大蒜多糖对伴刀豆蛋白A致肝损伤小鼠肝组织抗氧化能力的影响

小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察 实验报告

姓名班级 13级生命基地班学号同组者： 科目细胞生物学实验实验题目小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察 【实验题目】 小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察 【实验目的】 1、掌握线粒体的超活染色原理及方法。 2、观察动物肝细胞内线粒体的形态、数量与分布。 【实验材料与用品】 1. 试剂：0.02%的詹纳绿B染液、Ringer试剂 2. 器具：解剖盘、镊子、剪刀、双凹片、小烧杯、载玻片、盖玻片、胶头滴管、显微镜等 3. 材料：小鼠 【实验原理】 I.线粒体 线粒体是一种存在于大多数细胞中的由两层膜包裹的细胞器，直径在0.5-10微米左右；线粒体是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷的主要场所，为细胞的活动提供了能量，有“细胞动力工厂”之称。 线粒体在代谢活动旺盛的细胞，如肌肉细胞，肝细胞，神经细胞等中大量存在；线粒体的数量差异巨大，如在肝脏细胞中有1000-2000个线粒体，而有些细胞只有一个线粒体，如酵母菌细胞的大型分支线粒体，大多数哺乳动物成熟红细胞不具有线粒体。 线粒体分布方向与微管一致，通常分布在细胞功能旺盛的区域：如在肾脏细胞中靠近微血管，呈平行或栅状排列；在肠表皮细胞中呈两极分布，集中在顶端和基端，在精子中分布在鞭毛中区。

姓名班级 13级生命基地班学号同组者： 科目细胞生物学实验实验题目小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察 II.超活染色实验原理 超活染色也称活体染色，是指对生命有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法；超活染色的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞死亡。应用活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理病理状态。 活体染色根据染色剂的性质和染色方法不同分为：体内活染（注入、固定、堆积）、体外活染（分离、浸染、固定） 1）体内活染：是以胶体状的染料溶液注入动植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的作用。 2）体外活染：又称超活染色，它是由活的动植物分离出的细胞或组织小块，以染料溶液浸染，燃料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。 活体染色之所以能固定，堆积在细胞内某些特殊部分，主要是染料的“电化学”特性起到重要作用；碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染液的胶粒表面带阴离子，被染的部分本身也是具有阳离子或阴离子，这样它们彼此之间就发生了吸引作用，从而使样品着色。不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料。 活体染色剂的选择原则： 1、对细胞无毒性或毒性极小的染剂 2、具有电化学特性 3、配成稀淡的溶液来使用 4、具有专一性（特异性） 5、一般是以碱性染料最为适用，可能因为它具有溶解在类脂质（如卵磷脂、胆固醇等）的特性，易于被细胞吸收。 本实验采用的活体染色剂---詹纳斯绿B 詹纳斯绿B是毒性较小的碱性染料，可专一性的对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态--蓝绿色）；而线

17动物组织蛋白提取

1.组织块迅速置于预冷的生理盐水中，洗去表面的血迹，将组织称量后切成较小的组织块（0.2-1.0g），放入组织匀浆器中，按组织100mg：提取试剂体积1ml的比例加入相应体积的蛋白提取试剂（需提前加入酶抑制剂）进行匀浆，至组织研磨完全。 2.超声处理（同细胞蛋白样品的制备），处理完后置冰上裂解4-5小时。 3.10000 g/min离心10min，取中层溶液，加入等体积的蛋白上样缓冲液（2X），或1/4体积蛋白上样缓冲液（5x）（AR1112）,置100℃水浴箱沸水浴中变性5分钟。 1、动物肝脏直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次。 2、称量约40mg研磨组织，加入200 ul预冷的组织蛋白抽提试剂，冰上孵育20分钟。 3、10,000×g 离心15分钟。 4、收集上清，进行下一步的实验。 手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。 机器匀浆：用组织捣碎机10000～15000r/min上下研磨制成10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。 超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用40安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。 反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右），但有部分酶活力会受影响。 ①吸取培养基，预冷PBS清洗细胞三次，细胞刮刮脱细胞，收集至离心管，1000rpm离心5分钟。洗涤后的细胞转移至洁净EP管，②冰上操作，配制细胞裂解液，1ml Lysis,Buffer 中加入10 μl磷酸酶抑制剂、1 μl蛋白酶抑制剂、5μl 100mM的PMSF。混匀后冰上保存数分钟待用。③在洗涤好的细胞中按照每107个细胞加入1ml细胞裂解液的比例，加入细胞裂解液。200μl移液器反复吹打，至蛋白析出。④4℃摇床，温和振摇15分钟。⑤14000rpm，4℃离心15分钟，上清即为细胞全蛋白提取物。⑥BCA法测蛋白浓度。蛋白分装后保存于-70℃冰箱，避免反复冻融。提取细胞全蛋白整个过程中所有使用的物品及试剂均需预冷，防止蛋白降解。 细胞提取步骤 1. 冰上操作，向细胞沉淀中加入200ul细胞裂解液，2μl 100mM的PMSF。 2. 200μl移液器反复吹打，至溶液变得粘稠。 3. 4℃摇床，温和振摇30min。 4. 15000rpm，4℃离心15min，上清即为细胞全蛋白提取物 5. 蛋白分装后保存于-70℃冰箱，避免反复冻融。

铜蓝蛋白生理功能及其与疾病的关系

铜蓝蛋白生理功能及其与疾病的关系 时间：2015-11-25 来源：学术堂所属分类：生物化学论文 1 铜蓝蛋白的研究概况 铜蓝蛋白（EC 1. 16. 3. ）又称铜氧化酶，是Holmberg 和Laurell 于1948 年首先从人血清a2 -球蛋白中纯化出的一种外观呈蓝色的含铜糖蛋白，命名为铜蓝蛋白（Ceruloplasmin,Cp）[1],随后人们陆续在其他哺乳动物和鱼类中发现了Cp 的存在，而植物中也存在结构及功能相似的其他多铜氧化酶家族的成员[2] ,真菌中有Cp 的同源基因 Fet3. 因此，Cp 是广泛分布于各种真核生物中的一种含铜氧化酶，具有催化多种底物如铜、铁以及其他有机底物的氧化功能。脊椎动物中Cp 合成于肝脏并参与生物体铁的代谢，也在胚胎以及神经系统发育中起作用；在医学上Cp 是各种炎症、感染及肿瘤疾病的标志性蛋白；与人类Wilson病、遗传性铜蓝蛋白缺乏症等有十分密切的联系。因此，长期以来一直受到人们的关注[3]. 2 铜蓝蛋白的结构 人的Cp 基因位于8 号染色体，基因定位3q23 - q25,基因长度为65 kb,包含19 个外显子。人的Cp 蛋白是一条单一的多肽链，由1046 个氨基酸和附着在上面的4 个寡糖一氨基葡萄糖组成，相对分子质量约为132 kDa[4]. 二级结构测定表明，Cp 肽链中的β - 片层和无规卷曲约各占50% ,几乎没有α - 螺旋结构。单一的多肽链可被蛋白酶水解为3 组异体同形的单元，相对分子量分别为67 KD （480 个氨基酸残基）、50 KD（405 个氨基酸残基）及19 KD （159 个氨基酸残基）,在完整的多肽链中，3 个单元分别由单个氨基酸残基精氨酸R、赖氨酸K 连接[5]. Cp 有6 个紧凑的结构域能够结合6 个铜原子，位于一、六域交界面上的3 个铜原子形成一个三核铜簇，其他3 个铜原子以单核形式分别存在于二、四、六域（图1）. 三核铜簇不仅对于Cp 的催化活性有着重要作用，而且有助于Cp 结构的稳定[4].

木瓜蛋白酶的提取

木瓜蛋白酶的提取、分离纯化及其生物学研究综述及实验方法 13生物技术第二大组第二小组 组员：王玓玥（组长）、王子贺、王思瑶、王宇涛、王守鑫、谭国栋一、研究背景： 在经济飞速发展的今天，人们的生活水平已远远不只在于吃饱穿暖，食品的安全和营养问题受到人们越来越多的关注，绿色健康的生活也成为大家共同的追求，木瓜蛋白酶以它自身耐热及特殊结构等特点被广泛的用于食品行业，如何分离纯化得到高纯度低成本的木瓜蛋白酶则是人们现在研究的重点，本小组便也以此为研究主题展开实验。 二、木瓜蛋白酶基本介绍：木瓜蛋白酶，又称木瓜酶，是一 种蛋白水解酶。木瓜蛋白酶是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于巯基蛋白酶，它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，这种蛋白水解酶，分子量为23406，由一种单肽链组成，含有212个氨基酸残基。至少有三个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位，他们分别是Cys25、His159和Asp158，当Cys25被氧化剂氧化或与金属离子结合时，酶的活力被抑制，而还原剂半胱氨酸（或亚硫酸盐）或EDTA能恢复酶的活力木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观

为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性；木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。木瓜蛋白酶是一种含巯基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶 的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，但几乎不能分解蛋白胨。木瓜蛋白酶的最适合PH值6～7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点（pI）为8.75；木瓜蛋白酶的最适合温度55～65℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。。另外六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键,且都不在活性部位。纯木瓜蛋白酶制品可含有：（1）木瓜蛋白酶，分子量21000，约占可溶性蛋白质的10%；（2）木瓜凝乳蛋白酶，分子量26000，约占可溶性蛋白质的45%；（3）

用小鼠做实验的基本知识

用小鼠做实验的基本知识 1．实验动物环境可分为： 外环境。是指实验动物设施或动物实验设施以外的周边环境。如气候或其他自然因素、邻近的民居或厂矿单位、交通和水电资源等。 内环境。指实验动物设施或动物实验设施内部的环境。内环境又细分为大环境和小环境。前者是指实验动物的饲养间或实验间的整体环境状况;后者是指在动物笼具内，包围着每个动物个体的环境状况，如，温、湿度，气流速度，氨及其他气体的浓度，光照，噪音等等。实验动物环境条件,对动物的健康和质量,以及对动物实验结果有直接的影响，尤其是高等级的实验动物，环境条件要求严格和恒定。因而，对环境条件人工控制程度越高，并符合标准化的要求，生活这样环境中的动物，就越具有质量上的保证，一致性的程度就越高，动物实验结果就有更好的可靠性和可重复性，也使同类型的实验数据具有可比较的意义。 影响实验动物环境的因素及其控制： 气候因素。包括有温度、湿度、气流和风速等。在普通级动物的开放式环境中，主要是自然因素在起作用，仅可通过动物房舍的建筑座向和结构、动物放置的位置和空间密度等方面来作有限的调控。在隔离系统或屏障、亚屏障系统中的动物，主要是通过各种设备，对上述的因素予以人工控制。在国家制定的实验动物标准中，对各质量等级动物的环境气候因素控制，都有明确的要求。 理化因素。包括有光照、噪音、粉尘、有害气体、杀虫剂和消毒剂等。这些因素可影响动物各生理系统的功能及生殖机能，需要严格控制，并实施经常性的监测。普通级动物要在适当的范围内，采取有效的措施，对此予以监控;尤其是清洁级以上等级的动物，应通过实验动物设施内的各种设备，按国家颁布的各个等级标准，严格予以控制。 生物因素。是指实验动物饲育环境中，特别是动物个体周边的生物状况。包括有动物的社群状况、饲养密度、空气中微生物的状况等。例如，在实验动物中许多种类，都有能自然形成具有一定社会关系群体的特性。对动物进行小群组合时，就必须考虑到这些因素。不同种之间或同种的个体之间，都应有间隔或适合的距离。对实验动物设施内空气中的微生物有明确的要求，动物等级越高要求越为严格。国家标准规定，亚屏障系统设施内空气落下的菌数少于或等于12.2个/皿时，屏障系统2.45个/皿时，隔离系统0.49个/皿时。 2．对实验动物设施的环境条件，国家有标准化的规定，检测项目包括温度、相对湿度、气六速度、梯度压差、空气洁净度、空气落菌数、氨浓度、噪声、照度和换气量等。 环境检测的项目 空气洁净度的指标包括有：空气落菌数，是检测空气生物洁净度的指标，用血琼脂培养基，置于被检房舍的空间，暴露30分钟后，计算培养基上的落菌数;尘埃粒子测定，是空气洁净级别的指标，10-20平米的房间布点3-5个，用专用仪器测定，数据作统计分析。 此外还有下列七项指标的测定：温度、湿度测定，包括日温差、温湿度的均匀性等;气流速度测定，使动物处在合理的风速区域;换气次数，测定送风口或出风口的风速，然后参照风口面积和房间容积计算;静压差测定，用压差计测定设施内各区域的压差，分析设施内气流走向的合理性;噪声测定，用噪声计，选离墙壁1米，距地面1.2-1.5米的测点测定;照度测定，常用仪器是照度计，采用多测点测定，检测光照的均匀性;氨浓度测定，该检测项目通

总蛋白的提取

1.单层贴壁细胞总蛋白的提取： （1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 （2）每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 （3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。） （4 ）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 （5 ）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） （6 ）于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷） （7 ）将离心后的上清分装转移到0.5ml的离心管中放于－20℃保存。 2. 组织中总蛋白的提取： （1 ）将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。 （2）加400 μL单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。 （3 ）几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。 （4）裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。 3. 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取： 由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取： （1 ）将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。 （2 ）弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。 （3）用枪洗干上清后，加100 μL裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。 （4）将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。 含量测定

小鼠肝脏取材步骤

小鼠肝脏组织取材步骤 小鼠肝脏组织取材步骤，并列出完成此次实验所需要的试剂、仪器、材料等相关物品及实验人员安排情况。 材料：小鼠 试剂：DMEM 戊巴比妥钠 75%酒精 PBS 器械消毒液戊二醛 仪器：解剖台备皮刀弯盘组织剪眼科剪手术刀柄刀片血管钳眼科镊 培养皿无菌手套 实验人员安排：小鼠养殖管理组准备工作组实验操作组 实验步骤: 1. 取材前夜禁食，自由饮水。 2. 小鼠称重，按照50mg/kg的比例用5ml的注射器配合针头抽取戊巴比妥钠备用。 3. 正左手的小指和无名指抓住大鼠的尾巴，另外三个手指抓住大鼠的颈部，使大鼠头部向向下。这样腹腔中的器官就会自然倒向胸部，防止注射器刺入时损伤大肠、小肠等器官。右手持注射器，从腹部近腿根处刺入后再腹部皮下穿行深入，动作轻柔，缓慢注射。注射完药物后，缓缓拔出针头，手指按住针口对小鼠腹部轻柔按摩，促进麻醉药物的吸收，掐小鼠尾部检测小鼠麻醉程度。 4.将小鼠四肢固定于解剖台上，暴露小鼠整个胸部和腹部，修剪去腹部毛发，75%酒精消毒。 5.沿腹侧正中线自阴茎上源由下而上剪开腹部皮肤直至剑突，向两侧钝性剥开皮肤与皮下组织，暴露腹壁浅肌层。沿白线钝性分离腹壁肌肉，剪开腹膜，暴露腹腔，将肝脏向上翻起，显露肝门，眼科剪剪除肝脏周围结缔组织和血管。 6.结扎剪断肝门管道系统，钝锐结合完整取出大鼠肝脏，放置于无菌培养皿，生理盐水冲洗，称重并记录。①切取肝左叶约1mm×1mm×1mm组织3块，3-戊二醛磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/LP pH 7.4)或4-戊二醛固定；②左叶肝组织浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定；③右叶肝组织称重记录分装后全部放置于无菌冻存管液氮冰冻保存备用。 7.切取肝左叶约1mm×1mm×1mm组织3块，3-戊二醛磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/LP pH7.4)或4-戊二醛固定；左叶肝组织浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定；右叶肝组织称重记录分装后全部放置于无菌冻存管液氮冰冻保存备用。

胃蛋白酶提取的分离纯化

胃蛋白酶提取法中分离纯化技术的研究进展 摘要：本文就胃蛋白酶的生物提取法，对其在生产过程中的分离、纯化技术展开综述。其中，分离技术主要介绍了：盐析法、有机溶剂沉淀法、底物亲和法、透析法。纯化技术主要介绍了：凝胶过滤法、透析离子交换法。综合比较各分离纯化方法的特点，得到最优的分离纯化方法有机溶剂与盐析共沉淀法、膜分离技术、等电点沉淀法与底物亲和法。 关键词：胃蛋白酶分离纯化应用 ．生物提取法生产胃蛋白酶 1．1 工艺路线 （自溶、过滤）（脱脂、去杂质） 猪胃黏膜→自溶液→上清液 （浓缩、干燥） →胃蛋白酶成品 工艺过程 （1）原材料的选择和预处理：胃蛋白酶原主要存在于胃粘膜基底部，采集原料时剥取的粘膜直径大小与收率有关。一般取直径10cm、深2-3mm的胃基底部粘膜最适宜，每头猪胃平均剥取粘膜100g左右。（2）自溶、过滤：在夹套锅内预先加水100升及盐酸升，加热至50度时，在搅拌下加入200千克猪胃黏膜，快速搅拌使酸度均匀，保持45—48度，消化3-4小时，得自溶液。用纱布过滤除去未消化的组织尿蛋白，收集滤液。（3）脱脂、去杂质：将滤液降温至30℃以下，加入15-20％氯仿或乙醚，搅匀后转入沉淀脱脂器内，静置24-48小时，使杂质沉淀，分出弃去，得脱脂酶液。（4）浓缩、干燥：取清酶液，在40℃以下减压浓缩至原体积的1／4左右，再将浓缩液真空干燥。球磨过80-100目筛，即得胃蛋白酶粉。 2胃蛋白酶的分离技术 有机溶剂法

可用于胃蛋白酶的初步提取浓缩。通常使用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、异丙酮，其沉淀蛋白质的能力为：丙酮＞异丙酮＞乙醇＞甲醇。当然此顺序也不是一成不变的，因为还要受温度、pH、离子强度等因素的影响。丙酮沉淀能力最好，但挥发损失多，价格较昂贵，所以工业上常采用乙醇作为沉淀剂。 2．2盐析法 盐析法是酶制剂工业中常用方法之一，硫酸镁、硫酸铵、硫酸钠是常用的盐析剂，其中用的最多的是硫酸铵。美国专利（2，701,228）改进后，用锌盐沉淀胃酶。当母液含醇（或酮）在50%--55%、pH在—时几乎全部胃酶可以用醋酸锌沉淀，沉淀物为胃酶的锌盐，然后用金属螯合剂除去锌盐，得15000—16000倍活力的酶，收集率为%%。此法较上述有机溶剂沉淀所得的胃酶活力和得率都高。 底物亲和法 底物亲和法是利用酶（胃蛋白酶）与其底物（酪蛋白）的亲和性，从胃粘膜中提取得到胃蛋白酶。使底物和酶在的乳酸缓冲液中充分结合，然后调pH至4（底物的等电点）沉淀底物和酶的结合物，随后让沉淀物再溶解于乳酸缓冲液中，添加低浓度的SDS将底物和酶分离，得到酶—SDS复合物，再进一步分离纯化。陈躬瑞（2001）成功的应用此法对蛇胃蛋白酶进行了实验室分离，得率大约为30%。与传统的分离方法比较，此法具有简单高效的优点，为后续的纯化工艺避免了昂贵的活化试剂和配基的使用，同时具有较高的特异性。【2】 透析法 胃蛋白酶的分离过程中还经常用到透析法。该法是利用蛋白质大分子对半透膜的不可透过性而与小分子物质及盐分开的。由于透析主要是扩散过程，如果袋内外的盐浓度相等，扩散就会停止，因此要经常换溶剂，一般一天换2—3次。如在冷处透析，则溶剂也要预先冷却，避免样品变性。透析时的盐是否除净，可用化学试剂或电导仪来检测。【1】 3胃蛋白酶的纯化技术 凝胶过滤法

肝功能检验

第十三章肝功能检验 掌握:黄疸的发生机理、类型及实验室鉴别诊断要点；肝功能实验生化检查指标的种类和重点项目的测定方法及评价。 （一）胆红素代谢障碍（黄疸） 黄疸分类: 溶血性黄疸、肝细胞性黄疸、阻塞性黄疸 （二）胆汁酸代谢障碍 1、胆汁酸合成障碍、 2、胆汁酸向肠道排出障碍、3．胆汁酸肠肝循环紊乱、4．胆汁瘀积病变时胆汁酸代谢紊乱 （三）血浆酶异常 1．肝脏合成酶类:胆碱脂酶、凝血因子、铜蓝蛋白；2. 肝细胞内酶: ALT、AST 3．肝脏阻塞性疾病酶活性改变：ALP、GGT；4．肝硬化疾病酶活性改变：单胺氧化酶（MAO）（四）血浆蛋白异常 第二节肝功能试验 ?血清（浆）蛋白 ?血清酶测定 ?血清胆红素测定 ?血清胆汁酸测定 ?血氨测定 一、血清（浆）蛋白测定 （一）总蛋白、白蛋白、及白蛋白/球蛋白（A/G）比值测定 1．总蛋白测定：化学法(双缩脲法)、物理法、染料结合法、电泳法 2.白蛋白测定：染料结合法(BCG、BCP）、沉淀法 3．A/G比值 【参考范围】 总蛋白60～80g/L 白蛋白35～55g/L 球蛋白：15～32g/L A/G比值:1.5～2.0/1 临床意义：血中白蛋白（总蛋白浓度）减少: 见于严重肝病、肾病； A/G比值减少与A/G比值倒置：表示肝功能损害严重。 （二）纤维蛋白原测定（凝血因子Ⅰ） 测定方法：分为三大类 ①根据纤维蛋白原的生物学特性测定方 ②根据纤维蛋白原理化性质而建立的测定方法。 ③根据纤维蛋白原免疫学特点而建立的测定方法。

【临床意义】(1) 纤维蛋白原增加：①感染；②无菌炎症；③其它。 (2) 纤维蛋白原减少: ①严重的肝脏疾病；②其它疾病引起纤维蛋白原减少的疾病。（三）甲胎蛋白（α1-fetoprotein，AFP）测定 测定方法：酶联免疫吸附法、放射免疫分析法、斑点免疫结合法、火箭电泳放射自显影法、酶联火箭电泳法等 【参考范围】成人10～30g/L 、>400g/L作为肝癌诊断标准 【临床意义】(1) 原发性肝细胞肝癌的诊断标：400g/L(400ng/ml) ； (2)活动性急、慢性肝炎、肝硬化或其它肝病病人的诊断． （四）其它 1.铜蓝蛋白测定 【原理】铜蓝蛋白具有氧化酶活性 【参考范围】52.9～167.7 IU/L 【临床意义】肝豆状核变性（Wilson病）和遗传性色素沉积症． 2．转铁蛋白 【原理】双联吡啶法 【参考范围】TIBC 男50～77μmol/L 女54～77μmol/L , 转铁蛋白饱和度为33.0%～ 35.0% 【临床意义】遗传性血色素沉积症铁沉积 二、血清酶测定 ?（2）方法评价 ?①赖氏法的实验结果需与卡门分光法的结果对比后求出； ?②NaOH的浓度对显色有影响； ?③该法的重复性差。 【参考范围】5～25卡门氏单位 【临床意义】(1) 肝细胞损伤的灵敏指标；(2) 慢性活动性肝炎或脂肪肝：ALT轻度增高(100～200IU),或属正常范围. ALT测定连续监测法（速率法） （２）方法评价： ①存在着两个副反应，会使测定结果偏高； A、血清中存在的α-酮酸(如丙酮酸)能消耗NADH。 B、血清中谷氨酸脱氢酶(GLDH)增高时，在有氨存在条件下，亦能消耗NADH。 ②双试剂法，因温育期长，能有效地消除干扰反应，测定准确性高，是ALT测定的首选方法；③血清不宜反复冰冻保存，以免影响酶活性；避免使用溶血标本。 3.赖氏法测定AST （１）原理与方法评价（类似ALT测定） 【参考范围】8～28卡门氏单位 【临床意义】 增高见于：心肌梗死、肌炎、胸膜炎、肾炎及肺炎和各种肝病病人 4．连续监测法测定AST （２）方法评价 误差来源 内源性干扰:主要来自血清中高浓度丙酮酸和L-谷氨酸脱氢酶(GLDH)。 外源性:干扰来自试剂中污染的GLDH和AST。

实验小鼠

实验小鼠（laboratory mouse)学名(Mus muscculus)，实验小鼠来自于野生小鼠，经人们长期选择培育而成。18世纪就被用做动物试验，是目前应用最广泛、被研究的最清楚、最深入的实验动物。已育成的小鼠品种品系有500多种。 一、生物学特性 （一）、动物学分类位置 小鼠属于脊椎动物门，哺乳纲、啮齿目、鼠科、鼷鼠属、小家鼠种。 （二）、一般特性 1、外观：小鼠面部尖突，头呈锥体形，嘴脸前部两侧有19根触须，耳耸立呈半圆形，眼睛大。尾长约与身长相等，尾部覆有短毛和环状角质鳞片。健康小鼠皮毛光滑紧贴皮肤，四肢匀称，眼睛亮而有神。小鼠有多种毛色。 2、体形小，生命周期短，易于饲养管理。出生体重仅1.5克左右，一月龄体重约18--22克。成年小鼠每日食量5--8克，饮水4--7毫升，排粪1.4--2.8克/天，排尿1--3毫升/天。 3、性情温顺，胆小怕惊。 4、成熟早，繁殖力强。雌35--50日龄，雄45-60日龄就可性成熟，雌65--75日龄，雄70--80日龄可达体成熟。性周期4--5天，妊娠期19--21天，哺乳期20--21天，年产6--9胎。属全年多发情动物，产后即发情。 5、反应敏感，适应性差。对多种病原体、毒素及致癌物都很敏感，外界环境光照、噪音、营养、温度、空气质量等多种因素均可对小鼠造成影响。 6、昼伏夜动，喜欢啃咬。喜光线较暗的安静环境，进食、分娩都常发生在夜间，傍晚和黎明前是小鼠活动的两个高峰。 7、喜群居。 8、小鼠有20对染色体，推测有3万多个结构基因，已查明的已有648个。 9、寿命为2--3年。 （三）、解剖生理特点： 1、小鼠上、下颌各有两个门齿，六个臼齿，门齿终生不断生长，需经常磨损来维持齿端的长短，保持恒定。 2、小鼠下颌骨形态有品系特征，可用下颌骨形态分析技术进行近交系小鼠遗传监测。 3、内部脏器：食道细长约2cm，胃分前胃和腺胃，胃容量小（1--1.5ml),胃功能较差，不耐饥饿；有胆囊；胰腺分散在十二指肠、胃底及脾门处；无汗腺；淋巴系统发达；脾脏有明显造血功能；无腭或咽部扁桃体；左肺单叶，右肺四叶；骨髓为红骨髓而无黄骨髓，终生造血；雌鼠为双子宫型，呈Y字型，卵巢有系膜包绕，不与腹腔相通；乳腺发达，共有五对乳头，胸部3对，鼠蹊部2对；雄鼠睾丸大，幼鼠时藏于腹腔内，性成熟后下降到阴囊；前列腺分背、腹两叶。 二、在生物医学中的应用 （一）、药物研究 1、药物安全性评价 小鼠常用于药物的急性、亚急性、慢性毒性试验以及最大耐药量的测定等，“三致”试验也常用小鼠进行。 2、生物制品的检定 3、药物筛选 4、药效学评价试验

组织蛋白提取

1. 提取蛋白裂解液配方： 25 mM HEPEs PH:7.4 5 mM EDTA 5 mM EGTA 50 mM NaCl 1 mM Na3VO3(矾酸钠) 1 mM sodium phosphophate 0.05% SDS 0.05% sodium deoxycholate (脱氧胆酸盐) 1% Triton-X 100 5 mM NaF 0.1% 2-mercaptoethanol 1 mM PMSF (1ul 100mmol/L+纯水99ul) 1uM Microcysin-LR 40ug/ml pepstatin A 40ug/ml aprotinin 40ug/ml leupeptin 2..组织蛋白提取及定量： 称量组织重量置小烧杯 用PBS清洗1-2次 加入组织裂解液【悬浮buffer储存液500ml+苯甲基磺酰氟（PMSF，有毒物）30+leapeptin （蛋白抑制酶）0.5ul于EP管混合，倒入盛组织的烧杯】 置冰上5min 用眼科剪剪碎 倒入5ml匀浆器（反复抽吸匀浆组织） 倒入或吸入EP管 离心（4°C 1000g 10min）取上清 用于蛋白定量或储存于-80°C 蛋白定量 取5ul蛋白样本+15ul去离子水（DW）+200ulBCA（A:B为50:1即196:4），分别混合样本与DW和BCA的A液与B液置于干净的96孔板上37°C，30min

酶联免疫测OD值（570nm，ELX-800型酶标仪） 由OD值计算蛋白浓度（用excel表或用下列公式计算） （OD值×987.7108－198.342）×103ng/ul；OD=样本OD值－空白对照OD值）

菠萝蛋白酶提取方法的研究

菠萝蛋白酶提取方法的研究 本文主要研究了以菠萝废弃物为原料,采用硫酸铵盐析法结合超滤浓缩法的技术从菠萝皮中提取菠萝蛋白酶。首先,在硫酸铵盐析分离提取菠萝皮浸提液中菠萝蛋白酶的过程中,实验研究结果表明,硫酸铵液体加入法要优于固体加入法；随着菠萝皮浸提液的pH值的增大,菠萝蛋白酶的酶活回收率先增大后减小,pH值为7时,得到的菠萝蛋白酶酶活回收率最大,为83.6%；随着硫酸铵浓度的增大,菠萝蛋白酶的酶活回收率先增大后减小,当硫酸铵的饱和度达到40%的时侯,菠 萝蛋白酶的酶活回收率最大,为83.6%；在选定的实验温度范围内,随着温度的升高,菠萝蛋白酶的酶活回收率先增大后减小,20℃时菠萝蛋白酶的酶活回收率最大,为86.9%；随着盐析时间的增加,菠萝蛋白酶的酶活回收率先增大后减小,当盐析时间为60min时菠萝蛋白酶的酶活回收率最大,为89.2%。 其次,在超滤法浓缩提取菠萝皮浸提液中的菠萝蛋白酶的过程中,实验研究结果表明,选择截留分子量为20KD的超滤膜对菠萝皮浸提液进行超滤,收集其截留液,酶活截留率可达94%,或者选择截留分子量为100KD的超滤膜,酶活截留率为10.3%,可收集透过液；随着离心分离转速的增加,菠萝蛋白酶的酶活回收率逐渐增大,当离心分离转速当达到8000rpm转速时,菠萝蛋白酶的酶活截留率不再发生变化,为89.3%；使用20KD的超滤膜时,随着操作压力的增大,超滤膜的渗透通量先增大后减小,当操作压力为0.35MPa时,渗透通量达到最大值为 5.57L·m-2·h-1；使用100KD的超滤膜时,随着操作压力的增大,超滤膜的渗透通量先增大后减小,当操作压力为0.25MPa左右时,渗透通量达到最大值为 7.69L·m-2·h-1；无论是未经过处理,还是经过处理的超滤膜,随着使用次数的增加,其本身的渗透通量都逐渐减小,同时,经超滤菠萝皮浸提液得到的蛋白酶活

(整理)肝豆状核变性

肝豆状核变性( hepatolenticular degeneration，HLD)，又称为Wilson病(Wilson s disease，WD)，是一种常染色体隐形遗传的铜代谢缺陷病，发病率仅0.5/ 10 万～3/10 万，其基因定位于13q14. 3，编码1 个P 型ATP 酶，此酶参与铜跨膜转运的代谢过程。目前研究多认为由于WD 基因突变使其功能降低或丧失而导致铜代谢异常，肝合成铜蓝蛋白速度减慢，胆汁排铜明显减少，铜沉积于肝、脑、肾、角膜、血细胞和关节等组织中，引起了相应脏器损害的临床症状。铜蓄积可导致肝细胞坏死、肝纤维化；从坏死的肝细胞释放的大量铜可导致溶血，并逐渐沉积在脑、肾、角膜、骨关节部位，引起多器官受累。不同程度的肝细胞损害，脑退行性病变和角膜边缘有铜盐沉着（K-F环）为其临床特征。早期诊断和治疗可避免严重的不可逆的组织器官损害，常可获得与健康人一样的生活和寿命。 1921年Hall首先分析68例有血缘关系的HLD病人，其中34例至少与另一名患者有血缘关系，且绝大多数是表(堂)亲。因此Hall确信HLD属遗传性疾病，并且指出是由2个不同的隐匿性代谢缺陷的基因传递所致，其传递形式与常染色体隐性遗传相一致。我国调查167例HLD 先证者的家系，615位先证者及其同胞中，278人证实为HLD，按Hardy-Weinberg公式计算；(278－167)／(615－167)＝0.248。此值与常染色体隐性遗传的预期值0.25极接近，统计学无显著差异(P＞0.05)，符合常染色体隐性遗传。 肝豆状核变性的临床表现 肝豆状核变性是一种先天代谢缺陷病。其病理生理基础是铜代谢呈正平衡。全身组织内有铜的异常沉积。本病散见于世界各地不同的民族。从遗传学说研究估计本病发病率约为人口的16万分之一。我国(包括台湾)的不完全统计有220例。大多数在少年或青年期发病，以10～2 5 岁最多，男女发病率相等。幼儿发病多呈急性，在数月或数年内死亡，30岁以后发病多属慢性型。 (1)早期表现为一般消化道症状：消化不良、嗳气、食欲不振等，脾肿大、黄疸、肝功能异常、 类似肝炎，迁延不愈。以后肝脏缩小、质硬、表面有结节，发展为坏死性肝硬化。 (2)精神症状常表现为性格异常、忧郁、癔病样发作，以及智力、记忆力减退、言语等表达能力障碍。 (3)神经方面症状以锥体外系运动障碍为主：不自主运动、震颤、共济失调、甚至肌强直、全身痉挛。 (4)眼部出现Kayser-Fleischer角膜色素环。铜浓缩在溶酶体中，肝铜含量显著增加。血铜蓝蛋白浓度降低。铜在红细胞内沉着引起溶血性贫血和黄疸。白细胞的细胞色素氧化酶明显减少。 (5)肾脏损害主要表现为氨基酸尿、尿中铜、尿胆素原、钙、磷酸和尿酸的排泄量增加。磷、钙的丢失可引起骨、关节异常。 肝豆状核变性的病因和发病机理 肝豆状核变性的一系列病变是铜代谢障碍引起的。好发于10～25岁。正常人从食物中获取铜，95%的铜在肝脏内合成铜蓝蛋白，极少以直接反应铜存在。80%的铜从胆汁、粪便中排泄。Wilson病人肠道吸收铜增强，肝脏内有一种特异蛋白，对铜的亲和力强，可阻止铜蓝蛋白合成，血液中铜蓝减少。这种蛋白和铜结合松散，铜释放入血，铜盐沉积在肝脏、脑、肾、角膜等。有研究证实，肝细胞中异常蛋白称作金属硫团(Metallothionien)，与铜有极高亲和力，与铜形成不可溶聚集物，不能被酶分解，也不能从胆汁排出。这些聚集物沉积在肝脏、脑、肾、角膜，引起一系列毒性反应。 关于肝豆状核变性发生机制有以下几个学说：①该类患者胆汁中与铜结合的正常物质缺陷，可能是鹅脱氧胆酸与牛磺酸结合缺陷，导致胆汁分泌铜功能障碍。不支持这一学说的证据是：该类患者胆汁铜结合蛋白没有质的改变，而且没有证据表明该类患者存在胆酸代谢异常。②肝脏铜结合蛋白合成异常，导致蛋白对铜的亲合力增加，支持这一学说的证据有，Wilson病患者铜结合蛋

植物组织蛋白提取方法

植物蛋白质提取方法总汇 一、植物组织蛋白质提取方法 1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。 2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4小时）。 3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃ 4、提取上清液，样品制备完成。 蛋白质提取液：300ml 1、1Mtris-HCl（PH8） 45ml 2、甘油（Glycerol）75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g 这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！ 二、植物组织蛋白质提取方法 氯醋酸—丙酮沉淀法 1、在液氮中研磨叶片 2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。 3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm 以上1小时），然后真空干燥沉淀，备用。 4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。 5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。 药品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮。裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS 溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。 这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！

三、组织：肠黏膜 目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达 应用TRIPURE提取蛋白质步骤： 含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量） 倒转混匀，置室温10min 离心：12000 g，10min，4度，弃上清 加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE用量） 振荡，置室温20min 离心： 7500g，5 min，4度，弃上清 重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2次 沉淀中加入100％乙醇 2ml 充分振荡混匀，置室温20 min 离心： 7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀 1％SDS溶解沉淀 离心：10000g，10min，4度 取上清-20度保存（或可直接用于WESTERN BLOT） 存在的问题：加入1％SDS后沉淀不溶解，还是很大的一块，4度离心后又多了白色沉定，SDS结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。 解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2X BUFFER，然后煮5－10分钟，效果很好的。 四、植物材料：水稻苗，叶鞘，根 1、200毫克样品置于冰上磨碎 2、加lysis buffer，离心，10000rpm，4度，5min取上清 3、重复离心5min

利用石蜡切片对小鼠肝脏组织器官细微结构的观察

摘要：本文采用石蜡永久制片和光学显微摄像的方法对经过环磷酰胺处理过的小鼠肝脏的显微结构进行了研究，分析环磷酰胺对小鼠肝脏的显微结构产生的影响。结果表明，一定剂量的环磷酰胺对肝脏具有损伤作用。 关键词：小鼠肝脏石蜡切片 环磷酰胺( Cyclophosphamide, Cp) 是人工合成的氮芥类烷化剂。可以抑制细胞增殖，非特异性杀伤抗原敏感性小淋巴细胞，限制其转化为免疫母细胞，可以作为细胞周期非特异性广谱抗肿瘤药，被广泛用于治疗急慢性淋巴细胞性白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤等；但同时可以引起剂量依赖性肝损伤的副作用——原因可能是环磷酰胺主要代谢物丙烯对肝脏有毒副作用，能引起肝细胞坏死，肝小叶中心充血，同时伴有氨基转移酶含量升高的现象。 1 材料与仪器 1.1 实验材料 小白鼠 1.2 实验仪器： 镊子、毛笔、蜡杯、溶蜡箱、酒精灯、切片机、载玻片、盖玻片、染色缸、光学显微镜。1.3 试剂： 中性福尔马林固定液、各浓度酒精、二甲苯、石蜡、伊红染液、苏木精染液、加拿大树胶 2 实验方法 2.1 取材 用左手拇指和食指捏住小白鼠头的后部，并用力下压，右手抓住鼠尾，用力向后上方拉，即可使颈椎脱臼，小白鼠瞬间死亡。取肝组织。 2.2 固定 将小鼠肝脏块投入中性福尔马林固定液中固定。 2.3 脱水 将组织经各浓度酒精各1 h，95%、100% 的酒精各两次，每次30 min。 2.4 透明 将组织块置于酒精二甲苯混合液中15 min，再将组织块置于二甲苯中透明两次，每次10 min。最后将组织块置于二甲苯石蜡混合液中20 min。

2.5 透蜡 将组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温，共三次，前两次45 min，第三次 30 min。 2.6 包埋 向纸盒中倒入少许石蜡，将组织块用镊子夹取到纸盒中，放入盛有冷水的盆中使其凝固。2.7 切片 右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，当切成的蜡带到一定长度时，将蜡带放在纸上。 2.8 贴片、展片 选取蜡带放置在载玻片上。将载玻片放置在机器上进行展片，待蜡带完全展开时将载玻片拿下，放入盒内。 2.9 脱蜡复水 将石蜡切片经二甲苯Ⅰ脱蜡 20 min，二甲苯Ⅱ脱蜡 10 min，然后放入各级酒精溶液中各2 min，蒸馏水中2 min。 2.10染色 将石蜡切片在苏木精染液中浸40min，然后蒸馏水涮洗几次至发蓝（约2min），镜检。 2.11 脱水Ⅰ、复染、脱水Ⅱ 将镜检合格的石蜡切片依次在各级酒精中浸2min，再在伊红水溶液浸二十至三十秒，再依次在95%、纯酒精Ⅰ、纯酒精Ⅱ中各浸 3 min。 2.12 透明 将石蜡切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各 3 min。 2.13封藏：中性树胶封存 将载玻片取出，在切片中央滴一滴树胶，用镊子盖上盖玻片。 3 小鼠肝脏石蜡切片观察 见下图：

实验四 肝组织中核酸的提取和鉴定

实验四 肝组织中核酸的提取和鉴定 【目的】 验证核酸的三大组成成分。熟悉组织中核酸的提取与鉴定的基本操作方法。 【原理】 动物组织细胞中的核糖核酸（RNA ）与脱氧核糖核酸（DNA ）大部分与蛋白质结合而形成核蛋白。被三氯醋酸沉淀的核蛋白，先用95%的乙醇加热去除附着在沉淀上的脂类杂质，再用1.7mol/L NaCl 溶液提取出核酸的钠盐，然后加入乙醇即可使核酸钠盐沉淀析出。 RNA 与DNA 均可被硫酸水解产生磷酸、含氮碱基(嘌呤与嘧啶)及戊糖（RNA 为核糖，DNA 为脱氧核糖）。此三类物质分别可按照下述原理鉴定。 1.磷酸 磷酸与钼酸铵试剂作用生成黄色磷钼酸，磷钼酸中的钼在有还原剂（硫酸亚铁）存在时可被还原成蓝色的钼蓝。根据此呈色反应即可鉴定磷酸的存在。 2.嘌呤碱 根据嘌呤碱能与硝酸银产生灰褐色的絮状嘌呤银化合物而鉴定。 3.戊糖 根据核糖经浓盐酸或浓硫酸作用则生成糠醛，后者能与3，5二羟甲苯缩合而形成绿色化合物而鉴定。 CHO C H C H C H CH 2OH OH OH OH O CHO O H CH 3 C O CH 3 O C H 3OH -H 2O 核糖 3，5-二羟甲苯 糠醛 绿色化合物 脱氧核糖在浓酸中生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，它和二苯胺作用生成蓝色化合物。 CHO C H C H C 2OH H H O -H 2O 浓酸脱氧核糖 蓝色化合物 CHO C H C H C H CH 2OH H OH OH ω-羟基-γ-酮基戊醛 二苯胺 【器材】 剪刀、镊子、玻棒、滤纸、试管、试管架、蒸发皿、匀浆器、离心机、沸水浴箱。 【试剂 1.生理盐水。

植物蛋白酶提取纯化工艺

植物蛋白酶提取纯化工艺 生物工程09-2班陈福泉学号：3090343214 一、实验目的 1、了解植物蛋白酶常用的提取纯化方法的基本原理和基本操作； 2、掌握双水相和反胶束萃取的原理和操作步骤； 3、掌握蛋白质含量和蛋白酶酶活的检测方法 二、实验原理 植物蛋白酶常用的提取纯化方法有缓冲盐溶液提取、初步纯化的方法有有机溶剂法、乙醇粉法、丙酮粉法、盐析法、双水相法、反胶束萃取法等 以pH6.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液为提取溶剂所得酶活力较高，最佳工艺为：以pH6.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液25℃提取2次，料液比1∶1；应用硫酸铵盐析及透析袋透析对粗酶液进行纯化，粗酶液再以60%硫酸铵盐析24h，透析袋（14000）低温透析12h，冻干；酶学性质研究表明：生姜蛋白酶以酪蛋白为底物其最适pH值为 6.0，30℃保温30min，酶活稳定。 三、实验材料 材料与试剂 新鲜生姜、酪蛋白（化学纯）、考马斯亮蓝G-250、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、无水碳酸钠、碳酸氢钠、柠檬酸、硫酸铵、丙酮等试剂均为分析纯。 0.01%（w/v）考马斯亮蓝G-250溶液：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL 90%vol乙醇中，加入85%正磷酸100mL，蒸馏水定容至1000mL。 0.5%酪蛋白溶液：称取0.5g酪蛋白，先用少量0.55mol/L碳酸钠溶液润湿，再加少量 0.02 mol/L pH7.5的磷酸缓冲液稀释，水浴中煮沸溶解，定容至100mL。 四、实验步骤 方法一：生姜蛋白酶提取液制备: 取定量新鲜生姜,切成小块后加入10 倍体积的pH 6. 0, 0. 2 mol/ L 磷酸缓冲液( 4 e ) , 于粉碎机中匀桨, 8 层纱布过滤后于4000 rpm 离心10 min, 吸取上清液, 加入高饱和度的( NH4) 2SO4 液使盐析体系中( NH4) 2SO4 终饱和度为60% , 4000 rpm 离心15 min。收集上层不溶物, 用少量pH 7. 50 的柠檬酸缓冲液溶解, 在4 e 下对同种缓冲液透析8 h。透析液定容, 即为生姜蛋白酶提取液。 方法二：生姜蛋白酶的提取取外形完好、无机械损伤和腐烂、富含纤维的生姜，切成小块，与磷酸缓冲液（0.03mol/L，pH7.5，内含1 mmol/L EDTA和5mmol/L L-半胱氨酸）按料液比1：2打浆，所得浆液低速搅拌20m i n，搅拌过程中缓慢加入20％（m/v）固体硫酸铵，四层纱布过滤后，将姜汁4℃下静置2h，离心（4 800rpm，5min）去除沉