PET表达载体介绍及相关问题

PET表达载体介绍及相关问题
PET表达载体介绍及相关问题

原核&真核表达载体构建

原核、真核表达载体构建 真核表达载体和原核表达载体的区别:主要是因为原核和真核表达系统所需的表达元件不同。 比如说启动子,终止子在两种表达系统中是不一样的。 带有真核表达元件的是真核载体,能在真核生物内表达; 带有原核表达元件的是原核载体,能在原核生物内表达。两者都具有的为穿梭载体。 ㈠原核表达载体指:能携带插入的外源核酸序列进入原核细胞中进行复制的载体。 原核表达载体调控原件 1.启动子 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列,它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子,基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子,因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成,对mRNA的合成极为重要。在转录起始点上游5~10 bp处,有一段由6~8个碱基组成,富含A和T的区域,称为Pribnow 盒,又名TATA 盒或-10区。来源不同的启动子,Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游35 bp 处,有一段由10 bp组成的区域,称为-35区。转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。-35区与RNA聚合酶s亚基结合,-10区与RNA聚合酶的核心酶结合,在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链,RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键,以后在RNA聚合酶作用下向前推进,形成新生的RNA 链。原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。 2. SD序列 1974年Shine和Dalgarno首先发现,在mRNA上有核糖体的结合位点,它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3~10 bp处的由3~9 bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸,刚好与16S rRNA 3¢末端的富含嘧啶的序列互补,是核糖体RNA的识别与结合位点。以后将此序列命名为Shine-Dalgarno序列,简称SD序列。它与起始密码子AUG之间的距离是影响mRNA转录、翻译成蛋白的重要因素之一,某些蛋白质与SD序列结合也会影响mRNA与核糖体的结合,从而影响蛋白质的翻译。另外,真核基因的第二个密码子必须紧接在ATG 之后,才能产生一个完整的蛋白质。 3.终止子 在一个基因的3¢末端或是一个操纵子的3'末端往往有特定的核苷酸序列,且具有终止转录功能,这一序列称之为转录终止子,简称终止子(terminator)。转录终止过程包括:RNA聚合酶停在DNA模板上不再前进,RNA的延伸也停止在终止信号上,完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来。对RNA聚合酶起

克隆载体与表达载体

克隆载体:大多是高拷贝的载体,一般是原核细菌,将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接,再导入原核细菌内,质粒会在原核细菌内大量复制,形成大量的基因克隆,被克隆的基因不一定会表达,但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段,这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。 克隆载体(Cloning vector ):携带插入外源片段的质粒或噬菌体,从而产生更多物质或蛋白质产物。 (这是为携带”感兴趣的外源DNA实现外源DNA勺无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。) 其中,为使插入的外源 DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。 是否含有表达系统元件,即启动子 -- 核糖体结合位点 -- 克隆位点 -- 转录终止信号,这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。 表达载体:有的是高拷贝的,有的是低拷贝的,各有各的用处,是一些用于工程生产的细菌,被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达,生产出我们需要的产物,导入的基因是由克隆载体产出的。表达载体具有较高的蛋白质表达效率,一般因为具有强的启动子。 表达载体( Expression vectors )就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等),是目的基因能够表达的载体。如表达载体 pKK223-3 是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中,有一 个杂合tac强启动子和终止子,在启动子下游有RBS位点(如果利用这个位点,要求与ATG之间间隔5-13bp),其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。 (RBS位点:1974年Shine和Dalgarno首先发现,原核生物,在 mRNAk有核糖体的结合位点,它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3?10 bp处的由3 —9bp组成的序列。这段序列富含嘌吟核苷酸,刚好与16S rRNA 3,末端的富含嘧啶的序列互补,是核糖体 RNA的识另U与结合位点。根据发现者的名字,命名为 Shine-Dalgarno 序列,简称 S-D 序列。 由于它正好与30S小亚基中的16s rRNA3 '端一部分序列互补,因此 S-D序列也叫做核糖体结合序列。 真核生物存在于真核生物mRNA勺一段序列,其在翻译的起始中有重要作用。加Kozark sequence(GCCACC), Kozak sequence 是用来增强真核基因的翻译效率的。是最优化的ATG环境, 避免 ribosome 出现 leaky scan ) 克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒,所以常带有较强的自我复制元件,如复制起始位点等,往往在菌体内存在多拷贝,所以抽质粒会抽出一大堆。但不具备表达元件。而表达质粒有复杂的构成,为的是控制目标蛋白的表达,如各种启动子(T7),调节子(LacZ)等,而且以pET为代表的表达载体在菌体内 都是低拷贝的,防止渗漏表达。 克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了,不管读码框什么的,但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面,而且要表达蛋白,所以就要求你的读码框不能乱了,否则就不能得到你想到的表达产物。 1. 载体即要把一个有用的基因(目的基因——研究或应用基因)通过基因工程手段送到生物细胞(受体细 胞),需要运载工具(交通工具)携带外源基因进入受体细胞,这种运载工具就叫做载体(vector )。2. 载体的分类 按功能分成:( 1)克隆载体 : 都有一个松弛的复制子,能带动外源基因,在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段(基因)的载体。(2)表达载体:具有克隆载体的基本元件(ori,Ampr,Mcs等)还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。 按进入受体细胞类型分:( 1 )原核载体( 2)真核载体( 3)穿梭载体( sbuttle vector )指在两种宿 主生物体内复制的载体分子,因而可以运载目的基因(穿梭往返两种生物之间).

pET-41b(+)大肠杆菌表达载体说明

pET-41b(+) 编号 名称 北京华越洋VECT--‐540 pET--‐41b(+) pET41b载体基本信息 别名: pET41b, p ET 41b 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点,限制性内切酶 载体大小: 5932 b p 5' 测序引物: T7或pGEX--‐5‘ 5' 测序引物序列: T7: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3'; pGEX--‐5': 5'--‐GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG--‐3' 载体标签: N--‐GST, N--‐His, N--‐Thrombin 载体抗性: Kanamycin 备注: Encodes GST fusion tag; Nterm thrombin cleavage site; Nterm enterokinase c leavage s ite; P shAI b lunt c loning s ite; a,b,c v ary b y M CS 稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 组成型 Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒 pET41b载体质粒图谱和多克隆位点信息

Feature N ame Start End T7_terminator 120 1 T7_Terminal_primer 69 87 EK 278 264 S15 353 309 6xHIS 413 396 GST (variant) 1094 444 T7_transl_en_RBS 1119 1103 lacO 1164 1137 T7_promoter 1182 1164 tet (300 --‐ 563) 1218 1481 pBRrevBam_primer 1289 1270 lacI 1564 2655 ROP 3227 3418 pGEX_3_primer 3434 3412 pBR322_origin 4452 3833

原核表达载体的重要调控元件

原核表达载体的重要调控元件 启动子 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列,它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子,基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子,因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。 原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成,对mRNA的合成极为重要。在转录起始点上游5~10 bp处,有一段由6~8个碱基组成,富含A和T的区域,称为Pribnow 盒,又名TATA 盒或-10区。来源不同的启动子,Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游35 bp处,有一段由10 bp组成的区域,称为-35区。转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。-35区与RNA聚合酶s 亚基结合,-10区与RNA聚合酶的核心酶结合,在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链,RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键,以后在RNA聚合酶作用下向前推进,形成新生的RNA链。 原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lP L (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。 (1)Lac启动子:它来自大肠杆菌的乳糖操纵子,是DNA分子上一段有方向的核苷酸序列,由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因(O)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。Lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控通过CAP(catabolite gene activation protein)因子和cAMP 来激活启动子,促使转录进行。负调控则是由调节基因产生LacZ阻遏蛋白,该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。乳糖及某些类似物如IPTG可与阻遏蛋白形成复合物,使其构型改变,不能与O基因结合,从而解除这种阻遏,诱导转录发生。 (2)trp启动子:它来自大肠杆菌的色氨酸操纵子,其阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性。当缺乏色氨酸时,该启动子开始转录。当色氨酸较丰富时,则停止转录。b-吲哚丙烯酸可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合,解除阻遏蛋白的活性,促使trp启动子转录。 (3)Tac启动子:Tac启动子是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动子,受Lac阻遏蛋白的负调节,它的启动能力比Lac和trp都强。其中Tac 1是由Trp启动子的-35区加上一个合成的46 bp DNA片段(包括Pribnow 盒)和Lac操纵基因构成,Tac 12是由Trp的启动子-35区和Lac启动子的-10区,加上Lac 操纵子中的操纵基因部分和SD序列融合而成。Tac启动子受IPTG的诱导。

克隆载体表达载体构建详细版

一、稀释引物 1、4℃,15min、13000转离心(先等离心机降温) 2、根据OD值加DD水。 3、静置30min(冰上) 4、准备1.5毫升EP管,并加90ulDD水。 5、向EP管中加10ul引物,震荡离心,-20℃保存。 二、跑MIX检测引物(20ul体系)、 上引物0.8ul 下引物0.8ul Mix 10ul DNA(日本晴)1ul DD水7.4ul 三跑高保真酶(50ul体系) DNAorCDNA 2ul 上引物2ul 下引物2ul 5*buffer 10ul dNTPs 5ul DD水28ul Pfu(最后加)1ul 四胶回收流程 1、在紫外线下切胶,用牙签装入2ml的EP管中。 2、按量加XP2,放在55℃水浴锅中10min,每2min摇匀1次,涡旋,短离。 3、将液体冷却到室温,转移到平衡住中,离心10000转,1min30s,倒掉滤液。 4、加入xp2 300ul,离心10000r,1min30s,倒掉滤液。 5、加入spw700ul,离心10000r,1min,倒掉滤液(重复一次) 6、空转2min,13000r,之后换1.5mlEP管。 7、套上保鲜膜放入37℃烘箱中,30min。 8、加入DD水10ul,静置2min,离心2min,13000r,重复3次,-20℃保存。 五、胶回收产物检测(10ul)体系 上引物0.4ul 下引物0.4ul Mix 5ul 回收产物1ul DD水 3.2ul 六、构建blunt cloning 载体(克隆载体)(4ul 体系) 胶回收产物 3.5ul Blunt cloning 0.5ul 混匀后,PCR:25℃15min 盖子温度50℃

真核细胞常见表达载体

真核细胞常见表达载体 真核细胞, 表达载体 1、pCMVp-NEO-BAN载体 特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对,主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成,在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是,由于该真核细胞表达载体中抗neo 基因存在,转染细胞后,用G418筛选,可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。 2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白,在PCMV启动子驱动下,在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成,能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外,载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制,而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点,将外源基因扦入这些位点,将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。 3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因,在PCMV启动子驱动下,在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin 抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成,能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外,载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制,而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白,该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白,因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 4、pSV2表达载体 特点:该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的,克隆位点为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因,故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。 5、CMV4 表达载体 特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动,多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是,该表达载体不含有neo基因,转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。 其他常用克隆Vector: pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25 ug pUC19 DNA 25 ug 说明: pBluescript II kS、pUC18 &Puc19载体适合于DNA片段的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等。这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点,当外源DNA片段扦入,转化lacZ基因缺乏细胞,并在含有IPTG和X-gal的培养基上培养时,含有外源DNA载体的细胞将

pET-SUMO大肠杆菌表达载体说明

pET-SUMO 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT4790 pET--‐SUMO pETsumo载体基本信息 载体名称: pET--‐SUMO 质粒类型: 大肠杆菌表达载体 高拷贝/低拷贝: 低拷贝 启动子: T7 和 lacO 克隆方法: TA C loning 载体大小: 5643bp 5' 测序引物及序列: T7 F orward 3' 测序引物及序列: --‐--‐ 载体标签: His T ag(6x);SUMO T ag 载体抗性: 卡那霉素 筛选标记: --‐--‐ 备注: 宿主菌株BL21(DE3);IPTG诱导 稳定性: --‐--‐ 组成型: 诱导型 病毒/非病毒: 非病毒 pETsumo载体质粒图谱和多克隆位点信息

pETsumo载体简介 The Champion pET--‐SUMO Expression System produces the highest levels of soluble protein i n E. c oli. I t u tilizes a s mall u biquitin--‐related m odifier (SUMO) f usion, b elonging t o the growing family of ubiquitin--‐related proteins, to enhance the solubility of expressed fusion proteins. In contrast to ubiquitin, SUMO is involved in the stabilization and localization of proteins in vivo. After expression, the 11 kd SUMO moiety can be cleaved by the highly specific and active SUMO (ULP--‐1) protease at the carboxyl terminal, producing a native protein*. The Champion pET SUMO Protein and Peptide Expression System o ffers: Greatly enhanced solubility with an N--‐terminal SUMO fusionHighly efficient cleavage--‐ produces n ative p rotein o f i nterest w ith S UMO (ULP--‐1) p rotease*Highly s pecific c leavage--‐ eliminates the chance of your protein of interest being internally digested, regardless of its a mino a cid s equenceSignificantly i ncreased s tability w ith S UMO f usion--‐can b e u sed f or small peptide productionT7lac promoter for high--‐level protein expressionN--‐terminal 6xHis t ag f or p rotein d etection a nd p urification. pETsumo载体序列

想和大家讨论讨论原核表达载体

【建议】想和大家讨论讨论原核表达载体 原核表达载体,如pet系列,型号从小到大,那么多,往往让新手选择起来不知所措。所以希望和大家讨论讨论到底他们是怎么演变的,每个的优缺点,是不是号越大的就越好等新手们往往困惑不已的问题。 希望下面的讨论分系列进行,如pet系列、pgex系列等 这篇文章是我从网上找的关于pet载体的介绍,只要你耐心的看完,相信能有个基本的了解关于pet载体及应用。更详细的内容请高手进行补充 pET,原核表达金标准(转) pET 载体中,目标基因克隆到T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下,并通过在宿主细胞提供T7 RNA 聚合酶来诱导表达。Novagen 的pET 系统不断扩大,提供了用于表达的新技术和选择,目前共包括36 种载体类型、15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。 优点 ·是原核蛋白表达引用最多的系统 ·在任何大肠杆菌表达系统中,基础表达水平最低 ·真正的调节表达水平的“变阻器”控制 ·提供各种不同融合标签和表达系统配置 ·可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌 ·许多载体以LIC 载体试剂盒提供,用于迅速定向克隆PCR 产物 ·许多宿主菌株以感受态细胞形式提供,可立即用于转化 阳性pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。 pET 系统概述 pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。根据最初由Studier 等开发的T7 启动子驱动系统,Novagen 的pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。 控制基础表达水平 pET 系统提供6 种载体- 宿主菌组合,能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白,所以进行优化选择是必要的。 宿主菌株 质粒在非表达宿主菌中构建完成后,通常转化到一个带有T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌(λ DE3 溶原菌)中表达目标蛋白。在λ DE3 溶原菌中,T7 RNA 聚合酶基因由lacUV5 启动子控制。未诱导时便有一定程度转录,因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。而宿主菌带有pLysS 和pLyE 时调控会更严紧。pLys 质粒编码T7 溶菌酶,

各种表达载体

表达载体 一、原核细胞表达载体 1. pBAD载体: 特点; 该表达质粒含有araBAD(arabinose)操纵子的P BAD启动子和编码该启动子的正负调控子基因araC,具有紧密调控功能和高水平表达外源蛋白质的原核细胞表达载体。 请注意: 1. 当要扦入其他信号肽片段,改建此载体时,请不要利用该载体上的Nde1 EcoR1 BamH1 Kpn1和 Pst1位点,以免造成重组困难,因为前述内切酶在此载体上均有二个位点,最好使用只有一个酶切位点的Sac1和Hind111位点。同时记住,如在不含任何信号肽的P BAD表达质粒扦入信号肽,其非编码N- 末端要包含核糖体结合位点(RBS)核苷酸序列。 2在使用含Omp A分泌信号肽的P BAD表达质粒时,请应用Omp A分泌信号肽上的Sac1以及载体Hind111酶切位点,这些在载体序列上都是单个酶切位点。 本公司目前有含Omp A分泌信号肽和不含任何信号肽的二种P BAD表达质粒,其多克隆位点区域图谱如下: (a)、含Omp A分泌信号肽的P BAD表达质粒多克隆区域 SD P BAD….TACCCGTTTTTTT CC….GCTAGCAGGAGGAAACG ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGT A M A E L TTC GCT ACC GTA GCC ATG GCC GAG CTC GGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTT Nco1 Sac1 Kpn1 Smal1 BamH1 (b)、不含分泌信号肽的P BAD表达质粒多克隆区域 Pst1 P BAD GCTAGCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTT Nde1 Sac1 Smal 1 Hind111 下图显示本公司应用pBAD表达载体完成的实验结果: pBAD载体驱动大分子蛋白质在原核细胞 Origami(DE3)内高效表达 2. pCAl-n & pCAl-pelB载体 特点: 该原核细胞表达载体是来源于以T7 RNA聚合酶为基础的pET载体, 含有T7/LacO启动子、编码钙调素结合多肽标鉴和凝血酶切点的核苷酸序列。 因此,该表达载体在E.coli BL21(DE3)或BL21(DE3)pLysS宿主菌中能高水 平表达外源蛋白质、且这种表达的外源蛋白质因带有钙调素结合多肽和凝血 酶切点,故该蛋白产物易于纯化和产业化。 此外,本公司利用分泌信号肽PelB,构建成新型的的原核细胞表达载体Pcal-PelB。此载体表达的蛋白产物能在分泌肽PelB的指引下进入细胞周质。

表达载体的构建方法及步骤

表达载体的构建方法及步骤 令狐采学 一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前,载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。 一个合格质粒的组成要素: (1)复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而 真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。 (2)抗生素抗性基因可以便于加以检测,如Amp+ ,Kan+ (3)多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 (4)P/E 启动子/增强子 (5)Terms 终止信号 (6)加poly(A)信号可以起到稳定mRNA 作用 选择载体主要依据构建的目的,同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目 的是要表达一个特定的基因,则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点: 【1】构建DNA 重组体的目的,克隆扩增/基因表达,选择合适的克隆载体/表达载体。 【2】.载体的类型:

(1)克隆载体的克隆能力-据克隆片段大小(大选大,小选小)。如<10kb 选质粒。 (2)表达载体据受体细胞类型-原核/真核/穿梭,E.coli/哺乳类细胞表达载体。 (3)对原核表达载体应该注意:选择合适的启动子及相应的受体菌,用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位;表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。 【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异,适应目的基因与载体易于链接,不能产生阅读框架错位。 综上所述,选用质粒(最常用)做载体的5点要求: (1)选分子量小的质粒,即小载体(1-1.5kb)→不易损坏,在细菌里面拷贝数也多(也有大载 体); (2)一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束,一般10个以上的拷贝,而严谨型质粒<10个。 (3)必需具备一个以上的酶切位点,有选择的余地; (4)必需有易检测的标记,多是抗生素的抗性基因,不特指多位Ampr(试一试)。 (5)满足自己的实验需求,是否需要包装病毒,是否需要加入荧光标记,是否需要加入标签蛋白,是否需要真核抗性(如Puro、G418)等等。 无论选用哪种载体,首先都要获得载体分子,然后采用适当的限制酶将载体DNA 进行切割,获得线性载体分子,以便于与

pET-48b(+)大肠杆菌表达载体说明

pET-48b(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT4670 pET--‐48b(+) pET48b载体基本信息 别名: pET48b, p ET 48b 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点,限制性内切酶 载体大小: 5605 b p 5' 测序引物序列: T7: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3'; Trx--‐F: 5'--‐TTCCTCGACGCTAACCTG--‐3' 3' 测序引物序列: T7t: 5'--‐TGCTAGTTATTGCTCAGCGG--‐3' 载体标签: N--‐Trx, N--‐His,N--‐HRV 3C, C--‐S, C--‐Thrombin 载体抗性: Kanamycin (卡那霉素) 备注: Same as pET47 but also has Nterm Trx Tag; contains HRV 3C Protease cleavage site for fusion tag removal at low temperatures; Cterm thrombin c leavage s ite. 稳定性: 瞬时表达 组成型: 组成型 病毒/非病毒: 非病毒 pET48b载体质粒图谱和多克隆位点信息

pET48b载体简介 pET--‐48b载体含有N端Trx和His标签,在标签后面紧跟着的是HRV 3C蛋白酶切位点。HRV 3C蛋白酶能够高特异性的识别LEVLFQ↓GP蛋白序列,能够在低温下高效切割掉融合标签序列。pET--‐48b载体还含有一个可选择的C端Thrombin蛋白酶切位点,紧接着位点后是S标签。 pET48b载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒图谱。注意:载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的,所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的。 T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。质粒的F1复制子是被定向的,所以在T7噬菌体聚合酶的作用下,包含有蛋白编码序列的病毒 粒子能够

重组表达质粒的构建——原核表达载体选择

重组表达质粒的构建——原核表达载体选择质粒载体是重组蛋白表达的关键工具,其结构如下图。重组蛋白表达,我们首先要将基因插入到表达载体上,插入的位置为多克隆位点。质粒载体上有很多的功能元件,这些元件对于蛋白的表达都是至关重要的。尽管我们经过系统的分析和预测,但是仍有很多蛋白不能顺利表达、表达量很低或者表达状态不好。这个时候我们需要尝试构建不同的表达载体以期得到最好的效果,这些载体的主要区别是启动子和融合标签的差异。 蛋白表达优化主要工作也就是尝试构建不同融合表达标签,使用不同的宿主表达菌,测试不同的表达条件,筛选出最优表达体系。常用的融合标签有GST、MBP、Trx、6His、SUMO等,这些标签主要功能是促表达、促可溶、信号标记或助纯化。福因德生物可以提供以下系列载体以供科研表达研究。 1)促表达/促溶标签 2)信标标签

3)纯化标签 我们选择表达载体的时候不但要考虑蛋白怎么表达成功,更要考虑蛋白怎么纯化出来,纯化的问题主要是考虑纯化标签和酶切位点的选择,下表我们列举了常见的纯化标签和酶切位点。 4)酶切位点 以上为原核表达常用的标签和酶切位点,其性质也都作了简要的介绍,各专业网站或专业书籍已对此做详尽解释,科研工作者可根据具体实验设计方案,组合设计以上标签和酶切位点的使用。特别值得注意的是,选用和设计蛋白酶切位点的时候首要考虑的是序列内部有没有蛋白酶位点,同时要考虑酶切的效率和蛋白酶试剂成本。一般商业化载体,在标签蛋白与载体多克隆位点之间都设计有酶切位点。 标签可设计在N-端也可在C-端,设计在N-端的优势是,可通过标签高效翻译起始位点带动插入蛋白的表达,可溶性标签的高效表达更可促进蛋白的可溶性表达;同时,大部分的蛋白内切酶的切割位点在C-端,所以标签设计在N-端可将标签切割完全。 在设计标签序列与酶切位点的时候还要考虑N-端稳定性原则,也就是所谓宿主细胞的N-端规则(N-end rule),这个要避免;同时,还应该检查是否引入了可与别的蛋白相互作用的序列或者蛋白酶切位点。

pET-22b(+)大肠杆菌表达载体说明

pET-22b(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT5200 pET--‐22b(+) pet22b载体基本信息 别名: pET22b, p et 22b, p ET--‐22b(+) 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点,限制性内切酶 载体大小: 5500bp 5' 测序引物及序列: T7: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3' 3' 测序引物序列: T7t: 5'--‐GCTAGTTATTGCTCAGCGG--‐3' 载体标签: N--‐pelB; C--‐His 载体抗性: 氨苄 备注: pET22b载体含有PelB信号肽序列, 能够将表达的目的蛋白定位在细胞外周质腔。 稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 组成型 Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒 pet22b载体质粒图谱和多克隆位点信息

pet22b载体简介 pET--‐22b(+)载体携带有一个N端的pelB信号肽序列,能够将表达的目的蛋白定位于外周质腔,同时载体含有C端His标签。载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒图谱。注意:载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的,所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的。 T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。质粒的F1复制子是被定向的,所以在T7噬菌体聚合酶的作用下,包含有蛋白编码序列的病毒 粒子能够产生,并启动蛋白表达,同时蛋白表达将被T7终止子序列的作用下终止蛋白翻译。 pet22b载体序列 ORIGIN 1 ATCCGGATAT AGTTCCTCCT TTCAGCAAAA AACCCCTCAA GACCCGTTTA GAGGCCCCAA 61 GGGGTTATGC TAGTTATTGC TCAGCGGTGG CAGCAGCCAA CTCAGCTTCC TTTCGGGCTT 121 TGTTAGCAGC CGGATCTCAG TGGTGGTGGT GGTGGTGCTC GAGTGCGGCC GCAAGCTTGT 181 CGACGGAGCT CGAATTCGGA TCCGAATTAA TTCCGATATC CATGGCCATC GCCGGCTGGG 241 CAGCGAGGAG CAGCAGACCA GCAGCAGCGG TCGGCAGCAG GTATTTCATA TGTATATCTC 301 CTTCTTAAAG TTAAACAAAA TTATTTCTAG AGGGGAATTG TTATCCGCTC ACAATTCCCC 361 TATAGTGAGT CGTATTAATT TCGCGGGATC GAGATCTCGA TCCTCTACGC CGGACGCATC 421 GTGGCCGGCA TCACCGGCGC CACAGGTGCG GTTGCTGGCG CCTATATCGC CGACATCACC 481 GATGGGGAAG ATCGGGCTCG CCACTTCGGG CTCATGAGCG CTTGTTTCGG CGTGGGTATG 541 GTGGCAGGCC CCGTGGCCGG GGGACTGTTG GGCGCCATCT CCTTGCATGC ACCATTCCTT 601 GCGGCGGCGG TGCTCAACGG CCTCAACCTA CTACTGGGCT GCTTCCTAAT GCAGGAGTCG

原核表达步骤

Chi l 原核表达基本试验步骤 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点:易于生长和控制;用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵;有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是,在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工,常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用,原核表达载体通常为质粒,典型的表达载体应具有以下几种元件: (1)选择标志的编码序列; (2)可控转录的启动子; (3)转录调控序列(转录终止子,核糖体结合位点); (4)一个多限制酶切位点接头; (5)宿主体内自主复制的序列。 原核表达一般程序如下:获得目的基因-准备表达载体-将目的基因插入表达载体中(测序验证)-转化表达宿主菌-诱导靶蛋白的表达-表达蛋白的分析-扩增、纯化、进一步检测,其中包括: 一、试剂准备 (1)LB培养基。 (2)1M IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷):2.38g IPTG溶于10ml ddH2O

中,0.22μm滤膜抽滤,-20℃保存。 CCY的IPTG是1M的,用时进行1000倍稀释。 二、操作步骤 (一)获得目的基因 1、通过PCR方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法:用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA,以mRNA 为模板,逆转录形成cDNA第一链,以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 (二)构建重组表达载体 1、载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收,在T4DNA连接酶作用下连接入载体。我们用Soultion I连接。 (三)获得含重组表达质粒的表达菌种 1、将连接产物转化大肠杆菌BL21,根据重组载体的标志(抗Amp或蓝白斑)作筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定。 2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆,重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。

真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体

真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体 标签:真核细胞酵母表达系统细胞表达载体真核表达系统昆虫表达系统动物表达系统 摘要: 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统,由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷,人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统,由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷,人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 自上世纪70年代基因工程技术诞生以来,基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。并随着人类基因组计划实施的进行,在技术方法上得到了很大发展,时至今日已取得令人瞩目的成就。随着人类基因组计划的完成,越来越多的基因被发现,其中多数基因功能不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。 在各种表达系统中,最早被采用进行研究的是原核表达系统,这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌),通过iptg诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物,而且所需的成本相对比较低廉。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点:如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控,有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用,过量表达可能导致非生理反应,目的蛋白常以包涵体形式表达,导致产物纯化困难;而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善,表达产物的生物活性较低。 为克服上述不足,许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域,其优点是: ①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计,而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性,故不存在基因的非特异性激活或抑制; ②能诱导基因高效表达,可达105倍,为其他系统所不及; ③能严格调控基因表达,即不仅可控制基因表达的“开关”,还可人为地调控基因表达量。 因此,利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前,基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。 1.酵母表达系统 最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母,后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等,其中,甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha,Candida Bodini,Pichia Pastris3种。以Pichia Pastoris应用最多。

pET 表达系统

pET 原核表达 pET 载体中,目标基因克隆到T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下,并通过在宿主细胞提供T7 RNA 聚合酶来诱导表达。Novagen 的pET 系统不断扩大,提供了用于表达的新技术和选择,目前共包括36 种载体类型、15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。 优点 ·是原核蛋白表达引用最多的系统 ·在任何大肠杆菌表达系统中,基础表达水平最低 ·真正的调节表达水平的“变阻器”控制 ·提供各种不同融合标签和表达系统配置 ·可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌 ·许多载体以LIC 载体试剂盒提供,用于迅速定向克隆PCR 产物 ·许多宿主菌株以感受态细胞形式提供,可立即用于转化 阳性pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。 pET 系统概述 pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。根据最初由Studier 等开发的T7 启动子驱动系统,Novagen 的pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。 控制基础表达水平 pET 系统提供6 种载体- 宿主菌组合,能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白,所以进行优化选择是必要的。 宿主菌株 质粒在非表达宿主菌中构建完成后,通常转化到一个带有T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌(λDE3 溶原菌)中表达目标蛋白。在λDE3 溶原菌中,T7 RNA 聚合酶基因由lacUV5 启动子控制。未诱导时便有一定程度转录,因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。而宿主菌带有pLysS 和pLyE 时调控会更严紧。pLys 质粒编码T7 溶菌酶,它是T7 RNA 聚合酶的天然抑制物,因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。pLysS 宿主菌产生低量T7 溶菌酶,而pLysE 宿主菌产生更多酶,因此是最严紧控制的λDE3 溶原菌。 有11 种不同DE3 溶原化宿主菌。使用最广泛的为BL21 及其衍生菌株,它的优点在于缺失lon 和ompT 蛋白酶。B834 菌株为甲硫氨酸营养缺陷型,因此可用35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记。BLR 为recA - 衍生菌株,改善了质粒单体产量,有助于稳定含有重复序列的目标质粒。两个硫氧还蛋白还原酶( trxB ) 突变菌株(AD494,BL21 trxB ) ,有利于大肠杆菌胞浆中二硫键形成。Origami TM 和OrigamiB 菌株为trxB/gor 双突变,这两个酶是主要还原途径的关键酶。Origami 和OrigamiB 宿主菌的主要优点是能形成正确折迭的含有二硫键的蛋白。新的Rosetta TM 菌株补充了四种大肠杆菌稀有密码子的tRNA ,改善了由于密码子使用频率不同而引起的一些真核蛋白低表达。其它菌株背景包括K-12 菌株HMS174 和NovaBlue ,象BLR 一样为recA - 。这些菌株可稳定表达其产物可能导致DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。由于存在F 附加体编码

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