β淀粉样前体蛋白裂解酶特异性小干扰RNA真核表达载体的构建和鉴定_百替生物
β淀粉样前体蛋白裂解酶特异性小干扰RNA真核表达载体的构建和鉴定
作者：董炜疆，胡海涛，冯改丰，杨广笑，王全颖
【关键词】干扰性小RNA
摘要：目的构建β淀粉样前体蛋白裂解酶(BACE)特异性小干扰RNA真核表达载体。方法用PCR 扩增BACE特异性小干扰RNA，转入带有增强型绿荧光蛋白(EGFP)和启动子U6的pUC19质粒，再将重组基因片段导入逆转录病毒真核表达载体pLXSN中，通过限制性酶切对该重组表达载体进行鉴定。结果成功构建了BACE真核表达载体pLXSN/EGFPU6siBACE。结论
pLXSN/EGFPU6siBACE载体的成功构建对进一步利用基因干扰技术治疗阿尔茨海默病的研究奠定了重要的基础。
关键词：干扰性小RNA；阿尔茨海默病；β淀粉样蛋白分泌酶
Construction and identification of eukaryotic expression
vector of small interfering RNA specific for BACE
Dong Weijiang, Hu Haitao, Feng Gaifeng, Yang Guangxiao, Wang Quanying
(1. Department of Anatomy and Histology & Embryology, Medical School of
Xian Jiaotong University, Xian 710061; 2. Xian Huaguang Biological
Engenier Ld Company, Xian 710065, China)
ABSTRACT：Objective To construct eukaryotic expres sion vector of siRNA specific for βsite APP cleaving enzyme(BACE). Methods The BACE targeting siRNA gene was amplified with PCR. The PCR product was inserted into the pUC19/EGFPU6 plasmid. Then the pUC19/EGFPU6siBACE was digested with restriction enzyme, and the retrieved EGFPU6siBACE fragment was subcloned into retrovirus shuttle plasmid pLXSN. Which was then named pLXSN/EGFPU6siBACE. Results The eukaryotic expression vector of small interfering RNA(siRNA) specific for βsite APP cleaving enzyme was successfully constructed. Conclusion Construction of the siRNA targeting βsite APP cleaving enzyme lays the important foundation for using siRNA to prevent the Alzheimers disease.
KEY WORDS: siRNA; the Alzheimers disease; βsite APP cleaving enzyme
阿尔茨海默病(Alzheimers disease, AD) 是严重的中枢神经系统疾病之一,患者由于神经细胞的大量死亡而逐渐出现记忆能力、语言能力和知觉能力全面下降,最终会因脑衰竭而死亡。老年斑(senile plaque, SP) 是阿尔茨海默病的主要病理特征之一。淀粉级联学说认为老年斑的核心成分β淀粉样肽(βamyloid peptide, Aβ)是AD发生的主要原因[1]。Aβ是淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP) 经β淀粉样前体蛋白裂解酶(βsite APP cleavin g enzyme, BACE)和γ分泌酶裂解产生的。目前减少Aβ产生的许多方法中，最便捷的就是直接抑制BACE来减少Aβ的生成。因此，抑制BACE成为设计治疗AD 药物的重要靶标，受到人们的广泛关注。
RNA干扰(RNA interference, RNAi)是生物界一种古老而且高度保守的现象，是基因转录后沉默作用(PTGS) 的重要机制之一。RNAi主要通过核酸酶将双链RNA(dsRNA)切割成21～25nt的干扰性
小RNA，即siRNA(small interfering RNA或short interfering RNA)，由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA分子而实现[2,3]。
本研究构建针对Aβ产生的关键限速酶BACE的特异性小干扰RNA真核表达载体。这一工作将为抑制BACE、减少或降低Aβ产量、消除对神经元的毒性作用打下基础，为进一步研究siRNA的作用、探索BACE对Aβ产生的影响、寻求预防和治疗阿尔茨海默病的有效措施奠定了重要的基础。
1材料与方法
1.1材料
重组pUC19/EGFPU6 质粒、大肠杆菌E.coli DH5α由华广生物工程公司提供。各种限制性内切酶、T4连接酶、T4 DNA聚合酶、Taq酶、DNA片段纯化试剂盒为Gibco公司产品。编码针对β分泌酶的siRNA的寡聚DNA 由北京三博远志生物技术有限公司合成。
1.2方法
1.2.1BACE特异性小干扰RNA的设计
从GenBank获取人BACE mRNA全序列(GenBank Accession#: NM012104)。根据RNA设计原则，寻找干扰RNA的靶序列：从起始密码后75个碱基开始寻找AA+N19+UU序列或AA+N19序列(N19为任意19个mRNA核苷酸序列)；计算序列中G+C含量占50%左右；该序列用Blast搜寻EST 基因库，确认所靶向的基因是唯一的，为BACE特异性，不抑制其他基因的表达，且该部位不存在碱基多态性。最后将序列5′ TGGACTGCAAGGA GTACAA3′确定为RNAi的靶序列。全长发夹结构DNA 序列的设计：向上述序列中加入loop区、反向互补序列、转录终止子,以便转录获得shRNA；两端加入SalⅠ、HindⅢ及XhoⅠ酶切位点及保护碱基，便于克隆的片段插入载体；最后得到BACE siRNA 的DNA全长序列如下：CGTCGACTGGACTGCAAGGAGTACAATTCAAGAGATTGTACTCCTTGCAGTCCATTTT TCTCGAGAAGCTTG引物序列为：正向引物：5′C GTCGACT GGACTGCAAGGSalⅠ酶切位点AGTACAATTCAAGAGATTGTAC互补序列3′负向引物：5′CAAGCTTHindⅢ酶切位点CTCGAGXho Ⅰ酶切位点AAAATGGACTGCAAGGAGTACAATCTC互补序列3′两个引物之间有10bp的互补区。SalⅠ、HindⅢ酶切位点便于实现PCR产物克隆于其他载体，XhoⅠ酶切位点便于产物的克隆以及插入小片段的重组阳性克隆的酶切鉴定。
1.2.2PCR扩增BACE siRNA的全长DNA序列
加入正、负链引物各2μL，dNTP(10mmol/L)2μL，10×PCR缓冲液10μL，TaqDNA聚合酶(10U/μL)1μL，去离子水83μL，反应总体积100μL，进行PCR反应。PCR反应条件：94℃预变性5min ，94℃变性60s，37℃退火60s，72℃延伸60s，共30个循环。72℃延伸5min。PCR 反应物琼脂糖凝胶电泳，试剂盒回收PCR 产物，与pGEMT Easy载体连接，转化E.coli DH5α感受态细菌，蓝白斑筛选，挑选单个菌落作内切酶分析，选出正确的克隆，序列测定采用双脱氧链末端中止法，以ABI 377 DNA 自动序列测定仪进行。测序正确的质粒记为pGEMT/siRNA。
1.2.3pUC19/EGFPU6siBACE重组质粒的构建
用SalⅠ、HindⅢ双酶切pGEMT/siRNA重组质粒及pUC19/EGFPU6质粒，透析袋凝胶电泳洗脱法分别回收目的片段BACEsiRNA和pUC19/EGFPU6载体片段，将BACEsiRNA片段连接入pUC19/EGFPU6载体。XhoⅠ酶切线性化的克隆为重组阳性克隆。获得的质粒记为
pUC19/EGFPU6siBACE(图1)。
pLXSN/EGFPU6siBACE重组质粒的构建用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切pUC19/EGFPU6siBACE以及pLXSN逆转录病毒载体，透析袋凝胶电泳法分别回收EGFPU6siBACE片段和pLXSN载体片段，将EGFPU6siBACE片段连接入pLXSN载体。EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切能够切下约1.2 kb片段的克隆为重组阳性克隆。获得逆转录病毒载体穿梭质粒pLXSN/EGFPU6siBACE(图2)。
β淀粉样前体蛋白裂解酶特异性小干扰RNA真核表达载体的构建和鉴定
2结果
2.1pGEMT/siRNA的酶切鉴定
重组质粒经XhoⅠ酶切可线性化，EcoRⅠ酶切可切下约90个bp的小片段，即说明PCR产物已连于pGEMT Easy载体(图3)。
2.2pUC19/EGFPU6siBACE重组质粒的酶切鉴定
EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切，BamHⅠ、SalⅠ双酶切，以及SalⅠ、XhoⅠ双酶切
pUC19/EGFPU6siBACE，分别获得大小约730bp、350bp、60bp的片段，与相应的EGFP片段、U6片段以及相应的siBACE片段大小一致，EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切pUC19/EGFPU6siBACE获得大小约
1.2kb的片段，即EGFPU6siBACE的总长度(图4)。
2.3 pLXSN/EGFPU6siBACE重组质粒的酶切鉴定
EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切pLXSN/EGFPU6siBACE，获得大小约1.2kb的片段，即EGFPU6siBACE 的总长度(图5)。
获得的pLXSN/EGFPU6siBACE载体中，病毒载体的5′LTR控制EGFP的表达，SV40早期启动子控制新霉素抗性基因的表达，U6启动子转录产生siRNA。
3讨论
1995 年，Guo 和Kemphues在试图利用反义和正义RNA 影响秀丽新小杆线虫体内的par21 基因表达时，意外发现二者同样地抑制了par21 基因的表达[4]。他们当时对这一现象大为不解。直到1998年，Fire 等证实了正义RNA 抑制基因表达，以及过去的反义RNA 对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA 中污染了微量双链RNA而引起。将体外转录得到的单链RNA 纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链RNA 却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。该小组将这一现象称为RNA 干扰(RNA interference, RNAi) [5]。RNAi 现象广泛地存在于植物、果蝇、拟南芥、斑马鱼、小鼠甚至锥虫等大多数真核生物中，具有广阔而重要的生物学意义。RNA 干扰是双链RNA分子在mRNA 水平关闭相应序列基因表达或使其沉默的过程[6-8]，其特
异性在于所挑选片段的特异性，因为凡是与之配对的相关基因均受其干扰。采用RNA 干扰技术研究基因的功能，所挑选的短链寡核苷酸片段必须是该基因所特有的，基因Blast 为我们提供挑选特异性片段的最佳平台。近年来，RNA 干扰技术广泛用于基因功能研究。
研究发现，阿尔茨海默病患者的神经细胞周围有大量的Aβ沉积。Aβ沉积对神经元有毒性并在AD的发病中起重要作用。由于Aβ在AD 的发病中起着至关重要的作用，因此减少Aβ的产生，加快其消除，阻止Aβ聚集和形成有毒性的淀粉样斑块，对抗Aβ的毒性和抑制其所引起的免疫炎症反应都可以成为AD 治疗的策略。因此无论是直接或间接的治疗方法，都瞄准Aβ。目前许多学者都看好作用于分泌酶的AD 治疗药物，因为它能从源头上减少Aβ的产生，从根本上阻止AD 的病程发展。要减少Aβ的产量，理论上有三条途径：①α分泌酶的激动剂，可以使APP 避免经过β途径，减少Aβ的产生；②BACE抑制剂；③γ分泌酶抑制剂。其中BACE抑制剂越来越受到人们的关注。为了证实抑制BACE不会对正常组织和细胞产生毒害作用，几个研究小组进行了BACE基因剔除实验[9]，研究表明这些基因缺失的小鼠(BACE-/-) 生长正常，对形态学、血液学以及动物行为等分析结果显示它们与正常小鼠(BACE+ /+) 无显著差异，但BACE-/-小鼠的脑和培养的神经细胞中BACE活性消失。用BACE-/-小鼠与Swedish APP过表达的转基因小鼠交配产生的第二代小鼠中也没有过量的Aβ。用表达APP 的腺病毒感染缺失BACE的胚胎神经细胞，通过质谱和凝胶电泳分析显示不产生Aβ。体外分析还发现，在BACE-/-小鼠的脑及培养的神经细胞抽提液中检测不到Aβ及BACE活性。这些实验证实了BACE是体内主要的β分泌酶，抑制BACE的活性在体内不会引起高毒性。BACE缺失小鼠的脑中不产生Aβ，证实了可以通过抑制BACE的活性来降低Aβ的水平，以达到治疗或减缓AD 症状的目的，为BACE作为AD治疗靶点的可行性提供了试验依据[10]。
虽然在哺乳动物细胞中用siRNA进行RNAi的实验技术已经基本成熟，并显示出很好的应用前景，但化学方法合成siRNA费用昂贵、容易降解、作用时间短暂的缺点使它难以普及，在某种程度上限制了RNAi技术在哺乳动物中的应用和发展。新近涌现出了各种siRNA的合成方法，使进行大规模RNAi 实验成为可能。其中通过构建载体导入细胞后转录产生siRNA的方法十分简便，费用较为低廉，抑制作用稳定，因而相继有质粒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体被构建。整体而言，病毒载体的转导效率高于质粒。相对于其他病毒载体，逆转录病毒具有容易包装获得、宿主细胞范围广、病毒载体本身的免疫原性小及高效感染分裂期细胞等特点。本实验通过计算机软件分析BACE的基因序列，按照siRNA设计的原则，设计出BACE靶向的siRNA，并通过基因工程技术构建了能同时表达BACE的特异性siRNA、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)以及Neor 的逆转录病毒载体。其中Neo 基因的表达可以应用G418筛选稳定转化的细胞克隆；EGFP的表达便于用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察病毒感染效率，或利用流式细胞仪分选表达EGFP的细胞群，并可作为细胞体内示踪的标记。因此具有很大的实用价值，为进一步试验提供了诸多方便。后期的试验可以将该真核表达载体包装成逆转录病毒，并制备高表达APP、BACE等基因、Aβ产量增高的阿尔茨海默病细胞模型。用BACE 的特异性siRNA感染模型细胞，构建的BACEsiRNA可对BACE基因在细胞内进行转录后抑制，切割靶基因成为无功能的小片段，达到抑制BACE基因的表达，减少BACE的产生的目的。我们观察感染前后对BACE活性的抑制作用，特别是对阿尔茨海默病的主要致病因素Aβ生成的重要影响，以及减少神经元死亡、降低Aβ毒性作用的效果。本研究室正在制备含APP 瑞典突变型基因(APPSW)的转基因小鼠。这为RNA干扰技术将来应用于哺乳动物奠定了实验基础，对进一步观察RNA干扰技术
在治疗阿尔茨海默病中的应用具有重要意义。RNA干扰技术对抑制靶向基因的表达，为寻找最适宜的治疗老年性痴呆的方法提供了新的思路。
参考文献：
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.30300395)
通讯作者：冯改丰，Tel: (029)82655178; Email: fenggaifeng@https://www.360docs.net/doc/b65686841.html,
作者简介：董炜疆(1975)，男(汉族)，讲师，博士研究生.
研究方向：老年性痴呆的预防和治疗. Tel: (029)88596754; Email:
dongwj@https://www.360docs.net/doc/b65686841.html,
(1. 西安交通大学医学院人体解剖学与组织胚胎学系，陕西西安710061；2. 西安华广生物工程公司，陕西西安710005)
(编辑卓选鹏)
RNA干扰的作用机制及小干扰RNA的合成方法
RNA干扰的作用机制及小干扰RNA的合成方法 RNA干扰（RNA interference，缩写为RNAi）是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默[1]。与其它基因沉默现象不同的是，在植物和线虫中，RNAi 具有传递性，可在细胞之间传播，此现象被称作系统性RNA干扰(systemic RNAi)[2,3]。在秀丽隐杆线虫上实验时还可使子一代产生基因突变，甚到于可用喂食细菌给线虫的方式让线虫得以产生RNA干扰现象。RNAi现象在生物中普遍存在。 1.RNAi的作用机制 目前关于基因沉默的假说认为，转录后水平的基因沉默，主要包括起始阶段、效应阶段和倍增阶段。 1.1起始阶段 外源性导入或由转基因、转座子、病毒感染等多种方式引入双链核糖核酸(dsRNA)，在细胞内特异性与RNA酶Ⅲ(RNAaseⅢ核酸内切酶) Dicer结合，dsRNA被切割成21~23nt 长度的带有3′端单链尾巴及磷酸化的5′端的短链dsRNA，即小干扰RNA(siRNA)。 1.2效应阶段 双链siRNA可以与含Argonauto（Ago）蛋白的核酶复合物结合形成RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）并被激活。在A TP供能情况下，激活的RISC 将siRNA的双链分开，RISC中核心组分核酸内切酶Ago负责催化siRNA其中一条链去寻找互补的mRNA链，然后对其进行切割。反义链先与同源mRNA配对结合，然后RISC在距离siRNA 3'端12个碱基的位置将mRNA切断降解，从而阻止靶基因表达，使基因沉默[1]。 1.3 倍增阶段 siRNA在RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)的作用下，以mRNA为模板，siRNA为引物，扩增产生足够数量的dsRNA作为底物提供给Dicer酶，产生更多的siRNA，可再次形成RISC，并继续降解mRNA，从而产生级联放大效应。并作用于靶mRNA。如此反复倍增，从而使RNAi的作用进一步放大。因此少量的siRNA就可以产生高效的基因沉默效果[4]。2.RNAi的设计及合成
RNA干扰设计
什么是siRNA和RNAi 双链RNA经酶切后会形成很多小片段，称为siRNA,这些小片段一旦与信使RNA(mRNA)中的同源序列互补结合，会导致mRNA失去功能，即不能翻译产生蛋白质，也就是使基因“沉默”了。 RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是由双链RNA引发的转录后基因静默机制，它通过生物体内siRNA介导识别，特定RNA水解酶参与，并靶向切割同源性靶mRNA。实现RNA干扰现象是真核生物中普遍存在的抵抗病毒等外来入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制。目前RNA干扰技术已成功用于基因功能和信号转导系统上下游分子相互关系的研究。随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，大量的论文被发表，成百上千的专利被授权或递交申请，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具以及新药开发的诱人前景，RNAi也越来越为人们所重视。 RNAi技术发展历程 1998：植物基因中基因沉默现象的发现 2000：哺乳动物细胞中基因沉默的实现 2001：被《科学》评为当年十大科技突破之一 2003：动物体内观察到RNA干扰作用 2004：在恒河猴上的SARS病毒研究取得进展 2004：Acuity Pharmaceutical 第一个RNA干扰药物申请IND 2004：siRNA Therapeutics 第一个RNA干扰药物申请IND 2005：第一个RNA干扰药物进入一期临床，取得良好的效果 2005：化学修饰的siRNA oligo 体内系统给药取得突破 2006：诺贝尔医学奖授予两美国RNAi技术专家 2007：美国卫生研究院（NIH）组建首个RNAi委员会，旨在为NIH 的科学主管给出有关如何尽可能改善他们对RNAi 技术的评估 截止2008年：已有七项核酸干扰药物项目在美国进入临床试验，其中，有一项药物已经推入到第III期临床试验 RNAi 2006诺贝尔医学奖述评 ——年轻的获奖者—— 2006年10月2日，现年47岁的Andrew Z. Fire和45岁的Craig C. Mello由于在RNAi(RNA interference，RNAi)及基因沉默现象研究领域的杰出贡献而今年诺贝尔医学奖获得者，且获奖日期距其研究发表仅8年时间，获奖速度之快亦令人叹为观止。颁奖委员会评价：“他们发现了控制基因信息流通的基本机制，解释了困惑这一研究者们许久的难题。”“像在清晨突然打开窗帘，然后一切都一目了然了”。 —— RNAi的殊荣—— 2001年，随着人类基因组测序的完成，针对其它多种生物的基因组测序计划也相继开展起来。在未来的一段时间内，科学界将不会出现比人类基因组测序更瞩目的技术。有人将人类基因组测序称为“21世纪科学发展史上的里程碑”、“生物学领域最重要的成就之一”。然而时隔不久，同一年在哺乳动物中发现的RNAI掀起了一场风暴，而且愈演愈烈。《Science》杂志将RNAi称为“2002年的重大突破”(Couzin，2002)。然而，更加令人吃惊和兴奋的是，4年以后的今天，Andrew Fire和Craig Mello就因此获得2006年诺贝尔医学奖。一项全新的技术在提出后短短几年就得到诺贝尔奖的青睐和肯定，此前是绝无仅有的，这也足见RNAi在医学领域的开创性意义和极大的应用前景。 —— RNAi的机制——
RNA干扰综述
RNAi研究及其进展 公光业M110107259 前言 RNAi是真核生物中普遍存在的一种自然现象，是由双链RNA 启动的序列特异的转录后基因沉默过程，是生物体在进化中形成的一种内在基因表达的调控机制。1998年，Andrew Fire等首次在线虫中发现RNAi现象，后来大量的研究表明，RNAi广泛存在于真菌、植物和动物中。由此人们认识到RNAi技术作为研究基因功能的一种有力的革命性工具，在功能基因组、转基因动物研究、基因治疗、药物开发等方面有着巨大的潜力。RNAi被《Science》杂志评为2010年十大科学成就之一，2002年又名列《Science》杂志十大科学成就之首，成为分子生物学研究的热点。本文综述了该研究的最新进展。正文 RNAi的发现： 上世纪90年代，科学家们在进行生物遗传改良的研究中，发现靶生物体内产生了一种非期望的表型。最早报道的是在1990年美国科学家Jorgensen等,他们在增强矮牵牛花紫色的转基因研究中，得到的结果是转基因植株部分或完全开白花，表明色素合成途径被关闭而不是被加强。他们将这一现象称为共抑制(cosuppresion)，后来的研究者称之为转录后基因沉默。此后不久，科学家们开展了真菌中的RNAi 的研究。1994年，意大利的Cogoni在野生型粗糙链抱霉(Neurospora crassa)的转基因研究中，把抑自身和相应内源基因表达的基因沉默现
象称为消除作用(quelling或基因压制)。 1995年，Guo等利用反义RNA技术阻断线虫的par-1基因表达，发现无论是给线虫注射正义RN A还是反义RN A，都可以抑制特异基因（par-1）的表达，结果与反义RNA技术的传统机制正好相反。这种出乎意料的发现引起了各国科学家的注意，从此展开了RNAi在动物体内的研究。1998年，Frei在研究秀丽隐杆线虫基因沉默时，首次揭开了Guo遇到的悬疑：Guo遇到的正义RNA抑制基因表达现象，是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起的，并且还发现双链RNA能够比反义RN A或正义RNA更有效地关闭基因的表达，抑制基因表达的效率比单链RNA至少高2个数量级，他们称这种现象为RNAi。从此，一个新的基因功能研究领域诞生了，人们已在不同种属的生物中进行了广泛而深人的研究，结果不仅证实R- NAi现象存在于秀丽小杆线虫、植物、真菌、果蝇、锥虫、涡虫、水媳、斑马鱼、小鼠乃至人类等多种生物中，而且对RNAi的分子机制逐渐有了比较清晰的认识，植物中的“共抑制”和真菌中的“压制”，与动物中双链RNA诱导的RNAi具有高度保守的相似机制。 RNAi作用机制: 病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA （大约21～23 bp），即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作
RNA干扰技术的原理及应用
RNA干扰技术的原理与应用 RNA干扰( RNAinterference , RNAi )是通过小干扰RNA ( small interference RNA, siRNA ) 造成目的mRNA特异性降解, 从而使基因转录后沉默的一种现象。这一现象广泛存在于自然界, 是生物体进化过程中抵御外来基因侵害的一种机制, 为稳定基因组发挥了重要作用。由于RNAi可以作为一种简单、有效的代替基因剔除的遗传工具,正在功能基因组学领域掀起一场真正的革命, 并将加快这个领域的研究步伐。 1 RNAi现象的发现及发展 1995年, Guo等用反义RNA阻断秀丽新小杆线虫的part 1基因的实验中发现, 正义和反义RNA都阻断了该基因的表达,这与传统上对反义RNA技术的解释相反。1998年2月卡耐基研究院的F i re 等将双链RNA ( double stranded RNA, ds RNA)转入细胞内,发现靶基因的mRNA发生了降解,证实高度纯化的ds RNA 可以高效特异的阻断相应的基因表达,而且效率比单链RNA至少高2个数量级,首次揭示了Guo等遇到的现象,即为RNAi。 随后研究发现, RNAi现象广泛存在于各种生物中,是一种古老的重要保护机制, RNAi技术作为一种重要的研究手段大大加速了基因组学的研究进程,现已成为基因功能研究和基因治疗研究的热点。 在短短几年中,对RNAi的研究取得了突飞猛进的发展, 许多令人振奋的报道相继出现, 2001年首次报道了在哺乳动物细胞培养中成功
应用RNAi技术抑制基因表达, 开创了RNAi技术应用于高等生物基因功能研究的先河; 2002年, K ay研究小组首次报道了应用RNAi 技术在哺乳动物整体水平进行基因表达沉默的实验研究;2004年哺乳动物全基因组范围RNAi研究也取得了重要进展,先后报道了用酶法构建全基因组siRNA文库新技术和应用基因组siRNA文库,从全基因组水平对高等动物基因功能进行高通量RNAi研究。这些研究成果愈来愈表明, 生物体基因转化的最终产物不仅仅是蛋白质,还包括相当一部分RNA。 2 RNAi的作用机制 细胞中ds RNA 的存在是RNAi形成的先决条件。ds RNA可以通过多种途径在细胞核或细胞质中产生。通过对RNAi所进行的遗传学和生物化学的研究,现已初步阐明了其作用机制。RNAi的作用机制可分为三个阶段:起始阶段、效应阶段和级联放大阶段。起始阶段:由RNA 病毒入侵,转座子转录,基因组中反向重复序列转录等所产生的ds RNA分子在细胞内被一双链RNA酶!型内切酶也叫Dicer酶或Dicer核酸酶同源物剪成21~ 23 nt siRNA, 3’ 端带有2个碱基突出的黏性末端, 5’ 为磷酸基团,此结构对于siRNA行使其功能非常关键。剪切位点一般在U处, 具特异性。效应阶段: RNAi特异性的核酸外切酶、核酸内切酶、解旋酶、辅助识别同源序列蛋白和其他一些蛋白与siRNA结合成RNA诱导沉默复合体R I SC ( RNA inducing silence complex , R I SC)识别靶mRNA,其中的反义
RNA干扰作用机制
RNA干扰机制主要分为两个阶段： 1：RNA干扰的启动阶段，即RNA核酸酶与双链RNA结合，并把它酶切成为多段大小为21~25个碱基对的小RNA片段（siRNA）。 2：RNA干扰的效应阶段，即siRNA与一种多聚核酸酶复合物，RNA诱导的沉默复合物（RISC）结合，并通过驾驭RISC到相应的mRNA位点，随即RISC执行RNA干扰的效应功能，酶切降解mRNA，使转录的基因表达终止。 第一步：双链RNA加工成为siRNA 参与该反应的酶是Dicer蛋白复合物，具有结合和酶切双链RNA的活性，与双链RNA结合的区域位于Dicer的羧基末端 第二步：siRNA的扩增 siRNA能通过细胞内的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）的作用，以RNA干扰起源的双链RNA分子，或者以目标mRNA分子作为模板，合成出新的双链RNA分子，再通过Dicer的加工作用，产生出大量的siRNA，补充细胞内消耗和降解的siRNA分子。这种现象称为siRNA的扩增。 第三步：降解目标mRNA 在这一阶段，从双链RNA切割下来的siRNA与一种RNA干扰的特异蛋白复合物结合，形成RNA诱导的基因沉默复合物（RISC）。该复合物在A TP存在的条件下被激活，siRNA解链，留下反义链导向RISC与目标RNA互补结合，并酶切目标RNA分子，完成RNA干扰的过程。酶切位置常常在siRNA双链的中间部位，故，若siRNA链中间的碱基与目标不符，则会影响siRNA的沉默效应。 siRNA与RISC复合形成一种小干扰核糖蛋白粒子（siRNP） RISC与Dicer的异同点 两者都具有RNA酶活性，但是它们的作用底物不同，前者常常针对单链RNA分子，而后者则是针对双链RNA分子；另一方面，它们的酶切方式和产物也不同，前者属于RNA 的外切酶，而后者则是RNA的内切酶 另外，一些RNA干扰效应阶段的mRNA降解物，反过来可以作为RdRP的模板，合成双链RNA分子，加入到RNA干扰的启动阶段，从而放大RNA干扰的作用。
百度百科RNA干扰
RNA干扰 科技名词定义 中文名称：RNA干扰 英文名称：RNA interference;RNAi 定义1：与靶基因同源的双链RNA诱导的特异转录后基因沉默现象。其作用机制是双链RNA 被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。已经发展成为基因治疗、基因结构功能研究的快速而有效的方法。 所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；核酸与基因（二级学科） 定义2：引起基因沉默的一种技术，将根据基因序列制备的双链RNA注入体内，可引起该基因编码的mRNA降解，从而抑制了该基因的功能。 所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科） 定义3：双链RNA有效地阻断靶基因表达的现象。 所属学科：遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 百科名片 RNA干扰模式图 RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA （double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。 目录
简介 发现 作用机制 特点 制备方法 应用 相关知识 简介 发现 作用机制 特点 制备方法 应用 相关知识 展开 编辑本段简介 近几年来RNAi研究取得了突破性进展，被《Science》杂志评为2001年的十大科学进展之一，并名列2002年十大科学进展之首。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。 编辑本段发现 RNAi是在研究秀丽新小杆线虫（C. elegans）反义RNA（antisense RNA）的过程 RNAi实验图片 中发现的，由dsRNA介导的同源RNA降解过程。1995年，Guo等发现注射正义RNA（sense RNA）和反义RNA均能 有效并特异性地抑制秀丽新小杆线虫par-1基因的表达，该结果不能使用反义RNA技术的理论做出合理解释。直到1998年，Fire等证实Guo等发现的正义RNA抑制同源基因表达的现象是由于体外转录制备的RNA中污染了微量dsRNA而引发，并将这一现象命名为RNAi。
RNA干扰
RNA干扰 RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由双链RNA(doublestrandedRNAs，dsRNAs)引发的植物RNA沉默，主要有转录水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录;PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致TGS和PTGS。 由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，（长度超过三十的dsRNA会引起干扰素毒性）所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。 RNAi是在研究秀丽新小杆线虫（C. elegans）反义RNA（antisense RNA）的过程 1.作用机制 病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应， 其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23 bp），即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA 结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi 的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。 RNAi发生于除原核生物以外的所有真核生物细胞内。需要说明的是，由于dsRNA抑制基因表达具有潜在高效性，任何导致正常机体dsRNA形成的情况都会引起不需要的相应基因沉寂。所以正常机体内各种基因有效表达有一套严密防止dsRNA形成的机制。 怀特黑德生物医学研究所的本杰明·刘易斯等研究人员发现小RNA能通过阻断蛋白质合成的方式调控基因表达。他们借助一个计算模型来确定小RNA和对应的基因，发现了miRNA控制很大一部分生命功能的证据。 研究人员比较了人类和狗、鸡、鼠的基因组，对这几个物种共有的蛋白质合成基因与miRNA寻求对应关系。结果发现，尽管这几个物种在3.1亿年前就开始“分家”各自进化，但它们基因组中受miRNA调控的基因都占三分之一左右，而且这些基因在进化过程中都得以保存而未发生变化。刘易斯说，随着更多的基因组数据发布以及实验技术的进步，还可能发现更多的基因是由小RNA调控的。 RNA干扰现象的机理[8] RNA干扰作用是通过一类较稳定的中间介质实现的。对植物的研究证明，双链RNA 复合体先降解成为35nt左右的小RNA分子，然后他们通过序列互补与mRNA结合，从而导致mRNA降解[9][10]。对果蝇的研究证明，长度为21～23nt的小RNA分
RNA干扰iRNA技术及其应用
RNA干扰iRNA技术及其应用 摘要：RNA干扰(interference RNA，iRNA)是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，它是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默。RNA具有特异性和有效性。iRNA技术作为功能基因组学强有力的研究工具，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变。随着对现代分子生物学研究的发展，该技术的应用领域逐步扩展到医学，农业，林业，渔业，畜牧等多个领域，具有巨大的科研，经济和社会价值，本文主要论述RNA干扰技术在医学领域方面的应用。 关键字：RNA干扰转录后基因沉默RNA 诱导的沉默复合物 正文：今年来，对RNA干扰技术的研究已经成为热点，预测未来10年间最后可能出重要成果的领域之一，并被《Science》评选为2002年度最重要科技突破的首位。RNA干扰技术之所以有如此重要的地位，与其运用到的领域有关。21世纪初，人类完成了基因组计划，破译人类全部的遗传信息，使人类第一次在分子水平上全面认识自我。因此，很多疾病的病因也将揭开神秘的面纱，这位这些疾病的基因诊断和基因治疗奠定了基础。因此，利用RNA干扰技术抑制基因组的基因表达的技术手段，有可能在基因治疗方面开辟一条心的途径，克服医学上许多疑难杂症，例如，病毒性疾病，肿瘤心血管疾病和遗传性疾病。 1.RNA干扰的发现:首次发现dsRNA能够导致基因沉默的线索来源于线虫Caenorhabditis elegans的研究。1995年，康乃尔大学的Su Guo博士在试图阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans)的par-1基因时，发现了一个意想不到的现象。她们本想利用反义RNA技术特异性地阻断上述基因的表达，而同时在对照实验中给线虫注射正义RNA以期观察到基因表达的增强，但得到的结果是二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上对反义RNA技术的解释正好相反。该研究小组一直未能给这个意外以合理解释。这个奇怪的现象直到3年后才被解开。1998年2月，华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire和马萨诸塞大学癌症中心的Craig Mello才首次揭开这个悬疑之谜。通过大量艰苦的工作，他们证实，Su Guo博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。当他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。实际上每个细胞只要很少几个分子的双链RNA已经足够完全阻断同源基因的表达。后来的实验表明在线虫中注入双链RNA不单可以阻断整个线虫的同源基因表达，还会导致其第一代子代的同源基因沉默，该小组将这一现象称为RNA干扰。现在RNA干扰现象广泛存在于从植物、真菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴一直到人类的几乎所有的真核生物中细胞，这种情况揭示了iRNA现象很可能出现于生命进化的早期阶段。后来在果蝇细胞中的实验进一步揭
RNA干扰实验技术相关探讨
文章编号： 06-（2004）063002101-10 中图分类号：Q344 中国生命科学论坛分子生物学版精华 RNA干扰(RNAi)实验技术相关探讨 马志杰 (maziwise) 编写小瘪修改 (中国生命科学论坛分子生物学版第1版主 ) [责任编辑：TILS007] 摘要：RNA干扰(RNAi)是一种由双链RNA所引起的序列特异性基因沉默。它是真核生物中基因转录后沉默作用的重要机制之一。RNAi技术作为新兴的基因阻抑方法，在功能基因组学、微生物学、基因表达调控机理研究等领域得到了广泛应用。本文就其作用机制、基本实验程序及注意事项作了较详细的综述，对其存在的相关问题和前景亦做了展望。 关键词：RNAi；siRNA；转染 小RNA作用与应用研究继2001，2002连续两年被美国Science杂志评为年度10大突破技术以来，近年来继续热度高涨，名列前矛。其核心技术RNA干扰（RNAi），即用20多个核苷酸组成的短的双链RNA（siRNA）代替传统反义核酸进行转录后基因沉默，已经迅速而广泛地应用到基因功能，基因表达调控机制研究等热门领域，不仅如此，它还为基因治疗开辟了新的途径。此外，RNAi沉默机制的探索也取得了相当的进展。目前，在大致勾画出生物体内源性小RNA的重要作用框架后，进一步阐述其作用细节、探索小RNA对细胞行为的调控、如何利用RNAi进行疾病防治等等都成为生物学家研究的一大热点。 1、RNAi的作用机制
通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA 片段(small interfering RNAs， siRNAs)。证据表明;一个称为Dicer的酶，是RNase III家族 中特 图1、RNAi的作用机制 异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex， RISC）。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。另外，还有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt长的片段，这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化，从而使启动子失去功能，使其下游基因沉默。其基本原理见（图1）： 2、RNAi基本试验程序及注意事项 2.1、siRNA的设计 2.1.1、目标序列的筛选