一种用于PCR模板制备的电泳产物简易回收方法

一种用于PCR模板制备的电泳产物简易回收方法①

王洪敏1,马文丽1,黄　海1,郑文岭2

(1.第一军医大学分子生物学研究所,中国广东广州　510515;

2.广州军区广州总医院肿瘤分子生物学研究所,中国广东广州　510010)

摘　要:为了探索一种简便、有效而且能从琼脂糖凝胶中大量回收用于第2次PCR扩增的DNA电泳条带的方法,采用刀片切胶法和牙签插胶法从琼脂糖中回收DNA,并进行了两种方法的比较.结果显示牙签插胶法回收的DNA用作第2次PCR的模板,获得了清晰、稳定的PCR产物电泳条带,用该法成功地制备了一批DNA 微阵列探针.由此可见牙签插胶法是一种简便、快速、有效的用于PCR模板的DNA琼脂糖凝胶回收法.

关键词:DNA回收;聚合酶链反应;DNA微阵列;探针制备

中图分类号:Q7;R373.9 文献标识码:A文章编号:100727847(2003)0420365204

A Simple W ay of Agarose G el DNA Fragments R ecovery

for PCR Amplification

WANG H ong2min1,MA Wen2li1,HUANG Hai1,ZHENG Wen2ling1

(1.Institute o f Molecular Biology,Fir st Uniform Medical Univer sity,Guangzhou510515,Guangdong,China;

2.Institute o f Molecular Oncology,Liu Hua Qiao Hospital,Guangzhou510010,Guangdong,China)

Abstract:T o study a sim ple,effective method for DNA recovering for subsequent secondary PCR am plification from agarose gel in large scale.T w o methods were tested and com pared.The first approach is to cut the DNA band with a lancet from the agarose gel after electrophoresis;the second one is to insert briefly the w ooden toothpick tip inside the DNA bands.The DNA were eluted and used as PCR tem plate for the secondary PCR re2am plification.E lec2 trophoresis showed clear and consistent bands after PCR re2am plification of the DNA recovered from the agars ose gel by both method,but the toothpick insertion method is much easier and quicker;a number of DNA microarray probes were success fully prepared using this method.It could be concluded that the method of toothpick insertion is an effi2 cient method for secondary PCR tem plate preparation.

K ey w ords:DNA recovery;PCR;DNA microarrray;probe preparation

(Life Science Research,2003,7(4):365～368)

DNA微阵列,亦称基因芯片,是最近几年刚兴起的一个高新生命科学技术[1].为了制备集成度高,信息含量丰富的DNA芯片,必须制备大量的DNA或cDNA探针片段[2].PCR作为一个简便易行的体外DNA扩增技术,用于制备芯片探针,是一个非常有效的手段[3].在利用PCR法制备

第7卷　第4期2003年12月

生命科学研究

Life Science Research

V ol.7　N o.4

Dec.2003

①收稿日期:2003208226;修回日期:2003211201

基金项目:国家自然科学基金资助项目(39880032);广州市重点科技攻关项目(992Z2022201)

作者简介:王洪敏(19672),男,四川剑阁人,主管药师,第一军医大学在读博士研究生,主要从事基因诊断和基因芯片的研究,T el:+ 862020261640114289098,E2mail:whm in@https://www.360docs.net/doc/bd3347162.html,;马文丽(19642),女,江西南昌人,第一军医大学教授,博士研究生导师,通讯作者,主要从事基因芯片研究,T el:+862020261648210;E2mail:wenli@https://www.360docs.net/doc/bd3347162.html,

DNA微阵列探针的过程中,我们摸索出了一种简易的PCR电泳产物回收法.

1　材料与方法

1.1　引物设计与合成

利用Olig o 6.40在pMD182T载体(T aK aRa Biotech,大连宝生物工程有限公司)的A2T克隆位点两侧,设计两对引物,Fs/Fa和Ss/Sa(表1). PCR引物由上海博亚生物技术有限公司合成. 1.2　酶切反应

λDNA(Bacteriophageλc I857Sam7),48502bp,用Sau3AI(T aK aRa)进行酶切,在200μL反应管内加入10×H Bu ffer2μL,λDNA1μg,Sau3AI(10U/μL)10U,补加超纯水至总体积为20μL.旋摇混匀后,在37℃水浴3h;然后于70℃温育15min,终止反应.

1.3　补平加A反应

在上述20μL酶切反应产物中加入20μL的2×premix(其中含T aq酶0.08U/μL,dNTP各0.4 mm ol/L,4mm ol/L MgCl2,2×PCR bu ffer).72℃反应30min;在反应管内加入3m ol/L NaAc(pH5.2) 4μL,预冷的乙醇100μL;充分旋摇后,14000r/ min离心15min;去上清后,真空干燥.

1.4　连接反应

在上述干燥的补平加A反应管内,加入pMD182T载体1μL,连接反应液5μL,加入超纯水4μL至终体积为10μL,混匀后16℃反应过夜. 1.5　转化及挑克隆

10μL连接反应产物全量转化至100μL X L21大肠杆菌感受态细胞中;然后将转化菌涂在含有X2G al,IPTG和氨苄青霉素的L2琼脂平板培养基上,37℃培养14h后,形成单菌落;挑选白色菌落,用PCR法进行鉴定和探针制备.

1.6　第一次PCR

从培养的转化菌平板上挑取单个白色的克隆1号、2号、3号和4号,用于切胶回收实验;挑取5号、6号、7号和8号白色克隆,用于牙签插胶实验;将挑选的每一个克隆分别接种至一个含有800μL LB的EP管中;37℃摇菌过夜后,从中吸取400μL菌液,用于保种;剩余400μL菌液,10 000g离心5min,收集细菌沉淀,用100μL灭菌超纯水混悬,煮沸10min;12000r/min离心5min,取上清液用于PCR.反应条件:20μL PCR反应体系中,加入2×premix10μL;10μm ol/L的引物Fs

和引物Fa各1μL,待扩增模板(离心上清液)2μL,加入超纯水6μL至终体积20μL.温度程序为:先94℃预变性3min;然后进行三温度循环: 96℃变性20s;55℃退火30s;72℃延伸10s.反应循环30次;最后72℃延伸3min后停止反应. 1.7　电泳及照相

从20μL PCR产物中取样4μL,用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳,DNA分子量Marker D L2000 (T aK aRa),70V电泳30min,溴化乙锭染色,紫外凝胶成像分析仪拍照.

1.8　DNA片断的回收试验

在长波紫外灯照射下,分别用下列两种方法转移琼脂糖电泳条带中的DNA片段:

1)刀片切胶法

用消毒过的11号手术刀片,沿着电泳条带的边沿,完整地切下整个清晰分离的DNA片段的电泳条带,转入一个对映编号的500μL EP管;所有电泳带切胶完毕后,每管加入100μL超纯水,置于4℃浸泡2h以上,12000r/min离心10min.取上清液2μL作为第2次PCR反应的模板.

2)牙签插胶法

木质牙签,剪切成长度为1cm的小段,高压灭菌后,80℃烤干.取一个牙签,用其较平整的一端插入电泳条带的中央,停留约2s后取出,转入一个对映编号的500μL EP管;每个电泳带用一个牙签.所有电泳带插胶完毕后,每管加入100μL 超纯水,浸泡30min,12000r/min离心5min.取上清液作为第2次PCR反应的模板.

1.9　第二次PCR制备探针

反应条件:100μL PCR反应体系中,加入2×premix50μL;10μm ol/L的引物Ss和引物Sa各4μL,待扩增模板2μL,加入超纯水40μL至终体积100μL.温度程序同1.6,电泳及照相同1.7.

1.10　牙签回收法制备DNA微阵列探针

分别挑取转化大肠杆菌X L21的pMD18质粒阳性克隆223、224、225、226、227、242、243、244、245、246、247、249、252、267、269、270、273、274、275、276、277、282、284和286号至装有800μL LB(含100U/m L氨苄青霉素)液的1.5m L EP管中,一个克隆接种至一个EP管.摇菌,保种和第1次PCR 鉴定同1.6,电泳及照相同1.7.采用牙签插胶法回收第1次PCR后的电泳产物.利用电泳后回收的第1次PCR产物作为模板进行第2次PCR的方法同1.9.

663 生　命　科　学　研　究 2003年

2　结果

2.1　利用Oligo 6.40设计的引物

表1　两次PCR 制备探针所设计的引物

T able 1　The 2p airs of primers designed for probes prep aration by the double PCR

引物序列

所在位置(与A 2T 克隆位点的距离)

1st -PCR Fs :5′>ACG AATT CG AG CT CGG T ACC 18bp Fa :5′>AG TG CC AAG CTTG C ATG CCT 13bp 2nd -PCR

Ss :5′>CCGGGG AT CCT CT AG AG ATT 0bp Sa :5′>ATG CCTG C AGG T CG ACG ATT

0bp

为了制备高纯度的DNA 微阵列探针,需要将连接在pMD182T 载体上的探针片段进行两轮的PCR 扩增,因此在pMD182T 载体的Eco R V 酶切位点两侧40bp 至10bp 范围内设计一对外侧引

物,用于第1

次PCR 扩增;在该载体的Eco R V 酶

切位点处设计了第2对PCR 扩增引物.Fs ,Fa ,

Ss ,Sa 这4条引物均长20bp ,T m 都是62℃,[2(A +T )+4(G+C )method ];G C 含量均为55%.2.2　两种回收法在回收前后的PCR 产物电泳图(见图1、图2)

图1　第1次PCR 产物电泳图

Fig.1　E lectrophoresis of the 1st PCR products

图2　回收产物进行第2次PCR 的产物电泳图

Fig.2　E lectrophoresis of the 2nd PCR products after DNA recovery from agarose gel

注:1,2,3,4与1′,2′,3′,4′:刀片切胶实验;5,6,7,8与5′,6′,7′,8′:牙签插胶实验

N otes :1,2,3,4and 1′,2′,3′,4′:DNA recovery by lancet cut of the DNA bands in the agarose gel ;5,6,7,8and 5′,6′,7′,8′:DNA recovery by w ooden toothpick insertion of the DNA bands in the gel

由于外侧引物比内侧引物扩增的片段长31bp ,因此,在图2中的电泳条带与图1中的电泳条带相比,位置相对靠下.牙签法回收的DNA 用于第2次PCR 扩增的模板,能使第2次PCR 扩增产物大量,稳定地产生,而且通过电泳可见,产物很纯.

利用该回收法制备的芯片探针电泳图(见图3、图4)挑选的白斑克隆223、224、225、226、227、242、243、244、245、246、247、249、252、267、269、270、273、274、275、276、277、282、284和286号,经过外侧引

7

63第4期 王洪敏等:一种用于PCR 模板制备的电泳产物简易回收方法

图3　第1次PCR 进行克隆鉴定

Fig.3　Clones identification by 1st

PCR

图4　第2次PCR 探针制备

Fig.4　Probes prep aration by 2nd PCR

物Fs/Fa 的第1次PCR 扩增鉴定,都有目标DNA

片段的存在.片段大小基本都分布在200～1000bp 之间.经过牙签插胶法回收的目标条带,用内侧引物Ss/Sa 进行第2次PCR 扩增后,目标DNA 片段更纯,90%以上的第2次PCR 产物的产量能满足探针制备的要求.

3　讨论

DNA 微阵列(亦称基因芯片)的优势和特点

之一就是其大规模集成的探针.研究和开发大规模探针制备的方法,才能使DNA 微阵列的研究和制造降低成本,以利于大规模生产和普及使用.PCR 扩增是微阵列用探针制备的一个非常有效的方法.在本研究中,使用挑克隆细菌煮沸的裂解液作为第1次PCR 的模板来源,其内容混杂,因此有必要通过电泳纯化第1次PCR 产物,然后进行第2次PCR ,进一步纯化目标DNA 片段[4].

如何简便、有效、大量地从琼脂糖凝胶中回收第1次PCR 产物的目的DNA 条带,是本研究的目标.传统的琼脂糖凝胶电泳分离和纯化DNA 的方法有多种,如透吸袋电洗脱法,低熔点琼脂糖切胶法,DE AE —纤维素膜电泳法等[5].这些方法需要多种试剂,多个环节,操作繁杂费时且容易造成交叉污染,因此,不适用于大规模探针制备中的DNA 凝胶回收.在本研究中,我们首先尝试了切下电泳条带所在的琼脂糖凝胶块,浸泡后,直接作为第2次PCR 反应的模板,发现该法非常不稳

定,有的条带回收很好,但有的条带回收后进行第2次PCR 后,电泳后看不到产物的电泳带;另一方面,该法操作繁杂费时,不能避免交叉污染.我们开发了一个全新的牙签插胶法,能简便、快速地回收到琼脂糖凝胶中的DNA.经过多次重复实验,均得到稳定可靠结果.值得注意的是,牙签的材料是影响DNA 回收效果的一个重要因素.我们在实验中发现,木质牙签的效果显著优于竹质牙签.牙签法回收的DNA ,完全可以满足作为PCR 模板的最低含量和纯度要求.因此,凡用于PCR 扩增目的的DNA 凝胶回收,均可以使用该法.参考文献(R eferences):

[1]　S MITH L ,G REE NFIE LD A.DNA m icroarrays and development

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