引物表格

基因引物

P1 TAA AGA CCT GCT GCT CTT GA SPT-TP1

P2 A TG GCA GAA AAC

efla

分子生物学常用引物序列

日常备库引物序列(5'-3') 1492R GGTTACCTTGTTACGACTT 27F\8F AGAGTTTGATCCTGGCTCA 35S GACGCACAATCCCACTATCC 3'AD AGATGGTGCACGATGCACAG 3'AOX\AOX1rev GGCAAATGGCATTCTGACAT 3'BD TAAGAGTCACTTTAAAATTTGTATAC 5'AD\GAL4AD\P17110 TACCACTACAATGGATGATG 5'AOX\AOX1for GACTGGTTCCAATTGACAAGC 5'BD\GAL4-BD-Cfor TCATCGGAAGAGAGTAG 96gIII\M13-96 CCCTCATAGTTAGCGTAACG a-FACTOR\Alphafor TACTATTGCCAGCATTGCTGC BAC1 AACCATCTCGCAAATAAATA BAC2 ACGCACAGAATCTAGCGCTT BGH\pCDNA3.1R TAGAAGGCACAGTCGAGG CMV-24 TTAGGACAAGGCTGGTGG CMV-30 ATAACCCCGCCCCGTTG CMV-F\CMV-Profor CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG\ATGGGCGGTAGGCGT G CMV-R TCGTTGGGCGGTCAGC DuetDOWN1 GATTATGCGGCCGTGTACAA DuetUP1 GATCTCGACGCTCTCCCT DuetUP2 TTGTACACGGCCGCATAATC EBVrev GTGGTTTGTCCAAACTCATC EGFP-Cfor AGCACCCAGTCCGCCCTGAGC EGFP-Nrev CGTCGCCGTCCAGCTC GAL1-Profor AACATTTTCGGTTTGTATTACTTC GLP1 TGTATCTTATGGTACTGTAACTG GLP2 CTTTATGTTTTTGGCGTCTTCCA

常用的β-actin 引物序列

human actin f ctc cat cct ggc ctc gct gt human actin r gct gtc acc ttc acc gtt cc product size:268 rabbit actin r agt gcg acg tgg aca tcc g rabbit actin f tgg ctc taa cag tcc gcc tag product size:295 mouse actin r cgt tga cat ccg taa aga cc mouse actin f aac agt ccg cct aga agc ac product size:281 rat actin f TCAGGTCATCACTATCGGCAAT rat actin r AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA product size:432 human actin r gag cta cga gct gcc tga cg human actin f cct aga agc att tgc ggt gg product size:416 mouse actin f tca tca cta ttg gca acg agc mouse actin r aac agt ccg cct aga agc ac product size:399 rat actin f CCCATCTATGAGGGTTACGC rat actin r TTTAATGTCACGCACGATTTC product size:150 rabbit actin f tct tcc agc cct cct tcc tg rabbit actin r cgt ttc tgc gcc gtt agg t product size:409 内参基因名称引物引物最佳退火扩增基因库序列号引物名称序列位置Tm 温度C 长度 Human actin beta F305 ctgggacgacatggagaaaa 305-324 52.3 BC002409 R868 aaggaaggctggaagagtgc 868-849 52.6 59.4 564 F1379 agcgagcatcccccaaagtt 1379-1398 57.3 R1663 gggcacgaaggctcatcatt 1663-1644 56.3 54 285 Rat actin beta F18 cacccgcgagtacaaccttc 18-37 54.5 NM_031144 R224 cccatacccaccatcacacc 224-205 54.4 60.4 207 F694 gagagggaaatcgtgcgtgac 694-714 54 R1146 catctgctggaaggtggaca 1146-1127 53.2 57.1 452 Mouse actin beta F91 atatcgctgcgctggtcgtc 91-110 57.5 NM_007393 R607 aggatggcgtgagggagagc 607-588 57.8 60.4 517 F1566 gtccctcaccctcccaaaag 1566-1585 54.5 F1831 gctgcctcaacacctcaaccc 1831-1811 54.4 55.7 266 human GAPDH F369 agaaggctggggctcatttg 369-388 55.6 BC004109 R626 aggggccatccacagtcttc 626-607 55.1 57.5 258

引物设计原则(必看)

mi引物设计原则 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。 6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG 值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。引物序列应该都是写成5-3方向的， Tm之间的差异最好控制在1度之内，另外我觉得扩增长度大一些比较好，500bp左右。要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能

腐烂茎线虫不同地理种群ITS区序列比对及系统发育

文章编号:1000-1573(2007)05-0079-05 腐烂茎线虫不同地理种群IT S 区序列比对及系统发育王金成1, 季镭2, 黄国明1, 杨秀丽1, 林茂松2 (1.天津出入境检验检疫局,天津300456; 2.南京农业大学植病系,江苏南京210095) 摘要:为弄清我国腐烂茎线虫(Ditylenchus destr uctor )不同地理种群IT S(I nternal transcr ibed spacer)区之间的碱基差异及系统发育关系,本研究通过网络软件Clustalw 1.83对腐烂茎线虫的核糖体I T S 区核酸序列进行了比对,结果发现腐烂茎线虫的8个种群中,DEll 、DEly 、DEAY987007三个种群(I 组)内部之间的碱基差异在1%以内,其它的5个种群(II 组)之间的差异为0~1%,而I 组与I I 组种群之间的差异达到了15%(根据IT S1+ 5.8s +IT S2序列)或20%(根据IT S1+IT S2序列)。这说明我国腐烂茎线虫很可能是1个复合种。根据IT S 区核酸序列构建的系统发育图同样显示,我国腐烂茎线虫的7个地理种群明显分为2个分支A 和B 。关键词:腐烂茎线虫;鳞球茎茎线虫;食菌茎线虫;IT S(Inter nal transcribed spacer);系统发育关系中图分类号:S 435.621.2+9 文献标识码:A Alignments of rDNA -ITS sequences and phylogeny of different geo populations of Ditylenchus destructor in China WAN G Jin cheng 1,JI Lei 2,HU ANG Gu o ming 1,YAN G Xiu li 1,LIN Mao song 2 (1.T ianjin Entr y-Exit Inspection and Quar antine Bureau,T ianjin 300456,China;2.Dept.of Plant P atholog y,N anjing A gricultural U niversity ,N anjing 210095,China) Abstract :The IT S sequences of 8populations of sw eet potato stem nematode,Ditylenchus destr uctor ,w ere analyzed.The pair-w ise divergences for IT S1+ITS2sequences and IT S1+5.8s +IT S2sequences of 3populations (group I),DEll,DEly and DEAY987007,are w ithin 1%.T he pair-w ise divergence w ithin other 5populations (group II),DEjl,DEsg ,DEws,DEw y,DEhblf,varied from 0~1%.However,the divergence betw een group I and group II is 15%for ITS1+5 8s+ITS2sequences or 20%for ITS1+IT S2sequences.T he MP analysis divided the 8above-mentioned populations into tw o clades.The clade B includes DEll,DEly and DEAY987007(group I),and the other 5populations in group II belong to clade A. Key words:Ditylenchus destr uctor ; D.dip saci; D.myceliop hagus;ITS (Internal Transcribed Spacer);phy logenetic relationships 收稿日期:2006-11-10 基金项目:天津自然科学基金资助项目(05YF JM JC10800) 作者简介:王金成(1978-),男,山东潍坊人,硕士,农艺师,主要从事植物线虫方面的研究.E mail:goldcit ywang @yahoo. https://www.360docs.net/doc/bf354273.html, 通讯作者:林茂松(1948-),男,江苏徐州人,博士,教授,主要从事植物线虫方面的研究. E mail:linms@https://www.360docs.net/doc/bf354273.html, 第30卷第5期2007年9月河北农业大学学报 JOURNAL OF AGRICULT URAL UNIVERSIT Y OF H EBE I Vol.30No.5Sep .2007

实验室常用缓冲液常用引物序列汇总

实验常用试剂、缓冲液的配制方法 Na2HPO4，2 mM KH2PO4 1 M Tris-HCl 、11M Tris-HCl □组份浓度 □配制量□配制量1L 1L （pH7.4，7.6，8.0） □配置方法1. 称量下列试剂，置于1L烧杯中。烧杯中。□配置方法1. 称量121.1gTris置于1L NaCl 加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解。 8 g 2. KCl 0.2g 3. 按下表量加入浓盐酸调节所需要的pH值。 Na2HPO4 1.42 g 浓值 HCl pH KH2PO4 0.27g 7.4 约70mL 2. 向烧杯中加入约800 mL的去离子水，充分搅拌溶解。 7.6 约60mL 3. 滴加HCl将pH42mL 8.0 约值调节至7.4，然后加入去离子水将溶液定容至1L。 4. 将溶解定容至1L。 4. 高温高压灭菌后，室温保存。 5. 高温高压灭菌后，室温保存。注意：上述PBS Buffer中无二价阳离子，如需要，可在配方中pH注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的补充1mM CaCl2和0.5 mM MgCl2。pH值随温度的变化差很大，温度每升高1℃，溶液的值大约降低 6、10 M醋酸铵0.03个单位。□组份浓度10 M醋酸铵 □配制量100mL 1.5 M Tris-HCl 2、1.5 M Tris-HCl □组份浓度□配置方法1. 称量77.1g醋酸铵置于100～配制量pH8.8 （）□1L 200 mL烧杯中，加入约30 mL的去离子水搅拌溶解。1L1. □配置方法称取181.7gTris置于烧杯中。 2. 加入约800mL2.加去离子水将溶液定容至100mL。的去离子水，充分搅拌溶解。 3.使用8.8pH3. 用浓盐酸调值至。0.22μm滤膜过滤除菌。 4.密封瓶口于室温保存。。1L 4. 将溶液定容至 5. 高温高压灭菌后，室温保存。注意：醋酸铵受热易分解，所以不能高温高压灭菌。 7、Tris- HCl平衡苯酚□溶液的注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris配置方法 1. 使用原料：大多数市售液化苯酚是清亮无色的，pH值大约无需重蒸馏℃，溶液的值随温度的变化差异很大，温度每升高pH1便可用于分子生物学实验。0.03降低个单位。但有些液化苯酚呈粉红色或黄色，应避免使用。同时也应避免使用结晶苯酚，结晶苯酚必须在160℃对其，□TE Buffer、310×组份浓度100 mM Tris-HCl10 mM EDTA

引物设计常见问题

引物设计常见问题与解答(二) 17. 长链引物为什么出错的几率非常高答：引物合成时，每一步反应效率都不能达到100%,产生碱基插入，缺失，置换突变的因素客观条件都有一直存在。引物链越长，突变的频率累加起来就越高。研究人员总希望合成的引物万无一失，这种心情可以理解。但是犹如PCR扩增，不可能绝对保证扩增产物中没有突变，引物合成也不可能保证100%正确。要知道，引物合成中发生错误（非人为因素）的频率，比任何高保真高温聚合酶PCR扩增过程所产生的频率都要高。做引物合成，长链引物合成，您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。 18. 如果测序发现突变，该如何处理答：对您遇到的困惑，我们表示同情。遇到这种情况，首先和我们取得联系，我们的生产人员会检查生产的原始记录，主要是核对合成序列是否和定单一致，我们在电脑中保留所有原始数据。如果确认引物合成序列没有输错，我们建议重新挑取克隆测序，您可能会找到正确克隆的。根据我们经验，40个碱基以下的引物，测1-2个克隆就可以了；40个以上的特别是用于全片段拼接合成的，就需要多测一些了。一般情况下，每个克隆突变的位点都不一样，提示正确的总是有的，就是如何找到它。您也可以要求我们将引物免费重合一次，不过重合的引物和第一次的引物一样，都可能含突变，不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几率。基因拼接过程中，如果发现一段区域突变点不多，就多测几个，否则就重合一下引物。 19. 如果测序发现引物突变，是否有补偿答：没有。我们可以免费重合一次，没有其他任何补偿或赔偿，不承担其他连带责任。原因我们在前面已提到，化学合成效率不可能达到100%.您选择了化学合成引物，合成过程中一些副产品所带来的后果就可能不可避免的遇到。 20. 引物是经过PAGE纯化的，为什么还有碱基缺失或插入答：理论上分析型PAGE变性电泳，可以区分引物之间一个碱基的差别。但是制备PAGE电泳，上样量都是非常大，电泳时的条带非常宽，带与带之间有重叠，分辨率已下降，电泳后割带回收目的引物时，很难说不割到差别仅几个碱基的引物。国内有一个不好的现象，PAGE纯化的引物，特别是长引物要的量都比较高，导致割的条带有时可能比较宽。建议：您如果减少OD数，引物遇到的问题可能就会少一些。 21. 为什么OPC或PAGE纯化的引物，再用HPLC鉴定纯度不高

ISSR通用引物序列

UBC Primer Set #9 (Microsatellite) 引物名称序列 801 ATA TAT ATA TAT ATA TT 802 ATA TAT ATA TAT ATA TG 803 ATA TAT ATA TAT ATA TC 804 TAT ATA TAT ATA TAT AA 805 TAT ATA TAT ATA TAT AC 806 TAT ATA TAT ATA TAT AG 807 AGA GAG AGA GAG AGA GT 808 AGA GAG AGA GAG AGA GC 809 AGA GAG AGA GAG AGA GG 810 GAG AGA GAG AGA GAG AT 811 GAG AGA GAG AGA GAG AC 812 GAG AGA GAG AGA GAG AA 813 CTC TCT CTC TCT CTC TT 814 CTC TCT CTC TCT CTC TA 815 CTC TCT CTC TCT CTC TG 816 CAC ACA CAC ACA CAC AT 817 CAC ACA CAC ACA CAC AA 818 CAC ACA CAC ACA CAC AG 819 GTG TGT GTG TGT GTG TA 820 GTG TGT GTG TGT GTG TC

821 GTG TGT GTG TGT GTG TT 822 TCT CTC TCT CTC TCT CA 823 TCT CTC TCT CTC TCT CC 824 TCT CTC TCT CTC TCT CG 825 ACA CAC ACA CAC ACA CT 826 ACA CAC ACA CAC ACA CC 827 ACA CAC ACA CAC ACA CG 828 TGT GTG TGT GTG TGT GA 829 TGT GTG TGT GTG TGT GC 830 TGT GTG TGT GTG TGT GG 831 ATA TAT ATA TAT ATA TYA 832 ATA TAT ATA TAT ATA TYC 833 ATA TAT ATA TAT ATA TYG 834 AGA GAG AGA GAG AGA GYT 835 AGA GAG AGA GAG AGA GYC 836 AGA GAG AGA GAG AGA GYA 837 TAT ATA TAT ATA TAT ART 838 TAT ATA TAT ATA TAT ARC 839 TAT ATA TAT ATA TAT ARG 840 GAG AGA GAG AGA GAG AYT 841 GAG AGA GAG AGA GAG AYC 842 GAG AGA GAG AGA GAG AYG

线虫鉴定通用引物

The primer pairs used were D2A (5’-acaagtaccgtgagggaaagttg-3’) and D2B (5’-aatccgtgtttcaagacggg-3’), D3A (5’-gacccgtcttgaaacacgga-3’) and D3B (5’-tcggaaggaaccagctacta- 3’) (Nunn, 1992), and mtA (5’-ggcggatcctacatcgatgttgtat-3’) and mtB (5’-ggcggatccwkttcctctcgtact-3’). These primers selectively amplify metazoan ribosomal DNAs (rDNA) and do not amplify common contaminants such as bacteria, fungi, or plant material. Courtright EM, Wall DH, Virginia RA, et al. Nuclear and mitochondrial DNA sequence diversity in the Antarctic nematode Scottnema lindsayae. Journal of Nematology, 2000, 32(2): 143. DNA extraction and polymerase chain reaction (PCR) assays were performed according to Subbotin et al. (2000). The ITS1-5.8S-ITS2 and the D2-D3 of 28S of rDNA were amplified using the following primer sets: 5367 (5’-ttgattacgtccctgcccttt-3’) and F195 (5’-tcctccgctaaatgatatg-3’); and D2A (5’-acaagtaccgtgagggaaagttg-3’) and D3B (5’-tcggaaggaaccagctacta-3’) as described by Schmitz et al. (1998) and De Ley et al. (1999), respectively. Castillo P, Vovlas N, Subbotin S, et al. A new root-knot nematode, Meloidogyne baetica n. sp.(Nematoda: Heteroderidae), parasitizing wild olive in Southern Spain. Phytopathology, 2003, 93(9): 1093-1102. D3A(5’-gacccgtcttgaaacacgga-3’) and D3B (5’-tcggaaggaaccagctacta-3’). Al-Banna L, Ploeg A T, Williamson V M, et al. Discrimination of six Pratylenchus species using PCR and species-specific primers. Journal of nematology, 2004, 36(2): 142. The nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS1) segment was amplified with the primers rDNA2 5’-ttgattacgtccctgcccttt-3’ (Vrain et al. 1992) and rDNA1.58S5’-acgagccgagtgatccaccg-3’ (Cherry et al. 1997). The ribosomal LSU D2-D3 expansion segment was amplified with primers D2A 5’-acaagtaccgtgagggaaagttg-3’ and D3B5’-tcggaaggaaccagctacta-3’ (Courtright et al.,2000) as previously described (Al-Banna et al., 1997). Skantar AM, Carta LK. Multiple displacement amplification (MDA) of total genomic DNA from Meloidogyne spp. and comparison to crude DNA extracts in PCR of ITS1, 28S D2-D3 rDNA and Hsp90. Nematology, 2005, 7(2): 285-294. Several nematode specimens of each sample were transferred to an Eppendorf tube containing 16 ul ddH2O, 2 ul 10X PCR buffer and 2 ul proteinase K (600 ug/ml) (Promega, Benelux, The Netherlands) and crushed for 2 min with a Vibro Mixer microhomogeniser (Zürich, Switzerland). The tubes were incubated at 65oC (1 h) and then at 95?C (15 min). Detailed protocols for PCR, cloning and automated sequencing are described by Tanha Maafi et al. (2003). The forward D2A (5’-acaagtaccgtgagggaaagttg-3’) and reverse D3B (5’-tcggaaggaaccagctacta-3’) primers were used for amplification and sequencing of the fragment of the 28S rRNA gene. Subbotin SA, Vovlas N, Crozzoli R, et al. Phylogeny of Criconematina Siddiqi, 1980 (Nematoda: Tylenchida) based on morphology and D2-D3 expansion segments of the 28S-rRNA gene sequences with application of a secondary structure model. Nematology, 2005, 7(6): 927-944. The different regions of rDNA were amplified as described by Castillo et al.(2003) and Tigano et al. (2005) using the following primer sets:MelF (5’-tacggactgagataatggt-3’) and MelR (5’-ggttcaagccactgcga-3’) for the 18S, 5367 (5’-ttgattacgtccctgcccttt-3’) and F195

常用的通用引物序列

常用之Universal Primer 序列 Primer Primer sequence Applicable vectors T7 TAATACGACTCACTATAGGG pGEM-T, pGEM-T-Easy, pCRII, pET, pBlueScript, pcDNA3.1, pT7Blue SP6 TATTTAGGTGACACTATAG pGEM-T, pGEM-T-Easy, pCRII T3 ATTAACCCTCACTAAAGGGA pBlueScript pUC/M13 Forward (-40) GTTTTCCCAGTCACGAC pUC, pGEM-T, pCRII, pBlueScript pUC/M13 Forward (-21) TGTAAAACGACGGCCAGT pUC, pCRII, pBlueScript pUC/M13 Reverse TCACACAGGAAACAGCTATGAC pUC, pGEM-T, pCRII, pBlueScript T7 Terminator GCTAGTTATTGCTCAGCGG pET pGEX 5’GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG pGEX pGEX 3’CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG pGEX pQEF GGCGTATCACGAGGCCCTTTCG pQE pQER CATTACTGGATCTATCAACAGG pQE polyhedrin F AAATGATAACCATCTCGCAA Stag GAACGCCAGCACATGGACAGC pET-4x BGH reverse TAGAAGGCACAGTCGAGG pcDNA3.1, pTracer-CMV 5’ AOX GACTGGTTCCAATTGACAAGC pPlCZα α-factor TATTGCCAGCATTGCTGC pPlCZα 3’ AOX GCAAATGGCATTCTGACATCC pPlCZα

关于鉴定抗根结线虫研究方法的综述

关于鉴定抗根结线虫研究方法的综述摘要：根结线虫是世界上对植物破坏最大的病原体之一，鉴定和筛选抗根结线虫的植株具有重要意义。本文概述接种源的获取方法及其对接种线虫的影响和鉴定方式，鉴定方式包括一般接种、高持续接种和组织培养基内接种。关键词：根结线虫;接种;组织培养 Review on the way of selecting plants to resisting root-knot nematodes Qiao Feng, Wang Jingmin, Li Jinghua Abstract: Root-knot nematodes (RKN) were one of the pathogens damaged to plants mostly in the world. It was important to select the plants resisting RKN. The article mainly talked about the ways of getting RKN and how to the ways effected the inoculation, how to selecting the resistance plants, including the general inoculation, the high and durable inoculation, the inoculation in the plant medium. Keywords: root-knot nematodes; inoculation; tissue culture 根结线虫（Meloidogyne spp.）能够侵染热带和温带植物的根系，是世界上对植物破坏最大的病原体之一[1]。目前，药剂防治效果都不是很理想，而且一些高毒有效的杀线剂已被禁止使用。生产中可以通过栽培持续高抗的品种，以达到防治RKN的目的。因此，需要一种简便、快速的抗性品种的鉴定筛选方法，尤其是木本植物。本文介绍接种源的获取方式及其对抗性筛选的影响和最常用的鉴定方式，如一般接种、高持续接种、扦插和组培获得幼苗后接种、组织培养基内接种，以及适用于木本植物的发根农杆菌介导的组织培养接种，并指出抗线虫植株鉴定筛选的趋势是向快速、简便的分子标记方向发展。 1 接种源的获取方法及其对接种RKN的影响一般RKN的接种源分为卵块、卵、二龄幼虫（Second-stage juveniles，J2)，由于卵块的收集需要一定长的时间，而且每个卵块中卵的数量不一致，不能够形成一定的接种标准，其次，接种时，由于是卵块，不能够较均匀的分散在植物根系的周围，最后，其他病原体和根腐病菌可通过卵块侵染植物，引起病害。J2从获得到接种的时间必须要短，以防止J2死亡，侵染能力下降，另外还要保证J2比较适宜的生活条件，防止J2死亡或侵染率下降。相对而言，卵的获得较方便快速，可以通过NaClO溶液冲洗的方法[2]获得，同时，卵的表面被消毒，不会携带任何病原体，接种时，可以制定一定浓度的悬浮液，做到接种量上的统一，并且可以均匀的侵染植物根系。接种源不同的获取方法对RKN的侵染都有一定的影响。根据Hussey 1973的报道，用离心[3]或机械粉碎获得卵的方法对其孵化和侵染都有一定的破坏作用，如卵的孵化率降低和卵的数量减少，在潮湿环境中，孵化的RKN侵染率更低。用1.05% NaClO溶液冲洗[2]获得卵的方法对其孵化和侵染影响都比较小，表明用1.05% NaClO溶液冲洗收集到的卵作为接种源最为合适。

SrRNA扩增常用引物

Normally, we used following primers to amplify bacterial 16S rRNA genes (27F and 1492R pair) and sequencing them (using other primers). The primer sequencs are all listed in the reference:? Lane DJ (1991) 16S/23S rRNA sequencing. In: Stackebrandt E, Goodfellow M (eds) Nucleic acid techniques in bacterial systematics. Wiley, Chichester, pp 115-175 27F 5' AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3' PCR and sequencing, most eubacteria 357F 5' CTC CTA CGG GAG GCA GCA G 3' Most eubacteria 530F 5' GTG CCA GCM GCC GCG G 3' Most eubacteria and archaebacteria 926F 5' AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG 3' Most eubacteria and archaebacteria 1114F 5' GCA ACG AGC GCA ACC C 3' Most eubacteria 342R 5' CTG CTG CSY CCC GTA G 3' Most eubacteria 519R 5' GWA TTA CCG CGG CKG CTG 3' Most eubacteria and archaebacteria 907R 5' CCG TCA ATT CMT TTR AGT TT 3' Most eubacteria and archaebacteria 1100R 5' GGG TTG CGC TCG TTG 3' Most eubacteria 1492R 5' TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T 3' PCR and sequencing, most eubacteria 1525R 5' AAG GAG GTG WTC CAR CC 3' PCR and sequencing, most eubacteria M=C:A, Y=C:T. K=G:T, R=A:G, S=G:C. W=A:T; all 1:1 Any primer's reverse complement sequence is its revers prime. For example: 519R 5' GWA TTA CCG CGG CKG CTG 3' then 519F 3' CWT AAT GGC GCC GKC GAC 5'

RT-PCR常用引物序列

RT-PCR常用引物序列 RT-PCR引物序列基因来源引物序列产物大小（kb） β-actin 人有意义链CCTCG CCTTT GCCGA TCC 反义链GGA TC TTCAT GAGGT AGTCA GTC 0.62 kb β-actin* 大鼠有意义链TACAA CCTCC TTGCA GCTCC 反义链GGA TC TTCA T GAGGT AGTCA GTC 0.62kb β-actin 小鼠有意义链GTCGT ACCAC AGGCA TTGTG A TGG反义链GCAAT GCCTG GGTAC ATGGT GG 0.49 kb GAPDH 人有意义链GGTGA AGGTC GGAGT CAACG反义链CAAAG TTGTC ATGGA TGHACC 0.50kb GAPDH 大鼠有意义链GATGC TGGTG CTGAG TATGR CG反义链GTGGT GCAGG ATGCA TTGCT CTGA 0.20 kb Dynein 小鼠有意义链GCGGG CGCTG GAGGA GAA反义链GGA TC TTCA T GAGGT AGTCA GTC 12.3 kb Polymerase ε 人有意义链CGCCA AATTT CTCCC CTGAAA反义链CCGTA GTGCT GGGCA ATGTT C 6.8 kb Polymerase ε 人有意义链AAGGC TGGCG GATTA CTGCC反义链GA TGC TGCTG GTGAT GTACT C 3.5 kb Tuberous Sclerosis 人有意义链GGAGT TTATC ATCAC CGCGG AAATA CTGAG AG反义链TATTT CACTG ACAGG CAATA CCGTC CAAGG 5.3 kb 18S rRNA 大豆有意义链CTTTC GATGG TAGGA TAGTG GCCT反义链CAATG A TCCT TCCGC AGGTT CACCT AC 1.5 kb *引物不会扩增假基因 PCR引物序列基因来源引物序列产物大小（kb） HIV gag region 病毒SK 38ATTAAT CACTA TCCAG TAGGA GAAAT SK 39TTTGG TCCTG TCTTA TGTCC AGAAT GC 0.11kb β-globin 人(29923)GGTGT TCCCT TGATG TAGCA CA (34016)CCAGG ATTTT TGATG GGACA CG 4.1kb β-globin 人(31194)GCTGC TCTGT GCATC CGAGT GG (34016)CCAGG ATTTT TGATG GGACA CG 2.8kb

土壤线虫提取、分离与鉴定

2.1.5 土壤线虫提取、分离与鉴定 ⑴线虫的淘洗过筛称取鲜土100 g，用淘洗—过筛—蔗糖梯度密度离心方法分离线虫（Liang et al., 2002）。将称好的土倒入水盆中，加水搅匀，静置1 min。将水倒入一组网筛，即上层为60目，下层为400目，边倒边震荡分样筛，防止水充满下层的400目筛而从筛中溢出。然后，再在盆中加入水后混匀，静置1 min，倒入网筛中，如此重复三次。将400目的分样筛取下，用喷头把400目网筛中的线虫悬液中的泥浆冲洗干净，倒入烧杯中，静置。 ⑵蔗糖梯度离心将静置烧杯中的上层水轻轻倒掉，只保留下层大约30 ml水、线虫和泥浆的混合物。将混合物轻轻摇匀，倒入离心管中，在天平上调平衡，把平衡后的离心管放入离心机中，第一次离心（离心机的转速2000 r·min-1，离心时间为4 min）。倒掉第一次离心后的离心管内的上层液，保留土层。在离心管中分别注入比重为1.18 g·ml-1的蔗糖溶液约10 ml，在天平上调平衡后，摇匀，放入离心机中进行第二次离心。离心后，迅速取出离心管，把离心管内的上层液倒入500目筛中，用水把蔗糖液冲掉，以防线虫在蔗糖液中脱水变形。然后把线虫液冲入烧杯中，随后再转入试管中。将其静置24 h以上，以使线虫沉淀，并进行饥饿处理，以得到虫体各器官清楚的线虫标本。 ⑶线虫的杀死和固定线虫的杀死采用温和热杀死法（Gentle Heating）。先将水浴锅温度设定为60℃；把静置6 h以上的试管中的上层水小心抽出，只保留大约2～3 ml，线虫集中于试管底部的水中。操作时要避免使试管出现大的晃动，以免线虫被重新搅起。将抽完水后的试管放入水浴锅中，加热3 min杀死线虫，取出，稍静置冷却，加入等量的2倍TAF固定液，摇匀，倒入青霉素小瓶中，写好标签和序号，放入标本盒中（刘维治, 2000；张万民, 2002）。 ⑷线虫的科属鉴定在解剖镜下观察计数，然后依据测得的土壤水分将土壤线虫种群折算成100 g干土中含有的线虫条数。

引物设计原则(最全汇总)

引物设计原则（汇总）普通引物设计（适用于从载体上扩增模板）： 1. 普通引物长度一般在20-30bp之间，常用24-28bp左右以保证基因特异性； 2. 下载基因序列到Vector NTI； 3. 找到所需安装载体序列； 4. 将基因序列的CDS高亮标记； 5. 寻找载体序列中常用酶切位点，一般为EcoRI、BamHI、HindIII、XhoI等等，比对检测基因序列中是否有这些位点，有的话舍弃，最后选择两个酶切位点，最好离得远一点，并且最好buffer用一样的。酶切位点一般是6bp的回文序列； 6. 从基因ATG开始往后选择10-20bp均可（我的习惯是27bp-6bp酶切位点-2bp保护碱基-xbp 补齐序列），但最好保证最后两个是G或者C，以减少错配率； 7. 将上游酶切位点序列补在A TG前方，并根据载体对框情况补足两者之间的空缺，再根据序列的GC含量和TM值在酶切位点前补足保护碱基，以保证GC和AT的含量不能过高。注意，所有的补齐不能用到终止密码子； 8. 检测上游序列的结构情况，理论上不要太多二级结构以及3’端匹配即可；不过重复的序列也不能太多，以免移码； 9. 从下游终止密码子开始向前选择10-20bp均可，但最好保证最后两个是G或者C，以减少错配率； 10. 选择complementary sequence，在N端补齐下游酶切位点，如果tag在C端（即下游），则在第9点中应该从终止密码子前开始选择（即舍弃终止密码子），并且下游引物也要对框，如果tag在N端，则下游引物不需要对框，只要在N端加上下游酶切位点，再根据情况加上2个保护碱基，然后检测二级结构，原则上3’端部匹配即可。不过重复的序列也不能太多，以免移码； 11. 将设计好的上下游引物放在一起检测二级结构，原则上3’端部匹配即可。不过重复的序列也不能太多，以免移码； 12. 最后在NCBI的primer Blast网站上比对引物序列，看是否基因特异性的。 2011年10月18日左洁 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。