CCK8检测细胞增殖毒性的原理、方法及注意事项

CCK8检测细胞增殖毒性的原理、方法及注意事项
CCK8检测细胞增殖毒性的原理、方法及注意事项

CCK8检测细胞增殖/毒性的原理、方法及注意事项

一、CCK8检测细胞增殖/毒性的原理

Cell Counting Kit-8(简称CCK-8)试剂可用于简便而准确的细胞增殖

和毒性分析。其基本原理为:该试剂中含有WST-8【化学名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】,它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan dye)。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。

用途:药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验

CCK8的优点:

?使用方便,省去了洗涤细胞,不需要放射性同位素和有机溶剂;

?CCK-8法能快速检测;

?CCK-8法的检测灵敏度很高,甚至可以测定较低细胞密度;

?CCK-8法的重复性优于MTT 法;

?CCK-8法对细胞毒性小;

?CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液,毋需预制,即开即用。

CCK8的缺点:

?与MTT法相比,CCK8和XTT的价格比较贵。

?CCK8试剂的颜色为淡红色,与含酚红的培养基颜色接近,不注意的话容易产生漏加或多加。

与以往的增殖/毒性测定试剂相比较:

检测方法MTT法XTT法WST-1法CCK8法甲臢产物的水差(需加有机好好好

溶性溶剂溶解)

产品性状粉末2瓶溶液溶液1瓶溶液

使用方法配成溶液后

使用

现配现用即开即用即开即用检测灵敏度高很高很高高

检测时间较长较短较短最短

检测波长560-600nm420-480nm420-480nm430-490nm

细胞毒性高,细胞形态

完全消失很低,细胞形

态不变

很低,细胞形

态不变

很低,细胞形

态不变

试剂稳定性一般较差一般很好

批量样品检测可以非常适合非常适合非常适合便捷程度一般便捷便捷非常便捷

二、CCK8检测细胞增殖/毒性的方法

实验一:细胞增殖分析

1、制备细胞悬液:细胞计数

2、接种到96孔板中:根据合适的铺板细胞数,每孔约100ul细胞悬液,同样的样本可做3个重复。

3、37℃培养箱中培养:细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时,如果

不需要贴壁,这步可以省去。

4、加入10ul CCK8:由于每孔加入CCK8量比较少,有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差,建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或

者直接配置含10%CCK8的培养基,以换液的形式加入。

5、培养1-4小时:细胞种类不同,形成的Formazan的量也不一样。如

果显色不够的话,可以继续培养,以确认最佳条件。特别是血液细胞形

成的Formazan很少,需要较长的显色时间(5-6小时)。

6、测定450nm吸光度:建议采用双波长进行测定,检测波长450-490nm,参比波长600-650nm。

实验二:细胞毒性分析

1、制备细胞悬液:细胞计数

2、接种到96孔板中:根据合适的铺板细胞数,每孔约100ul细胞悬液,同样的样本可做3个重复。

3、37℃培养箱中培养:细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时,如果

不需要贴壁,这步可以省去。

4、加入不同浓度的毒性物质

5、37℃培养箱中培养:加入毒性物质的培养时间,要看毒性物质的性

质和细胞的敏感性,一般要根据细胞周期来决定,起码要一代以上的时间。

6、加入10ul CCK8:由于每孔加入CCK8量比较少,有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差,建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。

7、培养1-4小时:细胞种类不同,形成的Formazan的量也不一样。如

果显色不够的话,可以继续培养,以确认最佳条件。特别是血液细胞形

成的Formazan很少,需要较长的显色时间(5-6小时)。

8、测定450nm吸光度:建议采用双波长进行测定,检测波长450-490nm,参比波长600-650nm。

注:

?若暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。

24小时内测定,吸光度不会发生变化。

?如果待测物质有氧化性或还原性的话,可在加CCK8之前更换新鲜培养基(除去培养基,并用培养基洗涤细胞两次,然后加入新

的培养基),去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下,可

以不更换培养基,直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

三、CCK8检测细胞增殖/毒性的注意事项

?当使用标准96孔板时,贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔(100 μl培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低,因此推荐

接种量不低于2,500 个/孔(100 μl培养基)。

?酚红和血清对CCK8法的检测不会造成干扰,可以通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去。

?CCK8可以检测大肠杆菌,但不能检测酵母细胞。在细胞增殖实验每次测定的过程中需要避免细菌污染,以免影响结果。

?CCK-8在0-5℃下能够保存至少6个月,在-20℃下避光可以保存1年。

?当在培养箱内培养时,培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发,由于体积不准确而增加误差。一般情况下,最外一圈的孔只加培养基,不作为测定孔用。

?在培养基中加入CCK8,培养一定的时间,测定450 nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验时,还应考虑药物的吸收,可在加入药物的培养基中加入CCK8,培养一定的时间,测定450 nm的吸光度作为空白对照。

?金属对CCK-8显色有影响:当终浓度为1 mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应,使灵敏度降级。

如果终浓度是10 mM的话,将会100%抑制。

?悬浮细胞由于染色比较困难,一般需要增加细胞数量和延长培养时间。

细胞增殖练习题

第6章细胞的生命历程 第1节细胞的增殖 一、选择题 1.要观察植物细胞的细胞板结构,所选择的细胞应处于有丝分裂的() A.前期 B.中期 C.后期 D.末期 解析:植物细胞有丝分裂末期在赤道板位置上由高尔基体形成细胞板逐渐扩展成为细胞壁,分裂成两个子细胞。 答案:D 2.下列选项中,两类细胞的染色体数目均可呈周期性变化的是() A.蛙的红细胞与淋巴细胞 B.小鼠骨髓瘤细胞与皮肤生发层细胞 C.人的胚胎干细胞与成熟红细胞 D.牛的精细胞与精原细胞 解析:染色体数目呈周期性变化的细胞必须是能进行连续分裂的细胞,A选项中蛙的红细胞进行无丝分裂,无染色体变化;C选项中人的成熟红细胞、D选项中牛的精细胞都不再分裂;B选项中小鼠的骨髓瘤细胞与皮肤生发层细胞均能进行连续的有丝分裂,染色体数目呈周期性变化。 答案:B 3.菠菜根的分生区细胞不断分裂,对该过程的叙述,正确的是() A.细胞分裂间期,DNA复制,DNA和染色体的数目增加一倍 B.细胞分裂前期,核膜和核仁逐渐消失,中心体发出星射线形成纺锤体 C.细胞分裂中期,染色体形态稳定、数目清晰,适于染色体计数和形态观察 D.细胞分裂末期,在细胞中央赤道板的位置出现一个由膜构成的细胞板 解析:本题主要考查细胞有丝分裂的过程。间期复制的结果是DNA含量加倍,染色体数目不变;中心体发出星射线形成纺锤体只发生在动物细胞和部分低等植物细胞中;细胞板没有膜结构。 答案:C 4.在人体成熟的红细胞、蛙的红细胞以及鸡的红细胞中均能进行的生理活动是() A.中心体发出星射线 B.细胞膜中央凹陷 C.ATP合成 D.着丝点分裂 解析:人的成熟红细胞没有细胞核和复杂的细胞器,所以不能分裂,但是可以通过无氧呼吸产生乳酸和ATP。蛙的红细胞能够进行无丝分裂,先核分裂,然后细胞膜中央凹陷,缢裂形成两个子细胞,能进行有氧呼吸产生二氧化碳、水和ATP。鸡的红细胞有细胞核和各种具膜的细胞器,可以进行有氧呼吸产生二氧化碳、水和ATP。 答案:C 5.在“观察根尖分生组织细胞的有丝分裂”实验中,以下操作和结论正确的是() A.剪取5 cm根尖,用酒精和吡罗红混合液解离染色 B.右图是高倍显微镜下调节细准焦螺旋看到的视野 C.持续观察,视野中的K细胞将分裂成两个子细胞 D.视野中,N细胞的染色体数目是M细胞的一半 解析:解离时用的解离液是酒精和盐酸混合液,且剪取的根尖长2~3 mm。该实验所观察的细胞在解离时已经死亡,不会继续分裂。M细胞的着丝点尚未分裂,染色体数目并没有加倍;N细胞中着丝点分裂,染色体数目加倍。所以N细胞的染色体数是M细胞的两倍。

细胞增殖及细胞活力检测方法

细胞增殖及细胞活力检测方法 目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法,通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法,即细胞活力(cell viability)检测方法,通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。显然,细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序,但药物的干扰可抑制凋亡的发生;这时若采用细胞活力检测法,显然可以区分两种条件下的细胞数量,但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。 用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞,再检测DNA链中氚含量。若细胞具有增殖能力,DNA合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料,因此检测细胞DNA链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行DNA 的合成。 但更为常用的方法是BrdU检测法。用BrdU预处理的细胞中,BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中,而且这种置换可以稳定存在,并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后,可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量(如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记,最后用比色法或荧光的方法进行定量测定),从而判断细胞的增殖能力。Calbiochem/EMD公司提供一种BrdU检测试剂盒,以微孔板的形式,合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。比色检测在一抗二抗标记后在450nm下读数,

所有操作在3小时内结束。而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。1000个细胞以上水平的检测只需用BrdU预孵育2小时,100个细胞则采用过夜预孵育,即可检测细胞的增殖能力。 BrdU法的一个缺点是需要固定和变性等破坏DNA的处理。有些情况下,研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量,然而,在变性条件下,DNA 的双链结构将被破坏,DAPI和Hoechest 33342等核酸标记探针就不再能识别DNA,因而也无法估计DNA总量。Molecular Probes公司的Click-iT EdU检测试剂盒可以解决这个问题。这种方法不需要变性步骤,因为荧光探针标记的叠氮化物小分子,而不是庞大的抗体分子,可以很轻易的识别并结合未变性DNA双链中的EdU分子。采用BrdU方法时,你必须非常小心的去对DNA进行变性,才能一方面使BrdU抗体进入细胞,另一方面又保留足够的双链DNA分子来进行细胞周期的分析。有了EdU 后则不同,由于你不再需要变性,这一切都很简单了;另外,常常用于DNA变性的HCl,可能破细胞内坏蛋白的抗原识别位点,因而限制了BrdU检测法中同时检测其他蛋白的应用,但这种情况在EdU法中不存在。 图1:EdU及BrdU原理示意图(摘至invitrogen说明书) 在一些情况下,细胞活力的检测相当于细胞增殖能力的测定。用于细胞活力检测的方法又很多,这些方法主要采用特殊的试剂来测定细胞的代谢活力,Alamar Blue,MTT及其他四唑盐。它们通过检测细胞的氧化还原活性来检测细胞增殖能力,所以这是一种间接的方法。 Calbiochem的快速细胞增殖试剂盒,或者,严格来说,叫细胞活力试剂盒,采用一

细胞凋亡试验常用的方法

细胞凋亡试验常用的方法(MTT法、荧光法、DNA琼脂糖凝胶电泳法与流式细胞仪检测法) (一)药物对肿瘤细胞的抑制效应的MTT法: 用培养基将肿瘤细胞调整至2 X108个/L,在96孔板中每孔加入100ul细胞悬液于37℃、5% CO2下培养过夜。 次日每孔加入不同浓度的药物100mg/L作为试验组,设加完全培养基不加药物的阴性对照,并用功能明确的药物为阳性对照和0.5%的乙醇溶剂对照,每组均设4-6个复孔(平行孔)、37℃、5% CO2继续培养。 培养至12h、24h、48h、实验终止前4-6h加入10ulMTT(5g/L),培养4-6h后,阴性对照孔中已形成明显的蓝紫色颗粒结晶时加100ul/孔SDS-HCl终止反应,于37℃存放过夜。 用酶标仪在A570波长下测吸光度值,按下式计算抑制率 抑制率(%)=(1-试验组平均吸光度值/阴性对照组平均吸光度值)x 100%。 (二)荧光法: 选用上述最佳浓度作用于肿瘤细胞,培养细胞48h后,收货细胞用PBS洗2-3次后用0.4%多聚甲醛室温下固定30min。 弃去固定液,并用PBS洗2次后,用1%Triton X-100作用4min加入适量的0.5mg/L DAPI 荧光染色60min,用PBS冲洗3次,取10ul滴片,干燥后于荧光显微镜下检测断裂的颗粒和片状荧光。 (三)DNA琼脂糖凝胶电泳法: 1、DNA提取: 用大方瓶培养肿瘤细胞,每瓶10ml,细胞浓度为3 x 108个/ml,每隔药物浓度、作用时间均设2瓶,共分3个时间段,4个药物浓度。共培养26瓶细胞。 分别于细胞中加入不同浓度的药物,于37℃、5% CO2中分别培养12h、24h、48h,收货细胞,用PBS洗2-3次。 于-20℃将细胞冷却处理10min后将细胞收集至离心管中,加1ml细胞裂解液,再加蛋白酶K,轻轻振摇使悬液混匀,成黏糊状,50℃过夜。 冷却后加入等体积的饱和酚溶液,混合后10000r/min离心10min,吸出上层水相,移至另一离心管中,再加入等体积饱和酚溶液重复抽提一次,直到无蛋白为止。 吸上清加入氯仿/异戊醇(24:1)按上述方法再抽提一次。 吸取水相层加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠溶液,混匀。 再加入2.5倍体积冷无水乙醇,混合置-20℃处理30min后,10000r/min离心10min,沉淀部分为提供的DNA,弃去无水乙醇后用70%乙醇漂洗2次,将离心管倒扣在吸水纸上,吸干乙醇。 加入200ulTE缓冲液融解DNA,再加入25ul的RNA酶,置37℃作用30min,置4℃冰箱保存。 2、琼脂糖凝胶电泳: TBE缓冲液配制1.8%琼脂糖凝胶。在微波炉内煮沸至琼脂糖融解,待冷却至60℃时,加入溴化乙锭,使其终浓度为0.5mg/ml,混匀后灌胶。 待凝胶固定后放入含TBE电泳液的电泳槽内,使TBE电泳液盖过凝胶。 取10-15ul提取的各组DNA样品液与上样缓冲液按4:1比例混匀后点样。 60V电泳1h,用紫外透射仪观察梯形条带。

高三生物专项训练试题:细胞的增殖(含答案)

专项训练试题:细胞的增殖 一、单选题 1.a、b、c、d分别是一些生物细胞某个分裂时期的示意图,下列有关描述正确的是 () A. a图表示植物细胞有丝分裂中期 B. b图表示人红细胞分裂的某个阶段 C. c图细胞分裂后将产生两个染色体数目不同的细胞 D. d图细胞中含有8条染色单体 2.真核细胞的分裂方式有减数分裂、有丝分裂和无丝分裂。下列叙述最可能属于该三 种细胞分裂方式共性的是() A. 染色质丝先螺旋化变成染色体,再解螺旋变成染色质丝 B. 同源染色体先两两配对,再彼此分离并进入不同的子细胞 C. 细胞完成分裂后,每个子细胞都能将葡萄糖分解成丙酮酸 D. 子染色体在纺锤丝或星射线的牵引下分别移向细胞两极 3.将全部核DNA分子双链经32P标记的1个果蝇精原细胞置于不含32P标记的培养基培 养,先经过一次有丝分裂,再经过一次减数分裂,产生了8个精细胞。下列说法错误的是 A. 有丝分裂中期和1个减Ⅰ中期细胞内染色体数相同,标记的染色单体数不同 B. 有丝分裂后期和1个减Ⅰ后期细胞内染色体数不同,标记的染色体数也不同 C. 1个减Ⅰ后期和1个减Ⅱ后期细胞内染色体数相同,标记的染色体数不同 D. 产生的8个精细胞,每个细胞内含有4条染色体,均有2条被标记 4.下图表示人体内干细胞的增殖分化。下列有关叙述正确的是

A. 干细胞与白细胞的基因型不同,但合成的mRNA和蛋白质的种类相同 B. 红细胞可以通过无丝分裂增殖 C. 图示所有的细胞中,干细胞具有细胞周期,而且其分裂能力较强 D. 白细胞能够穿过血管壁去吞噬病菌,这是因为细胞膜的选择透 过性 5.如图表示洋葱根尖分生区细胞的一个细胞周期,不能得出的推断是 () A. I时期一定发生DNA复制 B. II时期可出现四分体 C. 细胞周期开始于a D. 在做观察细胞有丝分裂实验时,应尽可能选择Ⅱ 比值大的作实验材料 ⅠⅡ 6.实验室培养甲、乙、丙、丁四种不同类型细胞,测得分裂间期占细胞周期的比例如 下图所示,有关说法正确的是( ) A. 四种细胞中丙分裂间期持续的时间最长 B. 不同温度下培养以上四种细胞,细胞周期持续的时间都会发生变化 C. 加入DNA复制抑制剂,停留在分裂间期细胞数量最少的是丁 D. 正常情况下四种细胞在分裂间期可发生染色体数目变化 7.测定一定数量细胞的DNA含量以分析细胞周期.下表是三组DNA、细胞数的相对 量.下列关于细胞周期的叙述,错误的是() A. 甲组的大部分细胞处于G1期 B. 乙组细胞正在进行DNA复制

细胞凋亡实验步骤及注意事项

细胞凋亡实验步骤及注意事项 一、实验目的 1、掌屋凋亡细胞的形态特征 2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞与坏死 细胞的方法 二、实验原理 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡与坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界,在生物个体与生存中起着非常重要的作用。它就是细胞在一 定生理条件下一系列顺序发生事件的组合,就是细胞遵循一定规律自己结束生命 的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学与生物化学特征。 在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触,细胞变园,细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网与细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体,凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外,不会影响其它细胞,因而不引起炎症反应。 在生物化学上,多数细胞凋亡的过程中,内源性核酸内切酶活化,活性增加。核DNA 随机地在核小体的连接部位被酶切断,降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳,可显示以180-200bp为基数的DNA ladder(梯状带纹)的特征。 相比之下,坏死就是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期 即丧失质膜完整性,各种细胞器膨胀,进而质膜崩解释放出其中的内容物,引起炎症反应,坏死过程中细胞核DNA虽也降解,但由于存在各种长度不等的DNA片断,不能形成梯状带纹,而呈弥散状。 一些温与的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡,通常这些因素在诱导凋亡的同时,也可产生细胞坏死,这取决于损伤的剧烈程度与细胞本身对刺激的敏感 程度。 三尖杉酯碱(HT)就是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病,急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0、02~5μg/ml范围内作用2小时,即可诱导HL-60细胞凋亡,并表现出典型的凋亡特征。本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡,同时也有少数细胞发生坏死。用 Hoechst33342与碘化丙啶(propidium iodide,PI)对细胞进行双重染色,可以区别凋亡、坏死及正常细胞。 细胞膜就是一选择性的生物膜,一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时,质膜不完整,PI就进入细胞内部,它可嵌入到DNA或RNA中,使坏死细胞着

细胞增殖练习题

细胞增殖练习题 1、细胞有丝分裂过程中,染色单体的形成和出现分别发生于下列哪个时期()。 A.产生于间期,出现于前期 B.产生于前期,出现于前期和中期 C.产生于间期,出现于前期和中期 D.产生于后期,出现于中期和后期 2、下列对人体细胞生命历程的描述,正确的是 A.细胞生长:细胞体积增大,核糖体数量增加,染色体复制加快 B.细胞分化:细胞形态改变,遗传物质发生变异,功能趋向专门化 C.细胞衰老:细胞核体积变小,细胞膜通透性增大,色素积累增多 D.细胞凋亡:特定基因表达,合成新的蛋白质,细胞自动结束生命 3、关于姐妹染色体的说法中,不正确的是 A.产生于分裂间期,消失于分裂后期 B. —条来自父方,一条来自母方 C.所含遗传物质通常相同 D.共用一个着丝粒 4、下列关于细胞周期的叙述正确的是 A.进行分裂的细胞都存在细胞周期 B.在一个细胞周期中,分裂期通常长于分裂间期 C.分裂间期包括一个合成期和两个间隙期 D.细胞周期是指上一次分裂开始到下一次分裂结束 5、动物细跑与植物细胞的有丝分裂过程明显不同的是 A.间期有染色质的复制 B.末期在细廁的中部不形成细胞板 C.后期有着丝点的分裂 D.末期染色体平均分配到两个子细胞中 6、人体细跑内含有46条染色体,当姐妹染色单体为92条时,此时细胞可能处于有丝分裂的 A.前期、中期 B.中期、后期 C.后期、末期 D.间期、末期 7、在观察植物细胞的有丝分裂实验中,制作装片的正确顺序是 A. 染色→解离→漂洗→压片 B. 解离→漂洗→染色→压片 C. 漂洗→解离→染色→压片 D. 解离→染色→漂洗→压片 8、一个细胞周期分为分裂间期和分裂期,可用一圆周作细胞周期的模式图,如图所示,下列选项中能表示细胞周期的是 A. A→A B. B→B C. A→B D. B→A 9、用化学药物抑制人体肿瘤细胞DNA的复制可以达到治疗肿瘤的目的,这在医学上属于“化疗”。用化学药物处理的肿瘤细胞停留在细胞周期的( ) A. 间期 B. 前期 C. 中期 D. 末期 10、下列关于生命活动变化关系的描述,正确的是() A.细胞体积增大,与外界物质交换效率提高 B.细胞液浓度增大,植物细胞吸水能力减弱 C.生长素浓度升高,植物细胞生长速度加快 D.体内血浆渗透压降低,抗利尿激素释放减少 11、在体细胞的增殖过程中,肯定发生的是 ( ) A.DNA含量的变化B.纺锤体的形成 C.基因突变D.染色体自由组合 12、a、b、c、d分别是一些生物细胞某个分裂时期的示意图,下列有关描述正确的是( ) A.a图表示植物细胞有丝分裂中期 B.b图表示人的红细胞分裂的某个阶段 C.c图细胞可能来自于d图所示细胞 D.d图细胞中含有8条染色体 13、细胞不能无限长大的原因是 A、细胞器数量过少 B、细胞膜不能太大 C、细胞表面积与体积的关系限制了细胞的长大 D、细胞核中的遗传物质DNA可以复制,所以细胞增大体积也无所谓 14、在观察植物细胞有丝分裂过程中,不能通过连续观察同一细胞达到观察不同时期细胞分裂相的原因是 A.实验时环境温度低,细胞分裂速度太慢 B.在解离过程中,细胞已经死亡 C.染色体着色太浅,细胞分裂时的变化不易观察到 D.实验过程中,细胞缺乏营养供应,不再分裂 15、下列关于动植物细胞有丝分裂的异同点叙述中,不正确的是() A.在分裂前期,动物细胞由中心粒周围发出星射线形成纺锤体

Brdu细胞增殖检测实验

Brdu检测细胞增殖实验 实验操作: 孵箱中培养72h(细胞密1.铺细胞,每个3.5cm dish 10万个,在37℃、5%CO 2 度至50-60%左右)。 2.Brdu(5-溴-2′-脱氧尿苷)加入培养细胞中,1mg/ml,标记48h。(量:Brdu 以铺满整个dish底面为准。) 3.固定:PBS洗细胞爬片3次,每次5min,在摇床上晃动清洗,4%PFA固定30min。4.变性:将固定好的细胞爬片用PBS洗3次,每次5min,2mol/L的HCl在37℃条件下变性5min,可放置于37℃恒温孵箱,应用封口膜把培养皿封好。(120r/m)5.中和:0.1mol/L的硼酸钠(PH8.3)中和10min,PBS洗3次,每次5min。(50r/m)6.加入1ml的0.2%TritonX-100,10min。 7.吸出TritonX-100,用PBS洗3次,每次5min。 8.加入1ml 3%的BSA封闭,室温1h,可在摇床上晃动。 9.吸出BSA,用PBS洗3次,每次5min。 10.加一抗(尿嘧啶脱氧核苷Brdu(鼠单抗)1:200),用1%BSA稀释,4度过夜。11.将孵好一抗的细胞爬片用PBS洗3次,每次10min。 12.加二抗(羊抗鼠IgG/Alexa Fluor 594 1: 100),用1%BSA稀释,避光室温孵育1h。(60 r/min) 13.将孵好二抗的细胞爬片用PBS洗3次,每次10min。 14.加DAPI染细胞核,储存浓度为1mg/ml,应将DAPI完全混匀,可用手弹几下,一般稀释比例为1:1000(用PBS稀释),避光室温反应10min。 15.将DAPI染好的细胞爬片用PBS洗3次,每次10min。 16.中性树胶封片,荧光显微镜观察,200×镜下取5个视野,计数Brdu阳性细

常用细胞凋亡检测方法(图)

常用细胞凋亡检测方法(图) 转载请注明来自丁香园 发布日期:2012-02-16 13:41 文章来源:丁香通 关键词:丁香园生物专题义翘神州细胞培养点击次数:951 一、细胞凋亡的形态学检测 1、光学显微镜和倒置显微镜 ①未染色细胞:凋亡细胞的体积变小、变形,细胞膜完整但出现发泡现象,细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 ②染色细胞:常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化,核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 2、荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA 特异性染料有:HO 33342 (Hoechst 33342),HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种种染料与DNA的结合是非嵌入式的,主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。Hoechst是与DNA特异结合的活性染料,储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度,使用时用PBS稀释,终浓度为10 ug/ml。DAPI为半通透性,用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度,使用终浓度一般为10 ug/ml。结果评判:细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期:Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased),部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体(图1)。 3、透射电子显微镜观察 结果评判:凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期(pro-apoptosis nuclei)的细胞核内染色质高度盘绕,出现许多称为气穴现象(cavitations)的空泡结构(图2);Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;细胞凋亡的晚期,细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V法) 磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素(FITC、PE)或biotin标记,以标记了的Annexin-V作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细核红染。因此将Annexin-V 与PI匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。 方法

CCK8法检测细胞增殖预实验

SRT-1720, EX527 —定要应用在白血病细胞株起作用的浓度方可比较对 293T细胞和白血病细胞株的不同影响,请重复实验。 实验日期:2015/08/22-2015/08/27 实验项目:CCK8法检测细胞增殖 实验地点:广西医科大学药基楼14楼生物靶向中心 实验人员:高宗燕、宁海萍、李登峰 实验目的:检测SRT-1720/EX527刺激293T细胞后对细胞增殖的影响 主要试剂:SRT-1720,EX527,CCK8试剂盒 主要仪器:酶标仪 实验步骤: 一、制作标准曲线(测定细胞具体数量时) 1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量,然后接种细胞至96孔板。 2、设置4个细胞浓度梯度:0, 2000,4000,8000,每组4个复孔。 3、接种后培养24小时使细胞贴壁,然后加CCK试剂培养4小时后测定OD值,制作出一条以细胞数量为 横坐标(X轴),OD值为纵坐标(Y轴)的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量(试用此标准曲线的前提是实验的条件要一致,便于确定细胞的接种数量以及加入CCK后的培养时间。) 图一、标准曲线 二、细胞增殖检测 1、在96孔板中配置100卩泊勺细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24小时(在37C, 5% CO2的条件下)。 2、向培养板加入10 ^L SRT-1720(终浓度3um), EX527 (终浓度100um)。 3、将培养板在培养箱孵育约24h 4、每孔加入10卩L CCK溶液(注意不要再孔中生成气泡,它们会影响OD值的读数)。

5、将培养板在培养箱内孵育2小时。

6、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。 图二、3um SRT1720刺激293T细胞后的细胞增殖曲线。该曲线呈S形,符合细胞正常生长情况。 图三、100um EX527刺激293T细胞后的细胞增殖曲线。该曲线前部分呈S形,符合细胞正常生长情况,但 在进入对数期之后曲线有下滑,之后进入平台期。 分析: SRT1720为SIRT1特异性活化剂,在前期实验中对白血病细胞株的生长表现出抑制作用,此次实验中SRT1720对正常细胞(293T)的生长无明显抑制作用。暗示SIRT1的活化对正常细胞的生长可能无明显影 响。 小剂量EX527为SIRT1特异性抑制剂,在前期实验中大剂量EX527对白血病细胞株的生长表现出抑制作用,而小剂量EX527无此效应,此次实验中大剂量EX527对正常细胞(293T)的生长可能有轻度抑制作用。但不能以一次实验结果做出肯定的结论,该实验还需重复。

人教版高一生物必修一第六章细胞增殖练习题

必修1·第六章周测 1月11 一、选择题 1.下图a →d 表示连续分裂细胞的两个细胞周期。下列叙述不正确的是( ) A .a 和b 为一个细胞周期 B .c 段结束DNA 含量增加一倍 C .遗传物质平分一般发生在d 段 D .b 和c 为一个细胞周期 2. 用光学显微镜观察有丝分裂过程,若从细胞周期的时间考虑,应选择下表中哪种植物作为实验材料( ) 3. 小明在割草时不小心伤到手指,7天后伤口愈合再生,这个过程中合成的主要物质和发生的细胞分裂方式分别是( ) A .脂肪、有丝分裂 B .核酸、无丝分裂 C .蛋白质、无丝分裂 D .蛋白质、有丝分裂 4.连续分裂的细胞体积增大,发生在细胞周期的( ) A .分裂间期 B .分裂前期 C .分裂中期 D .分裂后期 D .细胞分裂末期,高尔基体参与细胞壁的形成 5.一种动物体细胞中的染色体数为24。该动物体内一个处于有丝分裂前期的细胞,其DNA 分子数和染色体数分别为( ) A .12、48 B .24、48 C .24、24 D .48、24 6.在细胞有丝分裂的分裂期开始时,如果它的染色体数为N ,DNA 含量为Q ,则该细胞分裂后每个子细胞中的染色体数和DNA 含量分别是( ) A .N 和O B .N/2和Q/2 C .N 和Q/2 D .N/2和Q 7.动物细胞有丝分裂区别于植物细胞有丝分裂的特点是( ) A .核膜、核仁消失 B .形成纺锤体 C .中心粒周围发出星射线 D .着丝点分裂,染色单体分离 8.下列细胞具有分裂能力的是( ) A .根尖成熟区细胞 B .人的角质层细胞 C .癌细胞 D .高度分化的细胞 9.对于多细胞生物而言,下列有关细胞生命历程的说法正确的是( ) A .细胞分化导致细胞中的遗传物质发生改变 植 物 细胞周期时间/h 分裂间期 分裂期 合计 A 、物种A 10.6 0.4 11 B 、物种B 18 0.5 18.5 C 、物种C 18.5 2.5 21 D 、物种D 10.4 2.3 12.7

细胞凋亡检测方法

细胞凋亡检测方法 一、细胞凋亡的形态学检测 1 光学显微镜和倒置显微镜 (1)未染色细胞:凋亡细胞的体积变小、变形,全面皱缩,细胞膜完整但出现发泡现象,细胞凋亡晚期可见凋亡小体,凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 (2)染色细胞: 姬姆萨(Giemsa)染色、瑞氏染色等:正常细胞核色泽均一;凋亡细胞染色质浓缩、边缘化,核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态;坏死细胞染色浅或没染上颜色。 苏木素-伊红(HE)染色:细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色(凋亡细胞),正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色,坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料有:Hoechst 33342,Hoechst 33258,DAPI。三种染料与DNA 的结合是非嵌入式的,主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料,能进入正常细胞膜而对细胞没有太大细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高。 DAPI为半通透性,用于常规固定细胞的染色。 PI和Hoechst33342双标:PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA(或RNA)结合。但PI不能通过正常细胞膜,Hoechst则为膜通透性荧光染料,故细胞在处于坏死或晚期调

亡时细胞膜被破坏,这时可为PI着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色,但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形,淡兰色,内有较深的兰色颗粒;而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色,或核呈分叶,碎片状,边集。故PI着色为坏死细胞;亮兰色,或核呈分叶状,边集的Hoechst着色的为调亡细胞。 凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩。细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期:Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased),部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体(图1)。 3 透射电子显微镜观察 凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期(pro-apoptosis nuclei)的细胞核内染色质高度盘绕,出现许多称为气穴现象(cavitations)的空泡结构(图2);Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;细胞凋亡的晚期,细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V法) 磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于细胞膜内侧,但在细胞凋亡早期,PS可从细胞膜内侧翻转到细胞膜表面,暴露在细胞外环境中。磷脂酰丝氨酸的转位发生在凋亡早期阶段,先于细胞核的改变、DNA断裂、细胞膜起泡。体内的吞噬细胞可通过识别

(完整版)细胞增殖的练习题及答案(2)

细胞的增殖作业 一、选择题: 1、在一个细胞周期中,最可能发生在同一时期的是() A.着丝点的分裂和细胞质的分裂 B.染色体数加倍和染色单体形成 C.细胞板的出现和纺锤体的出现D.染色体复制和中心粒复制 2.科学家用15N的硝酸盐作为标记物浸泡蚕豆幼苗,追踪蚕豆根尖细胞分裂情况,得到蚕豆根尖分生区细胞连续分裂数据如下,则下列叙述正确的是() A.高尔基体、线粒体、叶绿体在蚕豆根尖细胞分裂过程中活动旺盛 B.蚕豆根尖细胞的DNA分子结构稳定性最低的时期有0—2h、19.3—21.3h、 38.6—40.6h C.基因重组可发生在19.3—21.3h D.蚕豆根尖细胞分裂的一个细胞周期为19.3h 3.下列有关“观察植物细胞有丝分裂”实验现象的叙述,其中错误的是()A.分生区的细胞呈正方形 B.根尖的整体呈乳白色,尖端(根冠)略显淡黄 C.处于分裂前期的细胞均无核仁 D.向左下方略移动装片,图像向右上方移动 4.种子萌发时,在利用光能之前,不会发生下列哪种现象() A.细胞分化B.细胞分裂 C.细胞呼吸D.利用无机物合成有机物 5.有关细胞分化的叙述,正确的是() A.分化只发生在人的胚胎时期 B.分化过程中,细胞器种类和数量不会发生改变 C.分化过程中遗传物质发生了改变 D.生物体生长发育过程是细胞发生分化的过程 6.癌细胞属于恶性分化的细胞,表现为() A.细胞表面糖蛋白减少B.存在大量游离核糖体 C.细胞代谢速率下降D.细胞含水量急剧下降 7.下图中甲—丁为某动物(染色体数=2n)睾丸中细胞分裂不同时期的染色体数、染色单体数和DNA分子数的比例图,关于此图叙述中错误 ..的是()

实验14-细胞凋亡的诱导和检测

实验14 细胞凋亡的诱导和检测 20世纪60年代人们注意到细胞存在着两种不同形式的死亡方式:凋亡(apoptosis)和坏死(necrosis)。细胞坏死指病理情况下细胞的意外死亡,坏死过程细胞膜通透性增高,细胞肿胀,核碎裂,继而溶酶体、细胞膜破坏,细胞容物溢出,细胞坏死常引起炎症反应。 细胞凋亡apoptosis一词来源于古希腊语,意思是花瓣或树叶凋落,意味着生命走到了尽头,细胞到了一定时期会像树叶那样自然死亡。凋亡是细胞在一定生理或病理条件下遵守自身程序的主动死亡过程。凋亡时细胞皱缩,表面微绒毛消失,染色质凝集并呈新月形或块状靠近核膜边缘,继而核裂解,由细胞膜包裹着核碎片或其他细胞器形成小球状凋亡小体凸出于细胞表面,最后凋亡小体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。凋亡过程中溶酶体及细胞膜保持完整,不引起炎症反应。细胞凋亡时的生化变化特征是核酸切酶被激活,染色体DNA被降解,断裂为50~300 kb长的DNA片段,再进一步断裂成180~200bp整倍数的寡核苷酸片断,在琼脂糖凝胶电泳上呈现“梯状”电泳图谱(DNA Ladder)。细胞凋亡在个体正常发育、紫稳态维持、免疫耐受形成、肿瘤监控和抵御各种外界因素干扰等方面都起着关键性的作用。 1.细胞凋亡的检测方法 凋亡细胞具有一些列不同于坏死细胞的形态特征和生化特征,据此可以鉴别细胞的死亡形式。细胞凋亡的机制十分复杂,一般采用多种方法综合加以判断,同时不同类型细胞的凋亡分析方法有所不同,方法选择依赖于具体的研究体系和研究目的(表?)。

形态学观察方法:利用各种染色法可观察到凋亡细胞的各种形态学特征: (1)DAPI时常用的一种与DNA结合的荧光染料。借助于DAPI染色,可以观察细胞核的形态变化。 (2)Giemsa染色法可以观察到染色质固缩、趋边、凋亡小体形成等形态。 (3)吖啶橙(AO)染色,荧光显微镜观察,活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 (4)吖啶橙(A())/溴化乙啶(EB)复染可以更可靠地确定凋亡细胞的变化,AO只进入活细胞,正常细胞及处于凋亡早期的细胞核呈现绿色;EB只进入死细胞,将死细胞及凋亡晚期的细胞的核染成橙红色。 (5)台盼蓝染色对反映细胞膜的完整性,区别坏死细胞有一定的帮助,如果细胞膜不完整、破裂,台盼蓝染料进入细胞,细胞变蓝,即为坏死。如果细胞膜完整,细胞不为台盼蓝染色,则为正常细胞或凋亡细胞。使用透射电镜观察,可见凋亡细胞表面微绒毛消失,核染色质固缩、边集,常呈新月形,核膜皱褶,胞质紧实,细胞器集中,胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 (6)木精-伊红(HE)染色是经典的显示细胞核、细胞质的染色方法,染色结果清晰。发生凋亡的细胞经HE染色后,其细胞大小的变化及特征性细胞核的变化:染色质凝集、呈新月形或块状靠近核膜边缘,晚期核裂解、细胞膜包裹着核碎片“出芽”凸出于细胞表面形成凋亡小体等均可明显显示出来。 DNA凝胶电泳:细胞发生凋亡或坏死,其细胞DNA均发生断裂,细胞小分子 质量DNA片段增加,高分子DNA减少,胞质出现DNA片段。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间,出现180~200 bp DNA片段,而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片段,利用此特征可以确定群体细胞的死亡,并可与坏死细胞区别。

MTT分解比色法测定细胞生存和增殖

MTT reduction - a tetrazolium-based colorimetric assay for cell survival and proliferation Contributed by Joan M. Chapdelaine Pharmakon Research International, Inc.Waverly, PA, 18471 INTRODUCTION In 1983, a quantitative colorimetric assay for mammalian cell survival and cell prolifera-tion was proposed by Mosmann.1 The assay is dependent on the reduction of the tetrazo-lium salt MTT (3-(4,5-dimethylthazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) by the mitochondrial dehydrogenase of viable cells to form a blue formazan product. The assay measures cell respiration and the amount of formazan produced is proportional to the number of living cells present in culture. The assay has been shown to be a simple, rapid alternative to counting cells by dye inclusion/exclusion, monitoring the release of 51Cr from lysed cells, or the incorporation of [3H]-thymidine into cellular DNA. The MTT assay has been used with a growing number of cell types including primary cultured cells as well as established cell lines. This colorimetric microplate assay is cost effective because of the number of tests which can be performed at one time without the problem of radio-isotope and contaminated materials disposal. Applications of the MTT assay The use of the colorimetric assay for cell growth and cell survival offers major advantages in speed, simplicity, cost, and safety over conventional cell counting assays. Figure 1 shows in a block diagram form how the MTT assay can be substituted for the thymidine uptake assay. The MTT assay has fewer steps, uses fewer materials, and does not carry the added burden of radioactive waste disposal. Application Note 5

细胞增殖习题及答案

细胞增殖测试题 一、选择题 1.有关真核细胞分裂的叙述,正确的是(多选)( ) A.无丝分裂过程核膜不消失 B.动物细胞仅以有丝分裂方式进行增殖 C.动物细胞有丝分裂末期不形成细胞板 D.无丝分裂仅出现于高等生物的衰老细胞 2.有1位同学做根尖有丝分裂实验,在显微镜中观察到的图像如图所示。造成这种情况的原因可能是( ) ①取材位置不合适②取材时间不合适③制片时压片力量不合适④解离时间不合适⑤视野选择不合适 A.②③B.②⑤ C.①②⑤ D.①③④ 3.在制作洋葱根尖压片观察细胞有丝分裂时,不可能用到的试剂是( ) A.龙胆紫染液 B.醋酸洋红染液 C.稀盐酸溶液 D.30%蔗糖溶液 4.下列有关体细胞有丝分裂的叙述,错误的是( ) A.细胞周期中,间期时间较短,分裂期时间较长 B.分裂完成后两个正常子细胞的DNA序列相同 C.分裂中期,着丝粒排列在赤道板上 D.间期发生DNA复制和蛋白质合成 5.下列有关正常动物体细胞有丝分裂间期的叙述错误的是( ) A.分裂间期发生DNA复制 B.分裂间期有蛋白质合成 C.分裂间期有RNA合成 D.分裂间期有逆转录发生 6.细胞有丝分裂完成后,平均分配到两个子细胞的物质是( ) A.叶绿体DNA B.线粒体DNA C.细胞核DNA D.核糖体RNA 7.连续分裂的动物体细胞的生长即体积增大,发生在细胞周期的( ) A.分裂间期 B.分裂前期 C.分裂中期 D.分裂后期 8.人体细胞有丝分裂时,产生的四分体个数是( ) A.46 B.23 C.4 D.0 9.能在细胞分裂间期起作用的措施是( ) ①农作物的诱变育种②用秋水仙素使染色体数目加倍 ③肿瘤的化疗④花粉离体培养 A.①③ B.①④ C.②③ D.②④ 10.用高倍显微镜观察洋葱根尖细胞的有丝分裂。下列描述正确的是( ) A.处于分裂间期和中期的细胞数目大致相等 B.视野中不同细胞的染色体数目可能不相等

细胞凋亡的几种检测方法

细胞凋亡的几种检测方法 1、形态学观察方法 (1)HE(苏木精—伊红染色法)染色、光镜观察:凋亡细胞呈圆形,胞核深染,胞质浓缩,染色质成团块状,细胞表面有“出芽”现象。 (2)丫啶橙(AO)染色,荧光显微镜观察:活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 (3)台盼蓝染色:如果细胞膜不完整、破裂,台盼蓝染料进入细胞,细胞变蓝,即为坏死。如果细胞膜完整,细胞不为台盼蓝染色,则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性,区别坏死细胞有一定的帮助。 (4)透射电镜观察:可见凋亡细胞表面微绒毛消失,核染色质固缩、边集,常呈新月形,核膜皱褶,胞质紧实,细胞器集中,胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 2、DNA凝胶电泳 细胞发生凋亡或坏死,其细胞DNA均发生断裂,细胞内小分子量DNA片断增加,高分子DNA减少,胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发

生在核小体之间,出现180-200bpDNA片断,而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断,利用此特征可以确定群体细胞的死亡,并可与坏死细胞区别。正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状(LADDER)条带;坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带 3、酶联免疫吸附法(ELISA)核小体测定 凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成,可由ELISA法检测。 检测步骤 1、将凋亡细胞裂解后高速离心,其上清液中含有核小体; 2、在微定量板上吸附组蛋白体’ 3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘ 4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’ 4、加酶的底物,测光吸收制。 用途 该法敏感性高,可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器,

细胞增殖实验(MTT法)的步骤及方法

细胞增殖实验(MTT法)的步骤及方法 一、技术简介 细胞增殖是生物体的重要生命特征,细胞以分裂的方式进行增殖。单细胞生物,以细胞分裂的方式产生新的个体。多细胞生物,以细胞分裂的方式产生新的细胞,用来补充体内衰老和死亡的细胞;同时,多细胞生物可以由一个受精卵,经过细胞的分裂和分化,最终发育成一个新的多细胞个体。必须强调指出,通过细胞分裂,可以将复制的遗传物质,平均地分配到两个子细胞中去。可见,细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。真核细胞的分裂方式有三种,即有丝分裂、无丝分裂和减数分裂。 MTT是3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide的简称。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。然后采用二甲基亚砜(DMSO)溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在570 nm波长处测定其光吸收值,反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。 二、实验流程(以贴壁细胞为例) 1. 收集对数期细胞,调整浓度。 2. 将细胞种植于96孔板中,待细胞贴壁后(约4-12 h)加药。 3. 5% CO2,37 o C孵育一定时间。 4. 每孔中加入200 μL MTT溶液(配制成5 mg/ml),培养4 h。 5. 吸去孔内的培养液,加入150 μL DMSO,可继续孵育4 h,使结晶物充分溶 解。 6. 取出96孔板,将其置于酶联免疫检测仪上,震荡15 s,然后在570 nm下 测量吸光值。 7. 结果统计分析。

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