jia体液体培养条件及产胞外多糖的研究
安徽农业科学.JournalofAnhuiAgri.Sci.2008.36(20):8543—8545责任编辑刘月娟责任校对卢瑶铆钉菇菌丝体液体培养条件及产胞外多糖的研究
汪洁,兰黎雪,宋红梅(大连民族学院,生物技术与资源利用国家民委一教育部重点实验室,辽宁大连116600)
摘要[目的]为食用茵液体培养和胞外多糖的研究提供基础。[方法]研究铆钉菇茵丝体的最佳液体培养条件,并对其产胞外多糖的情况进行测定。【结果]铆钉菇茵丝体深层发酵适宜的培养基组成为:蔗糖加吕/L、酵母浸膏2g/L、K:HPO。0.5g/L、MgSO。0.5g/L、Vc0.001∥L,适宜培养温度28℃,pH值7.0。铆钉菇茵丝体液体培养7d,菌丝体干重为28.Og/L,胞外多糖产量为3.27g/L。
[结论]铆钉菇茵丝体液体培养可很好地生长,并产生较多的胞外多糖。
关键词铆钉菇;茵丝体:液体培养;胞外多糖
中图分类号¥646.1+9文献标识码文章编号0517—661l(2008)20—08543—03
StudyonLiquidCultureConditionsandProductionofExopolysaccharidesofGomphidiusrutilusMycelia
GANGJieetal(KeyLaboratoryofBiotechnologyandBioresoureesUtilization,StateEthnicAffairsCommission&MinistryofEducation.DalianNationalitiesUniversity.Dalian.Liaoning116600)
Abstract[0biectiveTheaimoftheresearchwastoprovidebasisforediblefungimycelialiquidcultivationandproductionofexopolysac.charides.IMethodTheoptimumsubmergedcultureconditionforG0mphidiusrutilusmyceliaandtheproductionoftheexopolysacchafideswerestudied.fResuhTheoptimummediumobtainedforGDmphhi池ru£“wsubmergedcultureconditionswasasfollows:sucrose20∥L,yeast—extractpaste2g/L,K2HP040.5g/L,MgS040.5g/L,Vc0.0019/L.neoptimalculturetemperaturewas28℃,andpHvalueWas7.O.Undertheexpefimentalconditions,themycelialdryweightofGomphidiⅢrutiluswas28.0g/L,andtheexopolysaccharideswas3.27∥Lin7days.【ConclusionC,omphidiusrutil“myceliacouldgrowwellbyliquidcultivationandmoreexopolysaccharideswereproduced.KeywordsGomphidiusrutilus;Mycelia;Liquidcultivation;Exopolysaccharides
铆钉菇(Gomphidiusrutilus),担子菌亚门,层菌纲,伞菌
目,铆钉菇科。铆钉菇俗称松树伞、松蘑、肉蘑(东北),菌盖
肉质,径2—4cnl或更大,钟形至圆锥形,后平展,盖面湿时
粘,干后有光泽,暗赤褐色;菌肉厚,黄褐带红色;菌褶延生,
厚,不等长,初时褐色,后黑褐色;菌柄长7~12cm,粗12~20
mill,圆柱形或向下渐细,黄褐色,基部有纤维毛丛,中实,菌
环黄褐色绵毛状,易消失。夏秋季群生或散生于油松(Pinus
tabuiaeformis)、马尾松(P.,棚5D缸M)、樟子松(P.sylvestris
Vat.mongolica)等林内,与松属植物形成外生菌根,分布于中
国(辽、吉、黑、冀、滇)、日本、欧洲及北美¨‘2。。至今,仍很难
人工离体培养出子实体。目前,人们对铆钉菇生物学和生态
学特性、驯化栽培进行了初步研究"“1,并对铆钉菇对土传
病原菌抑菌性和对重金属的耐性进行了研究¨“1,但对其菌
丝体的液体培养和代谢产物方面的研究甚少。采用液体发
酵技术生产菌丝体,周期短,成本低,产量大,有工业化生产
前景o“。笔者研究了铆钉菇菌丝体的最佳液体培养条件,并
对其产胞外多糖的情况进行了测定,为铆钉菇子实体栽培时
提供种子及对其菌丝体营养价值、代谢产物的进~步研究奠
定基础。
1材料与方法
1.1菌种和培养基
1.1.1菌种。供试铆钉菇(Gomphidiusrutilus)购自朝阳市
食用菌研究所。
1.1.2培养基。斜面培养基(PDA培养基):马铃薯200g、
葡萄糖20g、琼脂粉20g、水1000ml,pH值自然。完全培养
基:葡萄糖20g、蛋白胨2g、KH2PO。0.5g、MgSO。0.59、
K2HP041g、水l000rIll,pH值自然。
1.2试剂及仪器
1.2.1试剂。葡萄糖、琼脂粉、KH2PO。、MgS04、K2HPO。、
基金项目作者简介
收稿日期大连民族学院太阳鸟项目。
江洁(1965一),女,黑龙江齐齐哈尔人,博士,教授,从事食品生
物技术方面的研究。
2008-05-07
KCl、CuSO。、CaCl:、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、果糖、乳糖、酵
母浸膏、牛肉膏、硫酸铵、硝酸铵、V。、VB。、VB:、VB。,均为分
析纯或化学纯。
1.2.2仪器。电子精密天平,电热恒温培养箱,无菌操作
台,紫外可见分光光度计,恒低温气浴摇床,pH酸度计,智能
水分测定仪等。
1.3试验方法
1.3.1菌种活化。将保存菌种用接种针接入斜面培养基
中,25℃恒温培养7d。
1.3.2液体培养。在完全培养基中接入等量的菌体,培养
温度28℃,摇床转速150r/min,培养7d后测定菌丝体干重。
1.3.3菌丝体干重的测定。利用智能水分测定仪,用移液
管吸取10T11l菌液,烘干至恒重,测10IIll菌液菌丝体干重。
1.3.4胞外多糖的测定。采用苯酚一硫酸法。
1.3.4.1标准曲线的绘制。准确称取标准葡萄糖20ms(烘
干至恒重)于500ml容量瓶中,加水至刻度,分别吸取0.4、
0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8ml,以水补至2.0llll。然后加
入6%苯酚1.0ml、浓硫酸5.0“,静置10rain,摇匀,室温放
置20min后于波长490am处测光密度,以2.0rnl水按同样
显色操作空白,横坐标为多糖微克数,纵坐标为光密度,绘制
标准曲线。
1.3.4.2样品测定方法。取适量发酵液,5000r/min离心
30min,将所获上清液抽滤,除去其中的不溶物,向滤液中加
入3倍体积的95%乙醇,沉淀过夜,获得白色纤维状粗多糖。
再5000r/min离心30min,取上清液1.OrIlI按上述步骤操
作测光密度,绘制标准曲线,计算多糖含量。
2结果与分析
2.1不同碳源对铆钉菇菌丝体生长的影响供试碳源为蔗
糖、麦芽糖、可溶性淀粉、果糖、乳糖,取代完全培养基中葡萄
糖,添加量为20g/Lo以完全培养基为对照,培养温度28
℃,摇床转速150r/min,培养7d后测定菌丝体干重。表l
表明,铆钉菇在以葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖等为碳源时均
万方数据
安徽农业科学2008定
能较好生长。其中,长势最好的是蔗糖,并且在以蔗糖为碳
源时所产生的菌球大小均匀,因此蔗糖为铆钉菇的最适碳
源;其次是果糖;长势最差的是可溶性淀粉。
袭1不同碳源对铆钉菇菌丝体生长的影响
Table1Effectsofdifferentcarbonsour嘴011thegrowthof
Gomph/d/us门叫加myceHa
娶?,簟孽髯亨菌球数目菌丝体干重////g/L
困坪双目困丝俘十重L
L咖
¨??BaunuroberDryweightofmyceha
竺!苎望
堡业!!!!旺
对照
蔗糖
果糖
乳糖
麦芽糖
可溶性淀粉透明,有菌球+++
透明,有菌球++++
透明。有菌球+++
透明,有菌球+++
透明,有菌球+++
透明.有菌球+++
3.2
19.6
7.8
1.6
2.4
1.8
2.2不同氮源对铆钉菇茵丝体生长的影响供试氮源为酵母浸膏、牛肉膏、硫酸铵和硝酸铵,取代完全培养基中的蛋白胨,添加量为2g/L。以完全培养基为对照,培养温度28℃,摇床转速150r/win,培养7d后测定菌丝体干重。表2表明,酵母浸膏是铆钉菇的最佳氮源,其次是蛋白胨和牛肉膏,说明铆钉菇更适宜利用有机氮源,在无机物作为氮源时菌球生长不良。呈现出浅黄色。
裹2不同氯源对铆钉菇菌丝体生长的影响
Table2Effectsofdifferentnitrogen9DIu嘲OI!thegrowthofCromphidiustlitihl¥mycelia
纛管菌球数日菌丝体十重//s/L
。
j.BallnumberDryweiFatofmyeelia些!要塑竺里!!!!臣
对照透明,有蔺球+++4.1
牛肉膏透明,有菌球++1.5
硫酸铵透明。有卣球+0.8
硝酸铵透明。有菌球+0.3
酵母浸膏透明,有菌球+++4.9
2.3不同无机盐对铆钉菇菌丝体生长的影响分别用0.2g/LCuSO,、CaCl2、FeS04和0.5g/LKCI、MgS04、KH2PO。代替完全培养基中的无机盐成分进行液体发酵。以完全培养基为对照,培养温度28℃,摇床转速150r/win,培养7d后测定菌丝体干重。表3表明,CuSO。和FeSO。对铆钉菇生长有明显的抑制作用,在这2种无机盐存在的情况下,菌丝体表3不同无机盐对铆钉菇菌丝体生长的影响
Table3Effectsofdifferentinorganicsalts011thegrowthofGomph/d/us/'g/./'///,Klmycelia
无机盐菌液形态
菌球数目菌丝体干重//g/L
bor删。“掣BallnurnberDryweishtofmycelia型!竺虫坠12臣
对照透明.有菌球++++3.7
CuSO,无生长现象
透明,有菌球+++无生长现象
透明,有荫球++++透明.有菌球+++透明,有菌球+++2.3
3.5
2.8
3.5
攀一
2.6不同温度对铆钉菇菌丝体生长的影响设25、28、30、
35℃4个温度梯度,铆钉菇接种于完全培养基,28℃,摇床
转速150r/rain,培养7d,观察不同温度下菌丝生长情况。表
5表明,铆钉菇菌丝体的最适生长温度为28℃,此时,菌丝洁
白,菌球大小均匀;当温度为35℃时,菌丝生长速度下降。
2.7铆钉菇菌丝体生长过程的测定在铆钉菇菌丝体适宜
培养条件下,对菌丝体生长过程进行测定。由图2可知,培
养l一3d,铆钉菇菌丝体生长速度较慢,是生长的延滞期;3
~6d,随培养时间的增加,菌丝体干重逐渐增加;6。7d,生
长速度减慢,培养7d时菌丝体千重为28∥L。
2.8铆钉菇菌丝体液体培养产胞外多糖的测定在优化的
砒她Ⅻ螂詈.
渊献刚峭毗
万方数据
36卷20期江洁等铆钉菇茵丝体液体培养条件及产胞外多糖的研究8545
裹5不同温度对铆钉菇菌丝体生长的影响
Table5EITeetsofdifferentlemperatu雎011thegrowthof
Gomphidiusgullhl¥mycelia
温度∥℃冀孽髯孝菌球数目菌丝体干重∥g/L
TemperatureBallnumberDwwei01tofmyeelia
堡!里!!!!型
25浑浊,有菌球+++26.0
28浑浊,有蔺球+++28.2
30较浑浊,有菌球+++25.6
35浑浊,有菌球++++10.3
竺萤
掣!
尊量
嚣:
凸
1234567
培养时间CulturetimeⅣd
图2铆钉菇菌丝体的生长曲线
隐.2GrowthCUlt'VeotGomph/d/ntsrut//usmyeelia
铆钉菇菌丝体液体培养条件下进行铆钉菇培养,采用苯酚一硫酸法对产胞外多糖进行测定。研究表明,培养7d,胞外多糖产量为3.27g/L。所以,可进一步通过条件优化,提高胞外多糖产量。
3结论
食用菌液体培养技术比传统的食用菌栽培生产技术有明显的优越性,可在短时间内获得大量的菌丝体和代谢产物。深层发酵培养的真菌菌丝体与子实体在化学组成、生理功能上均很相似¨。。在液体培养过程中,除菌丝体大量增殖外,还会在发酵液中产生多糖、多肽、生物碱、萜类化合物和维生素等多种生理活性物质。因此,食用菌的液体培养技术逐渐受到人们的重视。研究表明,铆钉菇菌丝体液体培养可很好地生长,并产生较多的胞外多糖。在研究中还发现,铆钉菇菌丝体液体培养会产生很多挥发性物质,并且培养液颜色由无色转变成蓝色,对这些现象将进行深入研究。
参考文献
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(上接第8540页)
粉产生的自交果,随时发现随时去除,确保种子的杂交率。
由于黄秋葵的种质丰富,所以杂交育种是目前采用的最多的方法之一,而且取得了显著的成绩,已培育出了没有粘液的黄秋葵品种,提高了其口感,这一方法还有更大的发展空间。
3.2其他方法日渐成熟目前,黄秋葵的组培技术已经成熟。丰锋¨6。研究发现,东京五角选用苗龄为10d的无菌苗,切其带子叶和约2mln下胚轴的顶芽,在MS+6Ⅱ∥L6-BA+0.1me/LNAA+2me,/LGA,的培养基上,在(25±1)℃的条件下培养诱导不定芽,在把不定芽移到MS+0.2mg/LNAA的培养基上生根,可得到再生植株。刘国民等Ⅲ1认为,黄秋葵的组织培养至少可以通过茎段培养(微扦插)和胚状体途径2种不同的方式实现植株再生和快速繁殖,并对黄秋葵体细胞进行液体悬浮培养和显微观察,为黄秋葵人1二种子的研制、胚胎学研究以及黄秋葵基因工程的研究r丁作奠定了基础。另外,同科的棉花的育种手段Et臻成熟及多样,这些都为黄秋葵的育种提供了很好的参考价值。
4结语
黄秋葵虽然还只是一种特色蔬菜,但随着人们生活水平的提高,对营养及保健的需求日益巨大,以及很多技术手段及各方面的发展,黄秋葵的遗传育种将有广阔的前景,更多具有不同功能的黄秋葵品种也会陆续面世。参考文献
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∞
筋
加
坫
加
,
0
万方数据
铆钉菇菌丝体液体培养条件及产胞外多糖的研究
作者:江洁, 兰黎雪, 宋红梅
作者单位:大连民族学院,生物技术与资源利用国家民委-教育部重点实验室,辽宁大连,116600
刊名:
安徽农业科学
英文刊名:JOURNAL OF ANHUI AGRICULTURAL SCIENCES
年,卷(期):2008,36(20)
引用次数:0次
参考文献(8条)
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3g/L,K2HPO41.5g/L,KH2PO40.8g/L,MnSO40.01g/L;适宜温度28℃,pH7.0,装液量250 mL三角瓶150mL,接种量15%.铆钉菇菌丝体液体培养7d,胞外多糖产量为4.54 g/L,比初始产胞外多糖1.28 g/L,提高了2.55倍.
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384.59μmo/L,显著增加。Cd(Ⅱ)6mg/L条件下,接种油松根系分泌苹果酸、柠檬酸含量分别为712.17与59.55μmol/g,比处理前有显著增加。
Cu(Ⅱ)6mg/L条件下接种油松分泌的草酸含量显著高于未接种油松,Cd(Ⅱ)6mg/L,条件下接种油松分泌的苹果酸和柠檬酸含量与未接种油松相比没有显著性差异。(3)Cu(Ⅱ)1.25,7.5mg/L 处理中,由于外延菌丝体的生长作用,草酸分泌量第一至二周基本持平,在第三周显著增加,而在
Cu(Ⅱ)15,30mg/L 高浓度处理中由于菌丝体生物活性受到抑制草酸持续减少。Cd(Ⅱ)0.1,0.2,0.4mg/L 处理下,接种油松分泌草酸含量均随时间变化连续增加,与未接种油松相比无显著著异。Cd(Ⅱ)0.8mg/L 处理下,接种比未接种油松分泌草酸含量显著提高。(4)外生菌根真菌 Gomphidius
viscidus对Cu(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)的平衡吸附量为Cu(Ⅱ)25.59、Cd(Ⅱ)59.66mg/g菌丝干重。(5)活菌的吸附能力在25℃时最强。Cu(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)处理下活菌分别在pH4利pH5时吸附能力最强。(6)活菌比死菌菌丝体对Cu(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)有更强的吸附能力,Cu(Ⅱ)为活菌60.5,死菌5.8mg/g菌丝干重Cd(Ⅱ)为活菌35.5,死菌5.3mg/g菌丝干重。
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,T.harzianum HDTP-3最低;M.hiemalis XSD-98 HDTP-5诱导粘盖牛肝菌所产中性蛋白酶活性极显著高于酵母粉和其他3种菌根伴生真菌,但其诱导褐黄牛肝菌和铆钉菇所产中性蛋白酶活性仅极显著高于其他3种菌根伴生真菌.[结论]4种菌根伴生真菌中,M.hiemalis XSD-98 HDTP-5是外生菌根真菌产中性蛋
白酶的最佳诱导底物;而4种外生菌根真菌中,褐黄牛肝菌所产中性蛋白酶活性最高.
5.学位论文淮稳霞北京东灵山地区三种外生菌根真菌遗传多样性研究2003
该实验采用RAPD和RAMS技术分别对北京市东灵山地区针叶林中的三种优势外生菌根真菌种群的遗传多样性及基因型结构进行研究.对33个棕灰口蘑子实体的RAPD分析表明:每一个子实体属于不同的基因型,该种群形成数量多的小基因型,即基因型不大于0.5m.RAMS分析将210个血红铆钉菇子实体和260个点柄乳牛杆菌子实体分别分为108和99个基因型,最大基因型分别是450m和84m.Shannon-Weaver多样性指数分析表明:棕灰口蘑、血红铆钉菇和点柄乳牛肝菌种群的遗传多样性指数分别为4.52、2.92和3.87.有性孢子的传播繁殖方式同时存在于这3种外生菌根真菌种群内,特别是棕灰口蘑种群的主要传播繁殖方式;血红铆钉菇和点柄乳牛肝菌种群地下菌丝体的生长、延伸也是重要的繁殖传播方式.
6.会议论文张茹琴.唐明.陈辉.胡彦江4种外生菌根真菌与立枯丝核菌的相互作用及与诱导水解酶的关系2007
对4种外生菌根真菌灰环粘盖牛肝菌(Suillus laricinus),绒粘盖牛肝菌(Suillus tomentosus),血红铆钉菇(Gomphidiusviscidus)和灰鹅膏菌(Aminita vaginata)与病原真菌立枯丝核菌(Rhiaoctonia solani)的相互作用,几丁质对4种外生菌根真菌几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的产酶及酶活力做了研究。结果表明,4种外生菌根真菌与R. solani对峙培养时,灰环粘盖牛肝菌、绒粘盖牛肝菌和灰鹅膏菌与R. solani存在相互抑制作用,但菌根真菌对R. solani的抑制作用大于R. solani对菌根真菌的抑制作用。灰环粘盖牛肝菌、绒粘盖牛肝菌与R. solani形成抑菌圈,致使后者菌丝体分枝增多、原生质浓缩、菌丝变褐,呈老化趋势;灰鹅膏菌对R. solani具有重寄生、消解作用;血红铆钉菇对R. solani无抑制作用,R. solani能够诱导血红铆钉菇加速生长。几丁质不能诱导4种外生菌根真菌产生胞外几丁质酶,但能够诱导胞外产生β-1,3-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶,且不同菌根真菌酶产生的时间及活力强弱存在差异。
本文链接:https://www.360docs.net/doc/bf12450161.html,/Periodical_ahnykx200820061.aspx
下载时间:2009年10月30日