作用。Ｔｒｘ具有调节细胞生长、抑制凋亡、调节基因转录等功能。Ｔｒｘ还与植物抗逆性相关，如参与植物抗旱、耐热和抗氧化胁迫过程，调节抗逆基因的表达。因此，我们可以将硫氧还蛋白基因通过转基因技术导入植物体中，在植物遗传性状改良等方面具有广泛的应用前景。本文综述了硫氧还蛋白的类型、组织分布、生物学功能以及与植物抗逆性的关系。 关键词硫氧还蛋白（Ｔｒｘ），氧化还原，抗逆性 ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＲｏｌｅｓｏｆＴｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ（Ｔｒｘ） ＺｈｅｎｇＱｉｏｎｇＭａＸｕｊｕｎＹａｎｇＣｈｕａｎｐｉｎｇ＊ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＢｒｅｅｄｉｎｇａｎｄＢｉｏ－ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＴｈｅＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙＧｅ－ｎｅｔｉｃｓａｎｄＢｒｅｅｄｉｎｇ，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，ＮｏｒｔｈｅａｓｔＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ，１５００４０ ＊Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，ｙａｎｇｃｐ＠ｎｅｆｕ．ｅｄｕ．ｃｎ ＡｂｓｔｒａｃｔＴｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ（Ｔｒｘ）ｉｓａｓｍａｌｌａｎｄｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎ．Ｔｒｘｉｓｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓｌｙｆｏｕｎｄｉｎｐｌａｎｔｓ，ｂａｃｔｅｒｉａ，ｙｅａｓｔｓａｎｄａｎｉｍａｌｓ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ＴｒｘｉｓｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｆａｍｉｌｙⅠａｎｄｆａｍｉｌｙⅡ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｏｆｔｈｅｉｎｉｔｉａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ＴｒｘｆａｍｉｌｙⅠｉｓｃｌａｓｓｉｆｉｅｄｉｎｔｏ６ｇｒｏｕｐｓ：ｈ，ｆ，ｍ，ｏ，ｘａｎｄｙ．ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｇｒｏｕｐｓｏｆＴｒｘｅｘｉｓｔｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｏｒｇａｎｉｓｍｓａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｐａｒｔｍｅｎｔｓｏｆａｃｅｌｌ．Ｔｒｘｈａｓｖａｒｉｏｕｓｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｓｉｎｋｅｅｐｉｎｇｓｔａｂｌｅｒｅｄｏｘｓｔａｔｕｓｏｆｃｅｌｌｓ．Ｔｒｘｐｌａｙｓｃｒｕｃｉａｌｒｏｌｅｓｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈ，ａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｇｅｎｅｔｒａｎｓｃｒｉｐ－ｔｉｏｎ．Ｉｔｉｓａｌｓｏｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｐｌａｎｔｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅａｎｄｒｅｇｕｌａｔｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｔｒｅｓｓｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓ．Ｔｈｅｓｔｒｅｓｓｅｓｉｎ－ｃｌｕｄｅｄｒｏｕｇｈｔ，ｈｅａｔａｎｄｏｔｈｅｒｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｔｒｅｓｓｅｓ．ＳｏｗｅｅｘｐｅｃｔＴｒｘｇｅｎｅｃａｎｂｅｆｕｒｔｈｅｒｕｓｅｄｉｎｐｌａｎｔｔｒａｉｔｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｂｙｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇｔｈｉｓｇｅｎｅｉｎｔｏｐｌａｎｔｓ．Ｔｈｉｓｐａｐｅｒｒｅｖｉｅｗｅｄｔｈｅｔｙｐｅ，ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃ－ｔｉｏｎｓｏｆＴｒｘａｎｄｉｔｓｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｗｉｔｈｐｌａｎｔｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅ． ＫｅｙｗｏｒｄｓＴｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ（Ｔｒｘ），Ｒｅｄｏｘ，Ｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅ 硫氧还蛋白（ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ，Ｔｒｘ）是一类分布广泛的低分子量的蛋白质，它们在进化上相当保守，有一个二硫化物活性中心Ｔｒｐ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ（ＣＧＰＣ），ＣＧＰＣ中的２个Ｃｙｓ分别为Ｃｙｓ３２和Ｃｙｓ３５，人和其它哺乳动物Ｔｒｘ还含有另外３个Ｃｙｓ残基，即Ｃｙｓ６２、Ｃｙｓ６９和Ｃｙｓ７３，这些Ｃｙｓ残基能可逆地催化许多氧化还原反应，赋予Ｔｒｘ独特的生物学特性。Ｔｒｘ在其保守的活化区域内含有二硫巯基和二硫键，其氧化还原活性使硫氧还蛋白在细胞内具有各种不同的功能（庄静等，２００３，生命的化学，２３（３）：２１０－２１２）。最早被报道的硫氧还蛋白是作为核苷酸还原酶的供体。 硫氧还蛋白系统是由Ｔｒｘ（Ｔｒｘ１、Ｔｒｘ２）、ＮＡＤＰＨ、ＴｒｘＲ（二硫醇二硫化物氧化还原酶—硫氧还蛋白还原酶）３部分组成的，还原态的Ｔｒｘ通过巯基供氢使其它含二硫键的蛋白被还原；氧化态的Ｔｒｘ被ＮＡＤＰＨ还原，继续发挥作用。该系统能够稳定细胞内环境，调节细胞生长及信号传导过程来保护细胞不受病毒感染、电离辐射等外界刺激引起的活性氧损害；还能还原ＤＮＡ合成必需的核糖核苷酸还原酶等多种具有重要功能的蛋白质，对蛋白—蛋白，蛋
硫氧还蛋白氧化还原酶(thioredoxin reductase, TrxR)试剂盒说明书
货号：MS1110 规格：100管/96样 硫氧还蛋白氧化还原酶 （thioredoxin reductase,TrxR）试剂盒说明书 微量法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： TrxR是一种NADPH依赖的包含FAD结构域的二聚体硒酶，属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员，与硫氧还蛋白以及 NADPH 共同构成了硫氧还蛋白系统。TrxR与GR活性类似，催化GSSG还原生成GSH，是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。 测定原理： TrxR催化NADPH还原DTNB生成TNB和NADP+，TNB在412nm有特征吸收峰，通过测定412nm波长处TNB的增加速率，即可计算TrxR活性。 自备仪器和用品： 低温离心机、可调节移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸馏水。 试剂组成和配制： 试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。临用前加入 2mL 蒸馏水溶解。 试剂三：粉剂×1 管，4℃保存。临用前加入 2mL 蒸馏水溶解。 粗酶液提取： 1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g 组织，加 入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。 2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500 万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）； 然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 3. 血清等液体：直接测定。 TrxR 测定操作： 1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到412nm，用蒸馏水调零。 2. 试剂一在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）预热30min。 3. 空白管：取微量玻璃比色皿或96孔板，加入20μL试剂二，20μL试剂三，160μL试剂一， 迅速混匀后于412nm 测定10s和310s吸光度，记为A1和A2。△A空白管=A2-A1。 4. 测定管：取微量玻璃比色皿或96孔板，加入20μL试剂二，20μL试剂三，140μL试剂一， 20μL上清液，迅速混匀后于412nm测定10s和310s吸光度，记为A3和A4。△A 测定管=A4-A3。注意：空白管只需测定一次。 TrxR 活性计算公式： (1). 按蛋白浓度计算 活性单位定义：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分钟催化1nmol DTNB还原为1个酶活单位。 TrxR（nmol/min/mg prot）=（△A测定管-△A空白管）÷ε÷d×V反总÷(Cpr×V样)÷T = 147×（△A 测定管-△A 空白管）÷Cpr 第1页，共2页
硫氧还蛋白与癌症
硫氧还蛋白与癌症：硫氧还蛋白在肿瘤氧化中的作用 摘要 硫氧还蛋白是一种小型氧化还原调节蛋白,在维持细胞氧化还原体内平衡和细胞存活扮演重要的角色，并且在许多癌症细胞中高度表达。肿瘤环境通常处在有氧应激或缺氧性应激中，两种应激条件下硫氧还蛋白表达都会上调。这些环境存在于肿瘤组织中是因为它们的异常血管网络导致不稳定的氧交换。因此,人类肿瘤的氧化作用模式很复杂,导致缺氧/ 再氧化循环。在致癌机制中,肿瘤细胞在应激细胞死亡中通常变得更加耐缺氧或氧化，大多数关于肿瘤氧化的研究都集中在这两种肿瘤细胞环境。然而,最近的研究表明,低氧循环的发生对肿瘤细胞生理活动的作用比单独的氧化应激或缺氧应激的作用大的多。已经知道硫氧还蛋白在这些细胞反应中扮有重要角色，一些研究也表明硫氧还蛋白是癌症研究进展中的突出贡献者。然而,仅有很少有研究调查在癌细胞中硫氧还蛋白在缺氧和缺氧循环响应条件下的调节。本文着重论述了硫氧还蛋白在各种类型的肿瘤氧化中的作用。 关键词：硫氧还蛋白;肿瘤;缺氧;氧化应激;预处理;缺氧循环 一、引文 氧化应激和缺氧应激的微环境都普遍存在于肿瘤。这些区域往往会产生高水平的抗氧化剂, 特别是硫氧还蛋白 (Trx)系统的成员,越来越多的证据表明,Trx系统在肿瘤的扩增和转移中发挥着重要的作用。本文将重点关注Trx系统在不同氧化水平的肿瘤组织中的参与和调节。 二、氧内稳态 氧体内平衡对好氧生物机体是非常重要的。然而, 在一个细胞中这种平衡会被氧气含量的升高或降低打破。因此,在控制细胞体内平衡中氧气对环境适应性是至关重要的。细胞利用不同的机制来适应升高或降低的细胞含氧量。 有氧生物不断通过几个氧化系统代谢氧气,例如NADPH氧化酶类,黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶系统,线粒体呼吸链等。然而,在许多情况下, 氧失去一个电子形成大量的高度活性分子通常称为活性氧(ROS)。ROS包括自由基与未配对电子,比如超氧阴离子自由基、羟基自由基和氧化剂如过氧化氢(H2O2),所有的这些本质上是不稳定的,通常是高活性的。甚至在正常生理条件下细胞内也会产生活性氧分子。 ROS通过参与细胞信号转导和细胞的氧化还原调节扮演一些有益的角色。例如,过氧化氢和过氧化阴离子是活性转录因子的氧化还原调节者,在细胞内信号转导中一些细胞因子和生长因子、荷尔蒙和神经递质采用ROS作为二级信使。另一方面,ROS也可以在细胞造成重大的伤害,比如破坏DNA,脂类物质的氧化，氧化蛋白质中氨基酸分子。为保卫自身,细胞利用几个不同的抗氧化系统。抗氧化剂分子通过阻止或减少ROS氧化目标的氧化抵消ROS过度产生。因此,在正常生理条件下,有氧呼吸细胞的氧化还原(氧化还原)平衡是由ROS和抗氧化剂控调控的。
硫氧还蛋白还原酶小分子抑制剂的发现及抗肿瘤机制探讨
硫氧还蛋白还原酶小分子抑制剂的发现及抗肿瘤机制探讨 由硫氧还蛋白还原酶(TrxR)、硫氧还蛋白(Trx)和NADPH组成的硫氧还蛋白系统是维持生物体氧化还原平衡和基于氧化还原信号通路调节的关键抗氧化系统。越来越多的证据表明硫氧还蛋白系统与人类许多疾病密切相关。 哺乳动物TrxR蛋白主要以细胞质TrxR1和线粒体TrxR2两种形式存在,它是含有硒代半胱氨酸(Sec)残基的硒黄素酶。TrxRs催化电子从NADPH转移到Trxs 的活性位点进而还原Trxs,而还原态Trxs与下游靶点的相互作用对多种基于氧化还原的细胞内反应进行调控,包括细胞增殖、分化和死亡。 恶性肿瘤细胞的硫氧还蛋白水平通常高于正常细胞,靶向Trx/TrxR系统被认为是阻止肿瘤发展和转移的有效方法。因此,近年来人们一直致力于开发针对TrxR的小分子作为癌症的潜在治疗剂。 虚拟筛选是应用计算机方法从化学数据库中选择目标化合物的策略,其被广泛应用于从百万数量级的类药分子数据库中挑选出潜在的活性候选化合物,相比较于传统的筛选流程可以显著降低研发成本和时间。而基于结构的虚拟筛选(Structure-Based Virtual Screening,SBVS)适用于受体结构已知的情况,首先化合物与前期选择的目标结合位点进行对接,通过对结合模式进行预测,SBVS将对接分子进行排序,排序将作为选择潜在分子的标准,或者与其他评价方法综合使用,然后对所选择的化合物进行实验评价,进而确定它们对分子靶标的生物活性。 本论文运用SBVS策略成功地从天然产物数据库的数十万个分子中发现了新的TrxR抑制剂,该研究充分证明了虚拟筛选策略的高效性和选择性。我们对打分靠前的15个化合物进行了毒活和酶抑制活性测试,测试结果显示化合物6、7、
细胞外硫氧还蛋白的作用
细胞外硫氧还蛋白的作用 （作者:___________单位: ___________邮编: ___________） 【关键词】硫氧还蛋白;趋化因子;炎症 硫氧还蛋白(thioredoxin，Trx)是具有多种生物学功能的一种小分子蛋白质。它和硫氧还蛋白还原酶及NADPH组成硫氧还蛋白系统，具有抗氧化、促细胞生长、抗细胞凋亡和调节转录因子活性作用。近年研究发现，Trx可以分泌到细胞外，而胞外Trx与许多疾病有关。胞外Trx抑制中性粒细胞到炎症反应部位，抑制促炎因子的表达释放。因此，胞外Trx即可作为一些疾病的标志，同时又具有重要的免疫调节作用。 1Trx的胞外功能 Trx分子量12 kDa，广泛存在于原核生物和真核生物中〔1〕，其活性位点为-Cys-Gly-Pro-Cys-。Trx又称白细胞介素-1样细胞因子、成人T细胞白血病衍化因子和早孕因子。根据Trx的定位，可以将其分为三种：Trx1、Trx2和Trx3。Trx1位于细胞质中，Trx2位于线粒体中，Trx3则主要存在精子细胞的内质网中。Trx还原作用的机制就在于其与底物X-S2结合后还原蛋白底物。因此，当活性中心的
两个半胱氨酸突变成Ser(C32S/C35S)，则其还原活性丧失〔2〕。Trx 具有多种生物活性：抗氧化、促生长、抗凋亡和调节转录因子活性〔3〕。Trx还可以分泌到细胞外，并且其细胞外浓度变化与很多疾病有关。 1.1胞外Trx的促细胞生长作用及细胞保护功能 Trx 可以通过非分泌途径到细胞外。Wakasugi等〔4〕研究发现，Trx可以由EB病毒感染的T淋巴细胞分泌，分泌到胞外Trx，有促进细胞生长作用。这种促生长作用依赖于Trx的氧化还原活性。在细胞培养基和血浆中，Trx很容易被氧化。如果没有还原剂(如β-巯基乙醇和DTT)存在的情况下，胞外Trx并不表现出促细胞繁殖作用〔4〕。而且，突变型(C32/C35s)Trx即使在β-巯基乙醇存在下也不能促进细胞生长〔5〕。这些研究表明，细胞外的Trx活性位点和其还原状态对其促进细胞生长作用是必需的。Nakamura等〔6〕发现，胞外Trx能抑制肿瘤坏死因子(TNF)和过氧化氢诱导的细胞损伤及凋亡，同时还可抑制由于氧化应激引起的内源性Trx的分泌〔7〕。胞外Trx的细胞保护作用可能是通过与细胞膜上的靶分子相互作用而实现的，也可能由于胞外的Trx可以进入细胞从而发挥作用〔7〕。 1.2胞外Trx的免疫调节作用 氧化态的胞外Trx可抑制脂多糖(LPS)诱导白介素(IL)-1β的表达和分泌〔8〕;胞外Trx经DTT还原处理后，却可刺激IL-1、IL-6和IL-8的产生〔9〕。这就暗示着，无论胞外的Trx是还原状态还是氧化状态，均具有调节细胞因子的作用。腹腔注射重组人Trx可以减弱博莱霉素或炎症因子IL-2和IL-18引起的间质性肺炎和肺纤维化
硫氧还蛋白氧化还原酶(thioredoxin reductase, TrxR)活性测定试剂盒说明书
货号：QS1110 规格：50管/48样硫氧还蛋白氧化还原酶（thioredoxin reductase, TrxR） 活性测定试剂盒说明书 可见分光光度法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： TrxR是一种NADPH依赖的包含FAD结构域的二聚体硒酶，属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员，与硫氧还蛋白以及NADPH共同构成了硫氧还蛋白系统。TrxR与GR活性类似，催化GSSG还原生成GSH，是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。 测定原理： TrxR催化NADPH还原DTNB生成TNB和NADP+，TNB在412 nm有特征吸收峰，通过测定412nm 波长处TNB的增加速率，即可计算TrxR活性。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计、低温离心机、可调节移液器、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。 试剂组成和配制： 试剂一：液体90mL×1瓶，4℃保存。 试剂二：液体5mL×1瓶，4℃避光保存。 试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入5 mL蒸馏水溶解。 粗酶液提取： 1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加 入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。 2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500 万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 3. 血清等液体：直接测定。 TrxR测定操作： 1. 分光光度计预热30 min，调节波长到412nm，用蒸馏水调零。 2. 试剂一在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）预热30min。 3. 测定管：取1mL玻璃比色皿，加入100μL试剂二，100μL试剂三，700μL试剂一，100μL 上清液，迅速混匀后于412 nm测定10 s和310 s吸光度，记为A3和A4。△A测定管=A2-A1。 TrxR活性计算公式： (1). 按蛋白浓度计算 活性单位定义：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分钟催化1nmol DTNB还原为1个酶活单位。TrxR（nmol/min /mg prot）=△A测定管÷ε÷d×V反总÷(Cpr×V样)÷T = 147×△A测定管÷Cpr (2). 按样本质量计算 活性单位定义：在25℃或者37℃中，每克样本每分钟催化1nmol DTNB还原为1个酶活单位。TrxR（nmol/min /g鲜重）=△A测定管÷ε÷d×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T 第1页，共2页
硫氧还蛋白过氧化物酶(thioredoxin peroxidase, TPX)活性测定试
货号：QS1203 规格：50管/24样硫氧还蛋白过氧化物酶（thioredoxin peroxidase,TPX） 试剂盒说明书 紫外分光光度法 注意：正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： TPX属于过氧化物酶家族，在体内主要通过还原过氧化氢和一些氢过氧化物来实现抗氧化作用，功能与GPX类似，也是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。TPX普遍存在于各种生物体内，如酵母、植物、动物、原生动物、寄生虫、细菌和古细菌，在进化上高度保守。TPX与细胞增殖、分化、细胞凋亡及肿瘤发生调控密切相关。TPX的主要功能包括细胞脱毒、抗氧化和调节由过氧化氢介导的信号转导和免疫反应。 测定原理： TPX催化H 2O 2 氧化二硫苏糖醇（DTT），H 2 O 2 的吸收波长为240nm，通过测定240nm吸光度的 下降速率，通过对照减去过氧化氢酶（CAT）催化分解的H 2O 2 ，即可计算出TPX活性。因此， 本试剂盒可以同时测定样品TPX和CAT活性。 自备实验用品及仪器: 紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL石英比色皿和蒸馏水 试剂组成和配制: 试剂一：液体×1瓶，室温保存。 试剂二：液体×1瓶，- 20℃保存。 试剂三：液体×1瓶，4℃。 粗酶液提取： 1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加 入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。 2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500 万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 3.血清等液体：直接测定。 TPX测定操作： 1. 分光光度计预热30min，调节波长到240 nm，蒸馏水调零。 2. 试剂一和试剂二置于25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）水浴预热30 min。 3. CAT活性测定管：取1mL石英比色皿，加入20 μ L上清液，900 μ L试剂一，80 μ L 试剂三，迅速混匀后于240 nm测定10 s和130 s吸光度，记为A1和A2。 4.总活性测定管：取1mL石英比色皿，加入20 μ L上清液，900 μ L试剂二，80 μ L试剂三，迅速混匀后于240 nm测定10 s和130 s吸光度，记为A3和A4。 注意：每个样品都需要做对照管，以减去过氧化氢酶（CAT）催化降解的H 2O 2。 TPX活性计算公式： 第1页，共2页
关于硫氧还蛋白系统在细胞死亡进程中的作用
关于硫氧还蛋白系统在细胞死亡进程中的作用 概论 意义：硫氧还蛋白（Trx）系统，包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,Trx还原酶（TrxR），Trx是维持细胞氧化还原平衡和抗氧化功能的关键，包括控制氧化应激和细胞死亡。最新进展：我们专注于研究Trx系统调控参与细胞凋亡。在哺乳动物细胞中，细胞内的Trx1和线粒体Trx2是主要的二硫化物还原酶为细胞增殖和发育提供电子和酶。减少/硫醇硫氧还结合凋亡信号调节激酶1 （ASK1 ）并抑制其活性以防止应力和细胞因子诱导的细胞凋亡。当TRX被氧化，它将解离ASK1并且刺激凋亡。结合抑制Trx的相互作用蛋白（TXNIP ）也有助于细胞凋亡的过程通过将ASK1上的TRX移除。TrxRs是一个大的同型二聚体硒蛋白，其整体结构类似于谷胱甘肽还原酶，TrxRs在C-末端还包含活性部位GCUG。关键问题和未来发展方向：在调节细胞死亡过程中TRX氧化还原状态和TrxR的活化是决定细胞命运的关键因素。在TrxRs的SEC的高反应性在反应位置使TrxR 的酶出现作用药物的靶点。通过共价修饰使TrxR失活不仅仅改变TRX的氧化还原状态和活化,而且也使TrxR转换成活性氧发生器。许多电子化合物，包括一些环境毒素和药品可抑制TrxR。这些化合物的分类，分为四种类型，并提出了一些有用的原则，以了解这些化合物对TrxR抑制的反应机理。 序言 蛋白巯基参与许多蛋白质的催化活性并在氧化反应下可能改变二硫化物。该硫醇- 二硫化物的变化可能会影响酶的活性，因此调节细胞功能。硫氧还蛋白（Trx），是一个12 kDa的硫醇蛋白，它从古菌和细菌到人进化上保守，它本身就是维持蛋白质硫醇/二硫化物动态平衡的一个关键因素。Trx与Trx还原酶（TrxR）结合，Trx可以提供电子从烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH ）到关键的细胞蛋白的，因此它参与广泛的细胞功能（图1）。例如，最初发现的Trx由大肠杆菌核糖核苷酸还原酶（RNR ）作为电子给体。普遍存在的RNR 催化的从头合成2 '- 脱氧核糖核苷酸其相应的核糖核苷酸和DNA复制和修复是必不可少的。RNR从脊椎动物到大肠杆菌都是有二聚体R1和R2亚基组成的复合物。R2亚基有一个稳定的酪氨酰自由基氧联的铁中心，这是催化反应所必须的。R1亚单位含有一个底物结合部位、一个变构部位、一个二硫醇的活性位点和两条穿梭在C-末端的巯基。在活性位点的二硫醇被转换为二硫化物后引起一个周期的催化反应，但是二硫醇经C-末端巯基通过硫醇-二硫化物交换后减少。相反，在C-末端的二硫化物减少是由Trx或谷氧还蛋白（GRX）。其他已知的TRX底物有广泛分布于各种亚细胞器的过氧还蛋白（Prxs）、Trx依赖的过氧化物酶。这使他们能够清除H2 O2和更具体的控制信号转导。甲硫氨酸- S -亚砜还原酶可以自身催化还原或蛋白结合蛋氨酸亚砜还原为蛋氨酸，它也是Trx的底物。Trx除了是一个二硫键还原酶，它还通过介导蛋白质S- 去亚硝基化参与调控细胞过程中。 Trxs基因在哺乳动物细胞死亡进展中的作用 哺乳动物Trx系统 胞质内Trx1和线粒体内Trx2存在于哺乳动物细胞中，包含有一个活性位点Trp-Cys-Gly-Pro-Cys，在一个表型Trx折叠结构（图2）。人类TRX1与105个氨基酸残基一起，三种结构的Cys残基的位置为62、69和73 ，除了Cys32和Cys35在活化位点。Cys62和Cys69位于Trx- S2 在氧化应激条件下可以形成第二个二 ， 硫键（图2）。虽然这两个二硫键形成低表征Trx- S2，但不能直接通过TrxR被减
硫氧还蛋白还原酶的生理学功能进展
硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductase，TrxR）是二聚体黄素酶，属于吡啶核苷酸二硫化物还原酶家族的一员，广泛表达于从原核生物到人类的各级有机体细胞中[1]，因分布区域不同，三种同工酶分别命名为硫氧还蛋白R1（TrxR1）（细胞质型）、TrxR2（线粒体型）和一个主要在睾丸中表达的同工酶TrxR3（又名TGR）[2]。TrxR2具有额外的N末端单侧的谷氧还蛋白区域，它是催化氧化型谷胱甘肽（GSH）还原的结构基础，因此TrxR3又被命名为硫氧还蛋白和谷胱甘肽还原酶。胞质型TrxR1发现最早，分布也较广泛，是目前研究得最多的一种同工酶。TrxR以Trx为底物和还原型烟酰胺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）提供还原反应的还原当量，它们共同构成的氧化还原调控系统，叫做硫氧还蛋白系统。硫氧还蛋白系统在生物体内发挥着广泛的重要生理功能。现对硫氧还蛋白还原酶的生理学功能作一综述。 1TrxR的生理学功能 1.1调控氧化还原平衡线粒体有氧呼吸等生理过程产生的O2-通过超氧化物歧化酶（SOD）催化或者自发性地快速歧化反应产生大量过氧化氢（H2O2）。线粒体呼吸作用的底物和胞质溶胶磷酸戊糖循环还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）为NADPH，然后轮流地输送还原当量至Trx和GSH系统。在线粒体中，结合在膜上的转氢酶把电子从NADH转移到NADP+。巯基/二硫化物氧化还原系统最终转运电子至H2O2，H2O2被还原成水。任一途径的抑制显著增加胞内H2O2的浓度。过氧化物酶[peroxidases/per-oxiredoxins（Prxs）]系统（是细胞抵抗H2O2和过氧化亚硝酸盐降解酶的大家族）与谷胱甘肽过氧化物（glutathione peroxidase，GPxs）系统是胞质内维持机体的过氧化物稳定状态水平的关键酶类，其中Prxs在反应中被氧化后需要通过TrxR的还原而再生，而TrxR 也可以作为血液型谷胱甘肽过氧化物酶的有效电子传递体还原血液中的GPxS[3]。因此，TrxR表达和活性的改变是细胞氧化还原平衡维持的一个重要决定因素。 有研究证明了TrxR和它催化的Trx在抵御氧化应激过程中的作用。通过测定胞内活性氧簇（ROS）发现类风湿性关节炎（RA）滑膜细胞中氧化应激增加，同时发现RA滑膜细胞TrxR1蛋白上调，进一步分析显示，细胞通过上调TrxR1而抑制了过氧化氢和RA滑膜细胞凋亡，从而保护细胞抵御氧化应激[4]。Trx还能保护内皮细胞和肾脏的缺血再灌注损伤。重组人Trx可拮抗H2O2对细胞的损伤，过表达Trx的转基因鼠有保护大脑缺血再灌注损伤作用。蔡成等[5]研究高浓度氧暴露对人肺泡Ⅱ型上皮细胞来源的肺腺癌A549细胞中Trx2的影响，结果发现诱导A549细胞中Trx2mRNA和蛋白水平发生动态变化，这种变化表明Trx 对高氧肺损伤线粒体可能起重要的保护作用[5]。TrxR所在的Trx 系统可再生部分抗氧化物质，包括维生素C和维生素E的还原、硫辛酸、泛醌（辅酶Q10）、蛋氨酸亚砜还原酶、含硒物质等，实现对氧化还原平衡的调控[6-7]。 1.2调控细胞生长和凋亡TrxR活性抑制到低于正常水平会产生对细胞生长的抑制。核苷酸还原酶是在复制细胞或者快速生长的肿瘤细胞中在DNA合成期（S期）特异表达的酶，具有核糖核苷酸向2′-脱氧核糖核苷酸转变的功能并且因此提供了DNA合成和修复的前体。细胞用TrxR抑制剂阿霉素和地丫醌中任何一种化合物处理导致核苷酸还原酶的抑制和细胞生长的抑制[2]。用不同浓度TrxR抑制剂1，2-[1，2-苯并异硒唑-3（2H）-酮]乙烷（BB-SKE）处理人子宫颈癌细胞HeLa、肝癌细胞Bel-7402、胃癌细胞BGC823和人口腔表皮样癌（KB）细胞，各处理组细胞生长抑制率显著高于对照组，TrxR活性和细胞活性呈线性关系（r≥0.989），凋亡相关蛋白Bcl-2（抗凋亡）/Bax（促凋亡）比值降低，促进了细胞凋亡[8]。此外，Sroka等[9]用有机锡化合物二苯基锡（DPhT）处理人胚肾细胞（HEK-293），发现抑制了细胞间隙连接通讯（GJIC），细胞生长受到抑制；在过表达TrxR1的HEK-TrxR15细胞中，该效应被逆转。 很多影响细胞分裂的基因可被各种应激因素调节，其中受氧化还原调节的基因和转录因子尤其普遍，这些转录因子大多含有巯基基团，其中部分由TrxR/Trx系统调节，较重要的有肿瘤蛋白P53、NF-κB、AP-1、糖皮质激素受体和雌激素受体，其活性都是巯基依赖性的，均参与细胞增殖和凋亡的调节。在这些生理过程中，TrxR对Trx还原活性的维持是Trx功能行使的保证，也是这些受控蛋白免于应激情况下的保护作用所必需的。 1.3调控早期胚胎发育Marcus等采用缺失线粒体TrxR2的小鼠突变体产生的胚胎。结果显示，TrxR2-/-胚胎更小并且极度贫血并且显示肝脏中凋亡增加；体外培养的造血菌落与对照组相比急剧减小。TrxR2-/-的胚胎成纤维细胞对内源氧自由基高度易感，当GSH合成被抑制时，除了造血功能的缺陷外，TrxR2-/-胚胎的心室壁更薄并且心肌增殖降低。这些胚胎在13d出现了死亡。表明TrxR2在造血（红细胞生成）和心脏功能方面起着至关重要的作用。也有研究显示Trx2基因突变后将会引起脑部先天畸形和早 硫氧还蛋白还原酶的生理学功能研究进展 周润梅（重庆医科大学附属第二医院，重庆400010） 【关键词】硫氧还蛋白二硫化物还原酶；硫氧还蛋白质类/生物合成；过氧化物酶；氧化还原文章编号：1009-5519（2012）16-2487-02中图法分类号：R341文献标识码：A
浅谈POCT及硫氧还蛋白还原酶活性检测在肿瘤领域的应用与进展
Medical Diagnosis 医学诊断, 2016, 6(1), 25-34 Published Online March 2016 in Hans. https://www.360docs.net/doc/a114416055.html,/journal/md https://www.360docs.net/doc/a114416055.html,/10.12677/md.2016.61006 Discussion of the Applications and Progress of POCT and Thioredoxin Reductase Activity Testing (TrxR) in the Field of Oncology Ning Xiang1, Lei Zhang2, Huihui Zeng1* 1Pharmaceutical Sciences of Peking University, Beijing 2Basic Medical School of Peking University, Beijing Received: Mar. 8th, 2016; accepted: Mar. 27th, 2016; published: Mar. 30th, 2016 Copyright ? 2016 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). https://www.360docs.net/doc/a114416055.html,/licenses/by/4.0/ Abstract Malignant tumors are the most common lethal diseases in China. Because of the complexity of carci-nogenesis and the lack of specific markers for early diagnosis, so delayed cancer diagnosis and treatment in clinic has a very high mortality rate. Tumor marker has important significance for early screening of carcinoma. However, the current biomarker detections for neoplasm mostly depend on the professional laboratories where it is of high-cost and difficult to extend such assay service in those medically challenged places. Recently point-of-care testing (POCT) has been rapidly developed. Due to its good portability, fast results and easy operation, it is beneficial for cancer screening in human population. Thioredoxin reductase (TrxR) is a novel tumor marker whose expression and activity reflect the extent of abnormal cellular proliferation to some degree. Overall, the combined application of POCT and TrxR activity assay may be a promising strategy for cancer prevention. Keywords Malignant Tumors, Tumor Marker, POCT, TrxR Activity Testing 浅谈POCT及硫氧还蛋白还原酶活性检测在肿 瘤领域的应用与进展 相宁1，张磊2，曾慧慧1* *通讯作者。
硫氧还蛋白还原酶结构与功能研究进展
动物医学进展,2019,40(9):79-83 Progress in Veterinary Medicine 硫氧还蛋白还原酶结构与功能研究进展 陆金苗⑺，韦娜娜2,周金林2* (1.上海师范大学生命与环境科学学院，上海200241,2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241)摘 要：硫氧还蛋白还原酶(TrxR)是硫氧还蛋白系统里主要的功能蛋白，广泛存在于从原核生物到哺 乳动物等多个物种之中。TrxR 属于毗吱核昔酸/二硫氧化还原酶家族的成员，TrxR 主要通过氧化还原反 应，传递电子.解除机体氧化应激反应，是机体抵抗体内外因素导致的氧化应激损伤的主要途径。同时其参 与碳水化合物合成、胰岛素产生、脂肪代谢等多种生理过程，以及慢性炎症、肿瘤、动脉粥样硬化等疾病的发 生发展。论文从TrxR 的结构和功能等方面进行综述，以对TrxR 研究提供参考。 关键词：硫氧还蛋白还原酶；氧化还原；结构与功能 中图分类号：S852.3；Q554 文献标识码：A 文章编号:1007-5038(2019)09-0079-05 硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)系统是多个物种 普遍存在的二硫化物还原酶系统.由硫氧还蛋白 (Trx)，硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase. TrxR)和还原型辅酶 U (triphosphopyridine nucleo - tide, NADPH )组成TrxR 是目前已知的，唯一 能够还原Trx 的酶⑵，通过二硫键还原酶活性调节 蛋白质的二硫醇/二硫键平衡。TrxR 还原能力与氧 化应激保持动态平衡，是保证机体正常的关键因素。 氧化应激因素包含超氧离子、轻自由基、过氧化 氢等活性氧。活性氧(reacti veoxygenspecies , ROS)通 收稿日期:2018-09-14 基金项目：国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2015CB150300)作者简介：陆金苗(1992-),女，陕西宝鸡人，硕士研究生，主要从事蝉和病原体研究。*通讯作者来来来米枠米米来亲来来济来米乗涤来?来米米来乗来米莱潦来潦来米来来乗奈乗来乗来乗来来来※济来来来米来米来※*来课米来蝶来米洪漲来来菜歩来来潦兴潦来京米来米课来来济来济馀来来来漳米?*米修来* [21] Barros E M,Lemos M,Souto-Padrdn T?et al.Phenotypic and gen -otypic characterization of biofilm formation in Staphylococcus haemolyticus[_]\.C\ixx Microbiol,2015?70(6) :829-834.[22] 陈朝喜.细菌生物被膜定性和定量研究方法[J].湖北农业科 学,2016,55(9):2177-2180.[23] Alabdullatif M, Atreya C D, Ramirezarcos S. Antimicrobial peptides ： an effective approach to prevent bacterial biofilm formation in platelet concentrates [J J. Transfusion, 2018,58 (8):2013-2021. [24] Jung S J ,Park S Y?Kim S E,et al.Bactericidal effect of calci -um oxide (scallop-shell powder) against Pseudomonas aerug - inosa biofilm on quail egg shell * stainless steel , plastic * and rubber [J].J Food Sci ,2017 ?82( 7) ： 1682-1687. [25] Liu Z, Lin Y,Qi L?et al.In vitro and in vivo activity of EDTA and antibacterial agents against the biofilm of mucoid Pseud - omonas aeruginosa [J].Infection,2016,45( 1) ： 1-9.[26] Zhang R .Chen M . Lu Y,et al. Antibacterial and residual anti -microbial activities against Enterococcus faecalis biofilm : A comparison between EDTA, chlorhexidine, cetrimide, MTAD and QMix [J].Sci Rep,2015(5) ： 12944-12949. Progress on Bacterial Biofilm WANG Hong-bin,ZHU Li-xia,YU Xiu-jian,GA() Gui-sheng,SHI Qiu-mei,WU Tong-lei (Hebei Key Laboratory o f Preventive Veterinary Medicine , Hebei Normal University of Science & Technology ,Qinhuangdao , Hebei ,066604 ) Abstract : Biofilm refers to microbial aggregates formed by bacteria adhered to the surface of inert or active entities, secreted some substances and encapsulated the bacteria .It has multi-drug resistance and immune escape ability ,so it is highly pathogenic and of intractable characteristics.The paper briefly introduced the main biological biofilm , formation process ,drug resistance and drug resistance mechanism , infection caused by biofilm ‘detection method and prevention and control, in order to prevent and control the biofilm.Key words : bacteria ； biofilm ； detection method ； control method
硫氧还蛋白氧化还原酶(thioredoxin reductase, TrxR)活性测定试剂盒使用说明
硫氧还蛋白氧化还原酶（thioredoxin reductase,TrxR）活性测定试剂盒使用说明 分光光度法货号：BC1150 规格：50管/48样 产品说明： TrxR是一种NADPH依赖的包含FAD结构域的二聚体硒酶，属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员，与硫氧还蛋白以及NADPH共同构成了硫氧还蛋白系统。TrxR与GR活性类似，催化GSSG还原生成GSH，是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。 TrxR催化NADPH还原DTNB生成TNB和NADP+，TNB在412nm有特征吸收峰，通过测定412nm波长处TNB的增加速率，即可计算TrxR活性。 自备仪器和用品： 可见分分光光度计、低温离心机、可调节移液器、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。 产品内容： 试剂一：液体×1瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加入5mL蒸馏水溶解。 试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入5mL蒸馏水溶解。 操作步骤： 一、粗酶液提取： 1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织， 加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。10000rpm，4℃离心10min，取上清置冰上待检测。2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建
议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3s，间隔7s，总时间3min），然后10000rpm，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 二、TrxR测定操作： 1.分分光光度计预热30min后，调节波长到412nm，用蒸馏水调零。 2.试剂一在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）预热30min。 3.空白管：取1mL玻璃比色皿，加入100μL试剂二，100μL试剂三，800μL试剂一， 迅速混匀后于412nm测定10s和310s吸光度，记为A1和A2。△A空白管=A2-A1。 4.测定管：取1mL玻璃比色皿，加入100μL试剂二，100μL试剂三，700μL试剂一， 100μL上清液，迅速混匀后于412nm测定10s和310s吸光度，记为A3和A4。△A测定管=A4-A3。 三、TrxR活性计算： (1)按蛋白浓度计算 活性单位（U）定义：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分钟催化1μmol DTNB还原。 TrxR（U/mg prot）=（△A测定管-△A空白管）÷ε÷d×V反总÷(Cpr×V样)÷T =0.147×（△A测定管-△A空白管）÷Cpr (2)按样本质量计算 活性单位（U）定义：在25℃或者37℃中，每克样本每分钟催化1μmol DTNB还原。 TrxR（U/g）=（△A测定管-△A空白管）÷ε÷d×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T =0.147×（△A测定管-△A空白管）÷W （3）按细胞数量计算 活性单位（U）定义：在25℃或者37℃中，每104个细胞每分钟催化1μmol DTNB还原。 TrxR（U/104cell）=（△A测定管-△A空白管）÷ε÷d×V反总÷(细胞数量×V样