RIP实验技术

RIP 技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA 结合蛋白免疫沉淀），是研究细胞内 RNA 与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，能帮助我们发现 miRNA 的调节靶点。RIP 这种新兴的技术运用针对目标蛋白的抗体把相应的 RNA蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的 RNA 进行分析。RIP 可以看成是普遍使用的染色质免疫沉淀 ChIP 技术的类似应用，但由于研究对象是 RNA-蛋白复合物而不是 DNA-蛋白复合物，RIP 实验的优化条件与 ChIP 实验不太相同（如复合物不需要固定，RIP 反应体系中的试剂和抗体绝对不能含有 RNA 酶，抗体需经 RIP 实验验证等等）。RIP 技术下游结合 microarray 技术被称为 RIP-Chip，帮助我们更高通量地了解癌症以及其它疾病整体水平的 RNA 变化。 Millipore 基于磁珠的 RIP 实验流程 RIP 实验基本原理： 1. 用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的 RNA 结合蛋白。 2. 防止非特异性的 RNA 的结合。 3. 免疫沉淀把 RNA 结合蛋白及其结合的 RNA 一起分离出来。 4.结合的 RNA 序列通过 microarray（RIP-Chip），定量 RT-PCR 或高通量测序（RIP-Seq）方法来鉴定。延伸阅读：95%的人类基因组并不编码基因，而是产生大量的非编码 RNA,真正编码蛋白质的基因只占人类总基因组的约 2%。这些非编码 RNA 在生命的生长发育的各个阶段都发挥着重要的调节作用，与艾滋病、白血病、糖尿病、畸形等多种病变密切相关，并且参与着干细胞和表观遗传学调控。而 RNA-蛋白复合物驱动了几乎所有细胞过程的基因表达的转录后调控，包括剪接（splicing）、出核转运（nuclear export）、mRNA 稳定性以及蛋白转译过程，因此，对基因调控的了解就有赖于确定这些过程中 RNA 的结合的变化。因此，RNA 研究也被越来越多的科学家重视起来，目前已经成为生命科学研究中一个炙手可热的领域，而 RIP 技术也逐渐成为 RNA 研究领域的一项常规方法，帮助我们了解越来越受关注的转录后调控网络。
RT-qPCR 原理
标签： PCR RT-qPCR
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摘要 : 实时 RT-PCR 应用于明确要求定量数据分析的分子医学、生物工
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广州赛诚生物基因表达调控专题 Qiagen：10 个窍门助你更好掌控 qPCR 实验沐赛生物:快速建立基因敲除细胞系
实时 RT-PCR 定量测定 mRNA 实时 RT-PCR 应用于明确要求定量数据分析的分子医学、生物工程、微生物学和诊断学定量测定 mRNA 所用的的方法。尽管他被描述成“黄金”标准，但他还远远未达到成为标准检测的程度。由 RNA 模板的多变性、含量测定的设计和方案造成的很重要的问题，与不恰当的数据标准化和数据分析一样，也是被众人所知却又忽视掉了。标准化的第一步，我们描绘了一系列 RT-qPCR 草案的基本的技术步骤，要求产生的数据具有可靠性和重演性。我们更愿意强调说，无论如何，RT-qPCR 数据只是关于一个细胞或组织给定转录物的量的快速测定的信息。任何可变的 mRNA 水平的生物结果分析必须包括关于调节 RNA、蛋白含量和蛋白活性的附注信息。这里描述的整个试验，包含了最初的含量设计到 qPCR 数据分析，需要大约 15 小时。 INTRODUCTION RT-QPCR 包括三部分：①依靠逆转录酶将 RNA 转变成 cDNA; ②用 pcr 扩增 cDNA; ③实时监测和定量测定 cDNA 的量尽管已经选用为定量测定 RNA 的方法，这种含量测定的安全性依然值得商榷。首要的是以下几点：①结果依赖于模板的量、质量和最佳的方案设计;②逆转录反应不是标准化的，因此，可能多变性高;③数据分析高度主观化，如果操作不恰当含量测定的结果就会混乱。因此，通过质量评估每一个 RT-qPCR 组分含量和保持数据分析的统一性来降低多变性和扩大重现性是必要的。基因表达测定标准化明确要求，与人类临床诊断分析有显而易见的关系。因此，我们关注这个实验的遍及整个实验指导的质量控制。 THE ASSAY RT-PCR (qPCR)在单管 PCR 的扩增和测定步骤结合使用荧光指示染料。含量的测定依赖于测定增加的荧光信号，其强度与每一次 PCR 循环的产物量成正比。此外，在单次反应中，用不同染料标记的探针能够监测和定量多标记的目的基因。在一次循环中，单次 PCR 荧光第一次超过既定的或背景荧光阈值，这个参数就称为循环阈值(Ct)或交叉点(Cp).起始浓度越高，Ct 值越小。当维持 PCR 分析滴定终点敏感性和特异性时，这种荧光和扩增物的相关性使目的基因能够在一个较大的范围内被精确定量。闭管(均质)形式消除了扩增后手工操作的需要，显著的减少了手工操作的时间和污染的风险。

Current problems 这种技术的广泛应用造成大量的可定量测定数据的方法的产生，利用①新鲜的、冷冻的或 FFPE 样品;②整体活组织检查、显微切割、单个细胞、组织培养细胞;③总 RNA 或 mRNA;④ 一系列不同 cDNA 引发机制;⑤不同的酶或酶切反应体系;⑥不同效率、灵敏度和活跃的检测 ⑦多样的检测试剂、反应条件、热循环仪⑧个人的分析方式及报告方法。每一步都明显不具有标准化的检测，在样品处理、对照的使用、数据处理和质量控制处理的不同使这种不标准化进一步加剧，并且与 RT-qPCR 的可靠性、相关性和重复性有及其密切的关系。理想的情况是，在每一步引入不确定的实验设计时，要通过比较所有可能的实验方案得出。显然这种方法的并不现实，我们提出一系列基于现在的一些想法试验方案，每一步都包含在内。逐一讨论样品的选择、储存和 RNA 的提取已经超出了本文的范围，我们将在别处予以介绍。本文从 RNA 的提取开始。我们相信这些试验方案将为大多数研究人员所接受并且能够产生可靠的数据。在每次试验中，每一个推荐的特定的试验方案的都会经过验证，但是不同的应用可能需要许多修改以适应特定的使用者。RT-qPCR 操作和替换步骤的整体考虑如图 2 所示。
RNA assessment

常用的定量测定 RNA 的方法有很多，每年选修 EMBO qPCR 课程的学生一般会比较用 Ribogreen、Agilent BioAnalyser、分光光度计、Nanodrop 及现在使用更多的 BioRad Experion 用以测定相同的 RNA 样品。结果显示，没有任何两种方法会产生相同的数据，比较用不同方法获得的数据是不明智的。这得出这样一个结论，谨慎的做法是用同一种方法测定所有的样品并加以报道。 RNA quality RNA 质量包含两方面的内容，纯度(无蛋白、无 DNA 污染、无抑制因子)和完整性。传统意义上 RNA 质量通过分析其在 A260/A280 时的比率，和/或分析核糖体 RNA 在琼脂糖凝胶上的条带以及一个最新的方法 Agilent Bioanalyser/BioRad Experion micro?uidic capillary electrophoresis systems。一个近期的报道声称，通过测定 Agilent2100 一些电泳图谱，包括测定这些区域的 18S and 28S RNA 片段，28S 顶点高度，快速反应区比例和标志高度，并用这些计算每一个 RNA 样品的完整数(RIN)，可以更加客观的测定 RNA 的质量。然而，通过 RT-qPCR 分心操作得出的关于 RNA 样品完整性的详尽分析却得出不同的结论。作者提出，通过大量的组织样品提取的 RNA 样品，将他们控制分解并用 Agilent Bioanalyser 进行分析。这些样品的 RIN 在 10(表面上完整的材料)到 4(几乎无法证明是 rRNA)之间。这些样品的每一个转录物的质量都会被 RT-qPCR 验证。在一些组织中检测到的转录物的质量不受 RNI 的影响，反之，一些具有线性关系或其他具有阈值效应的会受影响。严格来说，对于不同的组织其转录物的质量和 RNI 值之间的关系是不同的，并且这些因子间并没有可预见的关系。作者推断适度减少 RNA 样品能够增加分析和定量的可靠性，只要扩增子保持较短的状态(<250bp)并且不受内部影响标准化表达。这两个报道的差异可能是由于 RIN 和作者提倡的使用 RINs 的参考基因表达值之间相对较弱的相关系数(0.52)。由于缺乏一种可选择的可靠地 mRNA 完整性的测量标准，我们提议用 GAPDH(NM_002046)从 3’到 5’端对目的基因进行测定。许多年来，获取的数据不依赖于 rRNA 的完整性，需要提供一个合理的检测目的转录物分解量化标准和规范采用微点阵使用者以及长期来被接受及常用的适用于 PCR 终点分析的标准方法。对无所不在表达的 mRNA 完整性从 3’到 5’端分析测量，已被 GAPDH 基因特异的证实，它被认为是在一个给定的样品中所有 mRNA 完整性的代表。然而，因为不同的 mRNA 降解率不同，这不可能总是作为范例，并且对于特异的目的基因设计相似的试验方案是必要的。1.3 kb GAPDH mRNA 的实时反应用 oligo-dT 作预处理，用单独的多重 PCR 分析测定，三重目标扩增水平的量。空间分离一个是在 mRNA 的 5’端，第二个在中间，第三个在 3’端。扩增比率反映了 oligo-dT 预处理的实时反应沿着整个始转录物起前进是否成功。明白地说，RT 酶从 5’端扩增的进行依赖于 mRNA 的完整性，如果 mRNA 降解了，酶就无法完成。显然，3’：5’的比率接近 1 表明其高度完整，反之，任何大于 5 的比率说明 mRNA 的分解。这个实验分析用 TaqMan 试剂(如：每次扩增由目标特异性差别标记探针进行检测)设计成三重分析。

Inhibitory components(抑制元件) 抑制元件逐渐在生物体内被发现，并造成 qPCR 在灵敏度和动力学方面的显著降低。抑制因子可被用于生物样品中核酸的抽提或样品共纯化，例如胆盐、尿素、血红素、肝磷脂或 IgG.。最乐观的情况是，抑制因子造成不精确的定量测定结果;而最糟糕的是高度抑制会产生假阴性结果。最常用的解释样品间 PCR 效率的不同的方法是扩增参考基因，并联报道基因，将他们的表达水平。然而，这两种方法假定两种分析是在同一抑制水平。在绝对定量测定是问题会更加显著，此测定外部校正曲线常用于计算试验样品转录物量，并常用于病原体的定量。一些或全部生物样品可能包含有抑制因子，这些抑制因子并不存在于用于建立核酸标准曲线的样品中，这导致待测样品中的 mRNA 被低估。应当进一步关注是，FFPE 样品提取的核酸毋庸置疑的会进一步加重 mRNA 被低估的情况。显然，这些抑制因子更容易影响任何定量数据的比较。然而，最近的一个调查发现，只有 6%的研究人员检测他们的核酸样品有无抑制因子。生物样品中抑制因子的的检测有不同的方法。在一个样品测定中 PCR 的效率可以通过连续稀释的样品分析检测，尽管当样品很少的时候是不现实的。例如，显微切片得到的单个细胞。此外，还有在数学上计算 PCR 效率，即分析扩增回应曲线的方法。共纯化和共扩大目的核酸的 IAC 能够检测抑制因子及显示在处理过程中模板的损失。另一个方法利用整个细菌基因组来检测临床样品中的抑制因子。最近，我们描述了一个命名为 SPUD31 的 qPCR 参考试验方案。它通过逆转录或 PCR 步骤检测抑制因子，即通过记录有义链扩增的拷贝数的 Ct 特征：一个人造扩增子(SPUD-A)被扩大成用两个引物(SPUD F 和 SPUD R)和用 TaqMan 探针(SPUD P) 检测到的样品。在水溶液中，Ct 值记录一个无限制反应的特征(例如，25 左右)。伴随这个包含 SPUD 扩增子的反应，在 RNA 样品中进行的反应包括完全相同成分 (SPUD-A, SPUD 引物以及 SPUD 探针)。当与那些没有 RNA 的样品比较时，RNA 样品中潜在的抑制因子导致这些反应的 Ct 值变高。 Reverse transcription 反转录 RT-qPCR 分析可以用单管进行逆转录和 PCR 或用一个或两个管分开进行逆转录和 PCR。逆转录酶和 cDNA 引发机制的选择已经在别处被很好的考虑和讨论。由于逆转录酶的效率依赖于靶标和逆转录酶的选择，如果实验室间想要比较实验结果，用相同的酶、引发机制和试验条件是很重要的。在 2004-2005 年，ABRF 研究的主题是 cDNA 的引发机制，并且每一个实验方法都有其优点和缺点。由于并没有一个最好的运行机制，在逆转录阶段，我们搜集了包含随机引物，oligo-dT 和基因特异性引物的试验方案。 Single RT and PCR enzyme

单独的酶，例如 Tth 聚合酶能够作用于 RNA-和 DNA-依赖的 DNA 聚合酶，并且用于不需要再次附加物的单管混合反应。它主要的优点是减少了手工操作的时间和污染的可能性。它也有一些缺点。第一，由于在反应开始时所有的试剂都被加到管里面，这就没有了优化两个不同反应的可能性。第二，只有用目标特异性引物才能够进行分析。第三，测量的灵敏性会降低，可能是由于 Tth 聚合酶的转录活性效率降低。第四，最彻底的研究即比较两种操作发现，这个反应的特征是由大量的引物二聚体聚集造成的，这可能造成定量测量的真实结果被隐藏。我们发现将变性温度降低到 92.1℃，并将扩增设计的尽可能短能够减少这些问题。这可能是因为这种酶比 Taq 聚合酶的热稳定性稍低。 Separate RT and PCR enzymes 反应可以是偶联(单管)或非耦联的的(两管)。在偶联反应中，逆转录酶在高 dNTP 以及目标特异性或 oligo-dT 引物存在的情况下合成 cDNA。伴随着逆转录反应，PCR buffer (无 Mg2+)、耐热的 DNA 聚合酶和序列特异性引物的加入，PCR 开始在同一试管里进行。在非偶联反应中，逆转录酶在第一个管中合成 cDNA，在优化条件下，用随机、oligo-dT 或序列特异性引物合成。逆转录反应后将组分转到另一个含有 DNA 聚合酶、DNA 聚合酶缓冲液和 PCR 引物的管中，RCR 将在适合 DNA 聚合酶的条件下进行反应。当试验是正常进行，中段分析两种酶反应体系的不同可能是很小的，其相关性在 0.974 到 0.98835。这种方法的缺点是①在两种酶/单管反应中，在转录过程中，病毒逆转录模板开关活性会产生错误结果 ②还有另外的污染的可能性，甚至在失活后逆转录酶依然可能会抑制 PCR 反应，导致高估扩增效率和结果定量。然而作为平衡，对于研究程序来说，增加的弹性、敏感性和优化的潜在可能性，使两次酶反应优于单次酶反应。在诊断上来讲，手工操作时间和污染可能性的减少可能使单管酶反应更加适合。 cDNA priming 在一个单次反应中，随机引物或 ligo-dT 引发机制都会产生一个典型的 cDNA 库。然而，实验显示用随机六聚体引物引发机制的实验，样品中所有的靶标的逆转录效率不相同，并且当测量靶标时，加入的样品量和 cDNA 之间并没有线性关系。一个关于不同长度随机引物 RT 引发机制效率的比较显示，15-nt-长的随机寡核苷酸链，产生的 cDNA 的量至少是随机六聚体的两倍。15-mers 在引发时更加有效，结果是逆转录反应高于模板的 80%，相较于随机六聚体引物诱导的逆转录反应只有 40%。不用惊奇，这造成在整个转录组 DNA 芯片的一个数量级有更多的基因被检测。当然，我们建议用 15-mers 随机引物引发 cDNA 合成反应。然而，由于作者没有说明线性的问题，这种改变是否能够克服随机六聚体方法的特殊的限制依然存在。

Oligo-dT 引物只能用于完整的 RNA。即使如此，cDNA 分子可能被截断，因为 RT 酶不能够有效作用于高度结构化的区域。因此 oligo-dT 引发机制应朝着 3’端进行转录。对于那些需要检验剪接变体、有长的 3’ UTR 区域或那些没有 polyA 序列的实验来说，这是一个不恰当的选择。此外，当用来自福尔马林的组织切片提取 RNA 时，不推荐 oligo-dT 引发机制，因为甲醛固定会造成 mRNA40 polyA 尾的丢失。目标特异性引物是最特别最灵敏的方法目标特异性引物是将 mRNA 转变成 cDNA 最特别最灵敏的方法，当 RNA 质量是限制因素的时候我们推荐使用这个方法。即便如此，一个最近的报告显示，用多轮串联 PCR 方法，可以用特异性引物将 72 个基因从有限的 RNA 样本中进行特异和可靠地扩增。尽管如此，与随机引物一样，单个逆转录反应的效率也可能有所不同。通过将未知样品与校正样品 (当使用 DDCt 分析时)或标准曲线关联分析，将这些反转录效率的差异置于可控状态。的不同稀释浓度 RNA 样本的特异引发和其 cDNA 产物呈线性关系，因此，这种引发方式的另一个优点是 RT-qPCR 的反应效率可以通过标准曲线的梯度分析得到确定。一个非常重要的对照是在每个板上加一个校正样品或一个标准曲线样品，用于测定批间差异，这些差异可能源于多个样品在不同板上进行反应。 PCR 条件优化试验的优化时获得更好灵敏度、特异性、重复性和一个较大的线性动态范围的关键。幸运的是，由于 RT 这一步差异很大，尽管在非最佳条件下，qPCR 不同重复的差异较大，但是在最适条件下，qPCR 有很好的重复性。由于引物的不同以及引物浓度的不同导致了引物和靶标二聚体的热稳定性的不同。因此，可以得到优化的杂交和引发机制的引物浓度是很重要的。尽管，优化 PCR 反应常被作为分析测定发展的基本部分，在许多试验室，关于高流通量和快速数据报告的最近动态已经使这一步被去除。实际上，一些制造商上声称，如果用他们的特殊的标准混合物，优化引物浓度是不必要的。然而，我们很清楚潜在于最初的推荐的原理依然是有效的，引物浓度的优化可以显著的改进分析测定的敏感性。我们建议用荧光核酸染料，例如 SYBR Green I 或 EvaGreen，与分析扩增曲线和融解曲线联结以优化分析。融解曲线是一个强大的工具，一个精确地鉴定扩增物和将其与引物二聚体和其它小的扩增的人工产物。DNA 融解是在一个特定的温度，叫做解链温度(Tm)，定义的是一半 DNA 的双链结构被破坏时的温度。 DNA 分子的解链温度依赖于它的大小和核酸组成;因此相较于 AT 碱基对较多的扩增子，GC 丰富的扩增子有较高的 Tm 值。在融解曲线分析时，当从一个低于样品 Tm 值的既定的温度开始慢慢加热到高于他们的解链温度时，实时设备会连续的检测每一个样品的荧光。荧光染料在双链 DNA 变性时释放，为每一个单链扩增子的产物提供准确的 Tm 值。融解峰的计算通过分析融解曲线的第一个负导数(–dF/dT) 差别。这些顶点值类似于电泳凝胶上的条带，能够定量检测在一次循环结束的时候产物量。短的引物二聚体比较长的靶扩增子的温度解链低。

Conclusions 我们所提倡的下述方法，常用于确保最佳的重复性。在已发表的报告中，他们的广泛的使用和丰富的内容构成标准化程序的发展的进步，减少不同研究的不确定的外界因素。 ① 当定量检测来自活组织 mRNA 水平时合适的样品的选择是生物学上有意义数据获取的基本标准。我们强烈建议使用显微切片时将定量和表达数值关联起来。 ②使用引物(50–600 nM)评定任何一个待测 RNA 的质量以用于定量测定是最基本的。尤其是，在所有的出版物中，应当提供的的数据是每一个样品无抑制因子存在时的数据，例如细胞中的 RNA，RNA 整体。 ③应当用单独的试验测定 RNA 的质量，用于 RT 反应阶段的 RNA 的量应该是尽可能保持恒定。 ④cDNA 引发试验应当是连贯的，有特定的首选的引发条件，以及恒定的时间(越短越好)和反应温度(越高越好)。 ⑤标准化应当是用已知的内部对照基因，如果使用的话，必须保证每一个试验设备和恰当的数据包含在每一个出版文章里。 ⑥ 序列特异性标准曲线的扩增应当进行分析和报告数据，以揭示每一个 RCR 扩增的效率和敏感性，确定在这个分析的动态范围内任何一个未知样品的定量。 ⑦ 阴性对照中的任一信号测定应当通过融解曲线或其他的分析来进行报道和证实。 ⑧当报道的数据作为一个相关的改变(例如，用 DDCt 分析)，应当证明目标测定的 Ct 值的范围。
免疫共沉淀(Co-IP)
标签：免疫共沉淀蛋白质
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）可以：（1）测定两种目标蛋白质是否在体内结合；（2）确定一种特定蛋白质的新的作用搭档；（3）分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
详细
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免疫共沉淀(Co-IP) 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
实验

方法原理
其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质 X 的抗体免疫沉淀 X，那么与 X 在体内结合的蛋白质 Y 也能沉淀下来。目前多用精制的 proreinA 预先结合固化在 argarose 的 beads 上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads 上的 proreinA 就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
实验材料试剂、试剂盒仪器、耗材实验步骤
蛋白质
RIPA BufferPBSProtein Aagarose 琼脂糖考马斯亮蓝染色液
离心机摇床 EP 管细胞刮子离心管培养板电泳仪电泳槽高效液相色谱仪
一、试剂准备 1. 预冷 PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机。 2. 用预冷的 PBS 洗涤细胞两次，最后一次吸干 PBS。 3. 加入预冷的 RIPA Buffer(1 ml/107 个细胞、10 cm 培养皿或 150 cm2 培养瓶，0.5 ml/5× 106 个细胞、 6 cm 培养皿、75 cm2 培养瓶）。 4. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到 1.5EP 管中，4℃，缓慢晃动 15 min （EP 管插冰上，置水平摇床上）。 5. 4℃，14000 g 离心 15 min，立即将上清转移到一个新的离心管中。 6. 准备 Protein A agarose，用 PBS 洗两遍珠子，然后用 PBS 配制成 50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠。

7. 每 1 ml 总蛋白中加入 100 μl Protein A 琼脂糖珠（50%），4℃摇晃 10 min（EP 管插冰上，置水平摇床上）去除非特异性杂蛋白，降低背景。 8. 4℃，14000 g 离心 1 5min，将上清转移到一个新的离心管中，去除 Protein A 珠子。
9．（Bradford 法）做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释 1：10 倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）。 10. 用 PBS 将总蛋白稀释到约 1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如 10 μg/μl）。 11. 加入一定体积的兔抗到 500 μl 总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异。 12. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温 2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用 2 h 室温孵育。 13. 加入 100 μl Protein A 琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温 1 h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加 2 μl"过渡抗体"（兔抗鼠 IgG，兔抗鸡 IgG）。 14. 14000 rpm 瞬时离心 5 s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的 RIPA buffer 洗 3 遍， 800 μl/遍，RIPA buffer 有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用 PBS。 15. 用 60 μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl 足够上三道）。 16. 将上样样品煮 5 min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮 5 min 变性。二、免疫共沉淀反应 1．转染后 24-48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解 30 min,细
胞裂解液于 4°C，最大转速离心 30 min 后取上清；
2．取少量裂解液以备 Western blot 分析，剩余裂解液加 1μg 相应的抗体加入到细胞裂解液，4° C 缓慢摇晃孵育 3．取 10 μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗 3 次，每次 3 000 rpm 离心 3 min； 4.．将预处理过的 10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中 4° C 缓慢摇晃孵育 2-4 h，使抗体与 protein A 琼脂糖珠偶连； 5．免疫沉淀反应后，在 4° C 以 3,000 rpm 速度离心 3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用 1 ml 裂解缓冲液洗 3－4 次；最后加入 15 μl 的 2× SDS 上样缓冲液，沸水煮 5 分钟；

6． SDS-PAGE，Western blotting 或质谱仪分析。三、通过免疫共沉淀确定结合蛋白 1．用磷酸盐缓冲液洗 30 块 10 cm 培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到 1 ml 冰冷的 EBC 裂解缓冲液中； 2．将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上 4℃以最大速度离心 15 ； 3．收集上清（约 30 ml）并加入 30 μg 的适当抗体，4℃摇动免疫沉淀物 1 h； 4．加入 0.9 ml 的蛋白质 A-Sepharose 悬液，4℃摇动免疫沉淀物 30 min； 5．用含 900 mmol/L NaCl 的 NETN 洗蛋白 A-Sepharose 混合物，再重复洗 5 次。最后，用 NETN 洗一次； 6．吸出混合物的液体部分。加入 800 μl 的 1× SDS 胶加样缓冲液到球珠中，煮沸 4 min； 7．将样品加入到大孔的不连续 SDS-PAGE 梯度胶中，在 10 mA 的恒定电流下电泳过夜； 8．通过考马斯亮蓝染色观察蛋白质泳带； 9．从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用 1 ml 50%乙腈洗两次，每次 3 min； 10．用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱； 11．通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在 ABI 477A 或 494A 机器上进行自动 Edman 降解测序。
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注意事项
1. 细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40 或 Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的。 2. 使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用。 3. 使用对照抗体：单克隆抗体：正常小鼠的 IgG 或另一类单抗兔多克隆抗体：正常兔 IgG 4. 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生。 5. 要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀。 6. 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。

其他
一、免疫共沉淀的优点 1. 相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态。 2. 蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响。 3. 可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
二、免疫共沉淀的缺点 1. 可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用； 2. 两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用； 3. 必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。三、RIPA Buffer 配制 1. 基础成分 Tris-HCl（缓冲液成分，防止蛋白变性） NaCl（盐份，防止非特异蛋白聚集） NP-40（非离子去污剂，提取蛋白；用 H2O 配制成 10%储存液）去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用 H2O 配制成 10%储存液；避光保存）注意：准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。 2. RIPA 蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF）（用异丙醇配制成 200 mM 的储存液，室温保存） EDTA（钙螯合剂；用 H2O 配制成 100 mM 的储存液，PH 7.4）亮抑酶肽（Leupeptin）（用 H2O 配制成 1 mg/ml 的储存液，分装，-20℃保存）

抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用 H2O 配制成 1 mg/ml 的储存液，分装，-20℃保存）胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin）（用甲醇配制成 1 mg/ml 的储存液，分装，-20℃保存） 3. RIPA 磷酸（酯）酶抑制剂激活的 Na3VO4（用 H2O 配制成 200 mM 的储存液 NaF（200 mM 的储存液，室温保存）注意：在准备做磷酸（酯）酶实验的时候，不加磷酸酯酶抑制剂。四、工作液配制 1. 配制 100 ml 的 modified RIPA buffe （1）称取 790 mg 的 Tris-Base，加到 75ml 去离子水中，加入 900 mg 的 NaCl，搅拌，直到全部溶解，用 HCl 调节 PH 值到 7.4。（2）加 10 ml 10%的 NP-40。（3）加 2.5 ml 10%的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清。（4）加 1 ml 100mM 的 EDTA，用量筒定容到 100 ml，2-8℃保存。（5）理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑蛋白酶肽、亮抑酶肽、胃蛋白酶抑制剂各 100 μl；PMSF、Na3VO4、 NaF 各 500 μl），但是 PMSF 在水溶液中很不稳定，30 分钟就会降解一半，所以 PMSF 应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定 5 天。
W.M. Keck Foundation Biotechnology Microarryay Resource Laboratory at Yale University TRIZOL RNA Isolation Protocol __________________________________________________________ Please do not make copies of or distribute this protocol. A. Required reagents: DEPC-treated wat er (Ambion) TRIzol Reagent (Invitrogen) Ice cold PBS Cell scraper 70% ethanol Isopropyl alcohol B. Equipment and supplies: Refrigerated centrifuge Microcentrifuge Micropipettors Aerosol-barrier tips Vortex mixer Powder-free gloves Centrifuge tubes C. Safety: Always use gloves and eye protection. Avoid contact with skin or clothing. Use in a chemical hood. Avoid breathing vapor. D: Homogenization: 1. Tissues:

Homogenize tissue samples in 1 ml of TRIZOL reagent per 50 to 100 mg of tissue using a glass-T eflon or power homogenizer (e.g. Polytron, Tekmar’ s TISSUEMIZER). The sample volume should not exceed 10% of the volume of TRIZOL Reagen t used for the homogenization. 2. Cells grown in Monolayer: Rinse cell monolayer with ice cold PBS once. Lyse cells directly in a culture dish by adding 1 ml of TRIZOL Reagent per 3.5 cm diameter dish and scraping with cell scraper. Pass the cell lysate several times through a pipette. Vortex thoroughly. The amount of T RIZOL reagent added is based on the area of the culture dish (1 ml per 10 cm2) and not on the nu mber of cells present. An insufficient amount of TRIZOL Reagent may result in DNA contaminati on of the isolated RNA. 3. Cells Grown in suspension: Spin cells for 5 min at 300 X g. Remove media and resuspend cells in ice cold PBS. Pellet cells by spinning at 300 X g for 5 min. Lyse cells with TRIZOL Reagent by repetitive pipett ing or by passing through syringe and needle. Use 1 ml of the reagent per 5-10 X 106 of animal c ells. 4. Incubate the homogenized sample for 5 minutes at room temperature to permit the complete dis sociation of nucleoprotein complexes. Centrifuge to remove cell debris. Transfer the supernatant t o new tube. E. PHASE SEPERATION: Add 0.2 ml of chloroform per 1 ml of TRIZOL Reagent. Cap sample tubes securely. Vortex samples vigorously for 15 seconds and incubate them at room temperature for 2 to 3 minut es. Centrifuge the samples at no more than 12,000 x g for 15 minutes at 2 to 80C. Following cent rifugation, the mixture separates into lower red, phenol-chloroform phase, an interphase, and a col orless upper aqueous phase. RNA remains exclusively in the aqueous phase. Transfer upper aque ous phase carefully without disturbing the interphase into fresh tube. Measure the volume of the a queous phase (The volume of the aqueous phase is about 60% of the volume of TRIZOL Reagent used for homogenization). F. RNA PRECIPITATION: Precipitate the RNA from the aqueous phase by mixing with isopropyl alcohol. Use 0.5 ml of isop ropyl alcohol per 1 ml of TRIZOL Reagent used for the initial homogenization. Incubate samples at 15 to 30oC for 10 minutes and centrifuge at not more than 12,000 x g for 10 minutes at 2 to 4oC . The RNA precipitate, often invisible before centrifugation, forms a gel-like pellet on the side an d bottom of the tube. G: RNA WASH: Remove the supernatant completely. Wash the RNA pellet once with 75% ethanol, adding at least 1 ml of 75% ethanol per 1 ml of TRIZOL Reagent used for the initial homogenization. Mix the samples by vortexing and centrifuge at no more than 7,500 x g for 5 mi nutes at 2 to 8 oC. Repeat above washing procedure once. Remove all leftover ethanol. H. REDI SSOLVING RNA: Air-dry or vacuum dry RNA pellet for 5-10 minutes. Do not dry the RNA pellet by centrifuge under vacuum. It is important not to let the RNA pellet dry completely as this will grea tly decrease its solubility. Partially dissolved RNA samples have an A260/A280 ratio < 1.6. Disso lve RNA in DEPC-treated water by passing solution a few times through a pipette tip. I. SPECTROPHOTOMETRIC ANALYSIS: Dilute 1 μ l of RNA with 39 μ l of DEPC-treated water (1:40 dilution). Using 10 μ l

microcuvette, take OD at 260 nm and 280 nm to determine sample concentration and purity. The A260/A280 ratio should be above 1.6. Apply the convention that 1 OD at 260 equals 40 μg /ml RNA. Important: For microarray experiments, total RNA isolated by TRIZOL method needs to be further cleaned using RNeasy cleanup protocol. REFERENCES: Chomczynski P, Mackey K. (1995) Short technical report. Modification of the TRIZOL reagent pr ocedure for isolation of RNA from Polysaccharide-and proteoglycan-rich sources. Biotechniques 1 9(6): 942-5. TRIZOL Reagent technical insert (Invitrogen). 注意事项 1) 需自备氯仿、异丙醇（新开封或提取 RNA 专用）、75%乙醇 (DEPC 水配制)、 DEPC 和 DEPC 水。 2) 戴一次性干净手套；在单独的洁净的区域操作；在操作过程中避免讲话，以防实验者汗液、唾液中的 RNase 的污染。 3) 请尽量使用 RNase free 的实验器具，包括枪头和离心管。耐高温器物可 150℃ 烘烤 4 小时以去除 RNA 酶，其它器物去除 RNA 酶可考虑用 0. 1% 的 DEPC 水浸泡过夜，然后灭菌，烘干。溶液需用 DEPC 水配制。RNA 实验用的器具和试剂应专门使用，不要用于其它实验。DEPC 水建议分装后保存。 4) 本产品中含有苯酚，具有毒性和腐蚀性。如果吸入体内、接触皮肤、吞食等会中毒、导致灼伤以及其他身体伤害。使用本产品时应穿戴防护物品，如防护服装、手套、眼罩、面罩等。如果不小心接触到眼睛时，应立即用大量的水冲洗以及前往医院治疗； 5) 样品用 Total RNA Extraction Reagent 匀浆后，如果不即刻加入氯仿进行下游实验，可先于-70℃下冻存，可保存一个月以上。另保存在 75%乙醇中的 RNA 沉淀，可于 4℃ 保存 1 周，-20℃保存 1 年。 6) RNA 半衰期比较短，易降解，建议抽提后尽快进行后续实验。
参考用量表 1 每 1 ml Total RNA Extraction Reagent 能够充分裂解的最大样本量如下：

操作流程 1 样品的处理
1.1 样品的匀浆 A．贴壁细胞尽量弃去培养液，直接往直径 3.5cm 的培养板中加入 1ml Total RNA Extraction Reagent 覆盖并反复吹打裂解细胞。注：1）依据培养板的面积而不是细胞的数量来决定所需的 Total RNA Extraction Reagent 量（每 10cm2 加 1ml）。 2）当加入 Total RNA Extraction Reagent 量不足时可导致抽提的 RNA 有 DNA 污染。 3）贴壁培养细胞往往不能完全从培养瓶（皿）脱落，这并不意味着裂解不完全，此时细胞膜实际已经完全裂开，并已释放 RNA，继续后续实验即可。 B．悬浮细胞离心收集细胞，每 5 × 106-1 ×107 个细胞加入 1 ml Total RNA Extraction Reagent，用移液器反复吹打直至无明显颗粒样存在。注：在加入 Total RNA Extraction Reagent 前避免洗涤细胞，否则会增加 mRNA 降解的可能性。裂解某些酵母和细菌可能需要使用匀浆器。 C．动/植物组织取新鲜动植物组织或-70℃冻存动物组织在液氮中充分研磨，按照表 1 加入适当量 Total RNA Extraction Reagent 混匀。或取新鲜动植物组织尽量剪碎，加入适当 Total RNA Extraction

Reagent 量，匀浆仪进行匀浆处理。注：样品体积一般不要超过 Total RNA Extraction Reagent 体积的 10%。 1.2 1.3 将匀浆样品剧烈震荡后在室温条件下放置 5 分钟以使核蛋白体完全解离。（可选）在 4℃条件下，12000rpm 离心 10min，取上清。
注：如样品中含有较多蛋白质、脂肪、多糖或肌肉，植物的块茎结节等可离心去除。离心后的沉淀中包含有细胞外膜、多糖以及高分子量 DNA，上清中含有 RNA。处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂应尽量去除，取澄清的匀浆液进行后续实验。 2 总 RNA 提取 2.1 向上述裂解液中加入 1/5 体积的氯仿。盖紧离心管盖，剧烈震荡 15 秒，室温静置 2-3min。 2.2 12,000 rpm 4°C 离心 10-15 分钟。注：1）离心后混合物可分 3 层：上层无色水样层，中间层，下层红色有机苯酚氯仿层。RNA 无一例外的存在于水样层中。 2）该部分容量大约为所加 Total RNA Extraction Reagent 总量的 50-60%。如用 1 ml Total RNA Extraction Reagent 提取，上层水相约为 500-600 μ l。建议吸取 400-500 μ l，不要吸的太完全，以防吸到中间层导致基因组污染。 3）有机相和中间层是蛋白和 DNA，如有需要，请予以保留，并进行相关纯化实验。 2.3 小心吸取上层水相至一个新的离心管中，加入等体积的异丙醇。颠倒混匀后室温放置 10min。（RNA 沉淀在离心前通常不可见，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。） 2.4 12,000rpm 室温或 4°C 离心 10 分钟。 2.5 小心弃去上清，加入 1 ml 用 DEPC 水配制的 75%乙醇。充分洗涤管盖和管壁，并轻弹管底，让沉淀悬浮起来。每使用 1ml Total RNA Extraction Reagent 用 1ml 75%乙醇对沉淀进行洗涤。 2.6 12,000 rpm 室温或 4°C 离心 3 分钟，弃去上清，注意不要丢失 RNA 沉淀。注：剩余的少量液体可短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸弃沉淀。 2.7 室温放置 2-3min，晾干。加入 30-100ul RNase free water（DEPC 水），待完全溶解后，取少量检测，其余在-70°C 保存。 3 产物检测

A. 完整性检测 1）取 1 μ l RNA 加入适当 10 × DNA loading buffer，混匀。 2）进行 1% 琼脂糖凝胶电泳。若能看见清晰的三条带，证明 RNA 完整性较好。注意：如果是普通的琼脂糖凝胶电泳，28S 的位置大约在 2kb，18S 大约在 1kb 的位置，不同浓度的凝胶位置变化较大。 B. 纯度检测检测 260 nm，280 nm OD 值，并计算 OD 260/OD 280。纯的 RNA 的比值应在 1.8-2.2 之间。深圳依诺金生物科技有限公司技术方法 Northern 杂交方法 1. 概述 Northern 杂交可以选用 DIG 或者 BIOTIN 标记的 RNA 探针或 DNA 探针，但 RNA 探针显示更强的杂交信号和更低的非特异性背景，因此只要可能，可尽量选用 RNA 探针。但由于 RNA 探针在操作中的严格性比使用 DNA 探针更高。因此大多数研究者仍使用 DNA 探针，在此情况下，建议使用 Hyb 高效杂交液以减少背景。探针的浓度因目的基因的丰度和所采用的检测方法不同而有所差异。如采用化学显色法时，探针浓度建议为 30－80ng/ml，采用 CSPD 化学发光检测时，探针浓度建议为 20－ 50ng/ml，如果采用 CDP-Star 化学发光检测，由于灵敏度很高，因此，还要适当降低探针浓度(约 10－25ng/ml)。 2. 转膜和 RNA 的固定转膜前的 RNA 琼脂糖凝胶电泳采用变性电泳方法，根据需要选用适当的分子量标准。 1. 在完成电泳后，凝胶用 DEPC-H2O 淋洗除去甲醛，然后置于 2×SSC 中浸泡 15～30 分钟。 2. 搭建转膜平台：在大口盘中放入支持物如玻璃板，玻璃板应比支持物长。剪一块滤纸，横放在玻璃板上，滤纸两端浸入盘中，用 20×SSC 浸湿，并向盘中加入足量的 20×SSC。3. 用刀将部分凝胶切去，并左下角切去一小块作为凝胶方位的记号。将凝胶置于平台中央，除去气泡。 4. 剪一张尼龙膜，大小与凝胶相当，在无 RNase 的水中浸泡 5 分钟，然后将其置于凝胶表面。膜置于凝胶表面后不易挪动，膜与凝胶之间不应留有气泡。 5. 取两张与尼龙膜同样大小的滤纸，用 20×SSC 浸湿后置于膜上，用玻棒赶走气泡。将一叠略小于滤纸的吸水纸置于滤纸上，在纸上平放一玻璃板，然后在玻璃板上压一重物，室温下转膜 4～6 小时或过夜。注：可以使用其它的转膜仪器进行以上过程，请遵循制造商的操作手册。 6. 转膜完成后，将膜置于一张干的滤纸上，用铅笔在膜上标记加样孔位置，用 2×SSC 洗膜，再置于干滤纸上使膜晾干。 7. RNA 的固定： A） UV 交联：；将膜用 UV 照射交联。总照射剂量依膜的不同生产商而异，请按照膜的使用说明书和 UV CROSSLIKER 的操作手册进行。 B）真空烘烤固定：将膜夹在两张滤纸之间，80℃真空烘烤 2 小时。

3. 杂交 1．将膜置于装有预杂交液的杂交袋中（10ml 预杂交液/100cm2 膜），封好杂交袋，在设 https://www.360docs.net/doc/cf1782951.html,, info@https://www.360docs.net/doc/cf1782951.html, Tel: 0755-******** 1
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深圳依诺金生物科技有限公司技术方法定的杂交温度下预杂交至少 1 小时。 2．如果使用杂交管杂交，则根据杂交管体积，加入适量的杂交液(5-10ml)。如果膜的大小适中，也可以用无菌的 50ml 离心管(BD 公司)进行， 5ml 杂交液已足够。将杂交仪设定为 65℃， 8-15 转/分钟预杂交至少 1 小时。 3．将标记好的探针于 100℃煮沸 10～15 分钟，立即放冰浴冷却 10 分钟。用杂交液稀释成所需浓度。 4．将杂交袋中预杂交液倒出，加入 10ml 新鲜的 Hyb 杂交液（65℃预热，已加入变性的探针），小心排尽气泡，封口，放 65℃水浴振荡杂交过夜。 5．如果使用杂交管杂交，则倒出预杂交液，另取适量的 Hyb 高效杂交液(5-10ml)，加入变性过的探针(1-3μl/膜，或 10－25ng/ml Hyb 高效杂交液)，混匀。加入到杂交管中，杂交仪设定为 65℃，8-15 转/分钟，杂交过夜。 6．杂交完成后，取出杂交膜，放入装有 20mL 的 2×SSC/0.1% SDS 溶液的平皿中，在室温下振荡洗涤两次，每次 5 分钟。然后放入 0.1×SSC/0.1%SDS 溶液(先放 50℃水浴预热)中， 50℃水浴振荡洗涤两次，每次 15 分钟。当探针长度小于 100bp 时，最后一次的洗膜温度要由预备试验确定。 4. 检测杂交信号除非特别说明，以下过程均在室温下进行，并轻微摇动。化学发光法 1. 杂交洗膜后，将膜置于洗涤缓冲液中平衡 1 分钟。 2. 封闭：在 20ml 封闭液中封闭 30 分钟，弃去封闭液。 3. 抗 Dig-AP 于 13000rpm 下离心（在第一次使用时，需离心 5 分钟，以后使用前只需离心 1 分钟）。离心后将抗 Dig-AP 用封闭液稀释(1∶15000-20000)，1μ l Anti-Dig-AP 加入 20ml 封闭液，混匀，与膜一起孵育 30 分钟。 4. 去除抗体溶液，洗涤缓冲液洗膜 2X15 分钟。 5. 去除洗膜缓冲液，在检测缓冲液中平衡膜 2 次，每次 2 分钟。注意：在使用化学发光底物处理之前，膜必须保持湿润，哪怕是轻微的干燥也会产生很高的背景。

6. 用检测缓冲液稀释 CDP-Star 底物（1∶100），将膜置于干净的保鲜膜之间，用镊子抬起一角，从膜左边沿加入 1ml 化学发光底物，让底物溶液均匀扩散到膜的表面，然后将膜放平，排除气泡使膜四周被液体封闭，室温下放置 5 分钟。 7. 排去多余的底物溶液，用保鲜膜包裹，置暗盒中对 X 光片曝光，曝光时间约为 1-60 分钟。 https://www.360docs.net/doc/cf1782951.html,, info@https://www.360docs.net/doc/cf1782951.html, Tel: 0755-******** 2
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技术方法
NBT/BCIP 化学显色法 1. 杂交洗膜后，将膜转入装有 20mL 洗涤缓冲液的平皿中振荡洗涤 5 分钟。 2. 加入 30mL 阻断溶液孵育 30 分钟。 3. 再将膜转入 30mL 抗体溶液(1∶5000, 6μ l 抗 Dig-AP 加入 30ml 封闭液混匀)中孵育 30 分钟。 4. 在洗涤缓冲液中振荡洗涤两次，每次 20mL， 15 分钟。 5．平衡：将膜放入 20mL 检测缓冲液中振荡洗涤 5 分钟。 6．显色：在 10mL 检测缓冲液中加入 200μ l 的 NBT/BCIP，混匀，将膜浸入显色液中，显色过夜，显色反应应在暗处完成，过程中切勿摇动。在显色反应中，可以短时暴露于光下观察，完全反应大约需要 16 小时。 7. 终止显色：用灭菌的双蒸水反复冲涤 3～5 次。在成像系统上拍照，记录结果。膜如果贮存在 TE 中可长期保存颜色不变。 5. 相关产品：正电荷尼龙膜(10 x 15 cm，20 x 30 cm) Cat. No. M-010, 020 Hyb 高效杂交液 Cat. No. Hyb-100 地高辛/生物素杂交检测试剂盒 I(化学显色法) Cat. No. DIGD-110，BIOD-110 地高辛/生物素杂交检测试剂盒 II(化学发光法) Cat. No. DIGD-210，BIOD-210 地高辛/生物素 DNA 标记试剂盒 I Cat. No. DDLK-010/020，BDLK-010/020 地高辛/生物素 DNA 标记试剂盒 II Cat. No. RDLK-010/O20，RBLK-010/020 第 17 章 Northern 杂交技术