SDS-PAGE分离胶配方表234

SDS-PAGE分离胶配方表-及其原理

SDS-PAGE电泳原理: 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 (简称Acr) 和交联剂N,N’—亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂作用下,聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶,并以此为支持物进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带,如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质,蛋白质样品电泳后,就应只分离出一条区带。 SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键,并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物,使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷,掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此,各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率,不再受原有电荷和分子形状的影响,而只是棒长的函数。这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称SDS—PAGE)。由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度,因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度,如果被鉴定的蛋白质样品很纯,只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质,那么SDS—PAGE 后,就只出现一条蛋白质区带。 TEMED:通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。 过硫酸铵(AP):提供驱动丙烯酰胺与双丙烯酰胺所必须的自由基。 SDS—PAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。本实验采用垂直板状不连续系统。所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。 1.蛋白样品浓缩效应 在不连续电泳系统中,含有上、下槽缓冲液(Tris—Gly,、浓缩胶缓冲液(Tris—HCl,、分离胶缓冲液(Tris—HCl,,两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。在这种条件下,缓冲系统中的HCl 几乎全部解离成Cl-,两槽中的Gly (pI=,pK a=只有很少部分解离成Gly 的负离子,而酸性蛋白质也可解离出负离子。这些离子在电泳时都向正极移动。C1—速度最快(先导离子),其次为蛋白质,Gly 负离子最慢(尾随离子)。由于C1—很快超过蛋白离子,因此在其后面形成一个电导较低、电位梯度较陡的区域,该区电位梯度最高,这是在电泳过程中形成的电位梯度的不连续性,导致蛋白质和Gly 离子加快移动,结果使蛋白质在进入分离胶之前,快、慢离子之间浓缩成一薄层,有利于提高电泳的分辨率。 2.分子筛效应 蛋白质离子进入分离胶后,条件有很大变化。由于其pH 升高(电泳进行时常超过,使Gly 解 离成负离子的效应增加;同时因凝胶的浓度升高,蛋白质的泳动受到影响,迁移率急剧下降。此两项变化,使Gly 的移动超过蛋白质,上述的高电压梯度不复存在,蛋白质便在一个较均一的pH 和电压梯度环境中,按其分子的大小移动。分离胶的孔径有一定的大小,对不同相对分子质量的蛋白质来说,通过时受到的阻滞程度不同,即使净电荷相等的颗粒,也会由于这种分子筛的效应,把不同大小的蛋白质相互分开。 SDS-PAGE电泳胶配制:

SDS-PAGE凝胶配方表

浓缩胶(5% Acrylamide) 各种组分名称1ml 2ml 3ml 4ml 5ml 6ml 8ml 10ml 双蒸水0.68 1.4 2.1 2.7 3.4 4.1 5.5 6.8 30%Acrylamide 0.17 0.38 0.5 0.67 0.83 1.0 1.3 1.7 1.0M Tris-HCl(PH 6.8) 0.13 0.25 0.38 0.5 0.63 0.75 1.0 1.25 10%过硫酸铵(AP) 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.08 0.1 10% SDS 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.08 0.1 TEMED 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.008 0.01 分离胶 (3) 10%Gel 各种组分名称5ml 10ml 15ml 20ml 25ml 30ml 40ml 50ml 双蒸水 1.8 4.0 5.9 7.9 9.9 11.9 15.9 19.8 30%Acrylamide 1.7 3.3 7.9 6.7 8.3 10.0 13.3 16.7 1.5M Tris-HCl(PH 8.8) 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.5 10%过硫酸铵(AP) 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02 (4) 12%Gel 各种组分名称5ml 10ml 15ml 20ml 25ml 30ml 40ml 50ml 双蒸水 1.6 3.8 4.9 6,6 8.2 9.9 13.2 16.5 30%Acrylamide 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 16.0 20.0

SDS-PAGE分离胶-浓缩胶配方

SDS-PAGE 1、SDS-PAGE:聚丙烯酰胺凝胶电泳 2、Acr:丙烯酰胺;配胶时用30%Acr(质量比Acr:Bis=29:1) 3、Bis:甲叉双丙烯酰胺 4、DDW:超轻水 5、SDS:十二烷基硫酸/磺酸钠,阴离子去污剂(配胶时用10%) 6、APS:过硫酸铵NH4S2O4配胶时用10% 7、TEMED:四甲基乙二胺,促凝剂 8、Tris-Hcl:3羟基氨基甲烷盐酸缓冲液,配胶时(分离胶ph=8.8,浓缩胶ph=6.8) 9、DTT:二硫苏糖醇,DTT也常常被用于蛋白质中二硫键的还原,可用于阻止蛋白质中的 半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。 10、IMA:碘乙酰胺,碘代乙酰胺用于有机合成,在蛋白组学中组氨酸和半胱氨酸的烷 基化试剂,用于多肽测序以及酶抑制剂等,蛋白组学级试剂。CH>2ICONH>2,是和碘乙酸一样,可通过下列反应不可逆地抑制SH酶类的物质。

1)根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度,再按照下面的表格配制SDS-PAGE的 分离胶(即下层胶):

注:如果配制非变性胶,参考上述配方,不加10%SDS即可配制成非变性PAGE胶。 1)按照如下表格配制SDS-PAGE的浓缩胶(也称堆积胶、积层胶或上层胶): TBST 缓冲液 每2L体积中含: 1)抗体去除液 每50mL抗体去除液中含:

SDS-PAGE电泳的基本原理: SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基硫酸钠),SDS会与变性的多肽,并使蛋白带负电荷,由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关,因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关,在达到饱和的状态下,每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时,蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,符合下式:logMW=K-bX,式中:MW为分子量,X为迁移率,k、b均为常数,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

2.1SDS-PAGE配制表

SDS-PAGE浓缩胶/堆积胶/上层胶配方表 成分配制不同体积SDS-PAGE浓缩胶所需各成分的体积(毫升)5%胶235681015 蒸馏水 1.4 2.1 3.5 4.1 5.5 6.810.3 30% ACR-Bis(29:1)0.330.50.831 1.3 1.7 2.53 1M Tris Buf.,pH6.80.250.380.630.751 1.25 1.88 10% SDS0.020.030.050.060.080.10.15 10% AP(过硫酸铵)0.020.030.050.060.080.10.15 TEMED0.0020.0030.0050.0060.0080.010.015 SDS-PAGE分离胶配方表 成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积(毫升)6%胶5101520253050 蒸馏水2468101220 30% ACR-Bis(29:1)12345610 1M Tris Buf.,pH8.8 1.9 3.8 5.77.69.511.419 10% SDS0.050.10.150.20.250.30.5 10% AP(过硫酸铵)0.050.10.150.20.250.30.5 TEMED0.0030.0060.0090.0120.0150.0180.03成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积(毫升)8%胶5101520253050 蒸馏水 1.7 3.35 6.78.31016.7 30% ACR-Bis(29:1) 1.3 2.74 5.3 6.7813.3 1M Tris Buf.,pH8.8 1.9 3.8 5.77.69.511.419 10% SDS0.050.10.150.20.250.30.5 10% AP(过硫酸铵)0.050.10.150.20.250.30.5 TEMED0.0030.0060.0090.0120.0150.0180.03成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积(毫升)10%胶5101520253050 蒸馏水 1.3 2.74 5.3 6.7813.3 30% ACR-Bis(29:1) 1.7 3.35 6.78.31016.7 1M Tris Buf.,pH8.8 1.9 3.8 5.77.69.511.419 10% SDS0.050.10.150.20.250.30.5 10% AP(过硫酸铵)0.050.10.150.20.250.30.5 TEMED0.0030.0060.0090.0120.0150.0180.03成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积(毫升)12%胶5101520253050 蒸馏水12345610 30% ACR-Bis(29:1)2468101220 1M Tris Buf.,pH8.8 1.9 3.8 5.77.69.511.419 10% SDS0.050.10.150.20.250.30.5 10% AP(过硫酸铵)0.050.10.150.20.250.30.5 TEMED0.0030.0060.0090.0120.0150.0180.03成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积(毫升)15%胶5101520253050 蒸馏水0.51 1.52 2.535 30% ACR-Bis(29:1) 2.557.51012.51525 1M Tris Buf.,pH8.8 1.9 3.8 5.77.69.511.419 10% SDS0.050.10.150.20.250.30.5 10% AP(过硫酸铵)0.050.10.150.20.250.30.5 TEMED0.0030.0060.0090.0120.0150.0180.03 备注:如配制非变性胶,参考上述配方不加10% SDS即可。

SDS-PAGE凝胶配方

SDS-PAGE凝胶配制试剂盒 产品简介: 碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒提供了配制SDS-PAGE凝胶所需的各种试剂,用户只需自备制胶器具和蒸馏水,即可配制PAGE胶(即聚丙烯酰胺凝胶)。 SDS-PAGE凝胶配制试剂盒不仅可用于配制SDS-PAGE凝胶,也可用于配制非变性(native)PAGE凝胶。 本试剂盒约可配制30-50块常规大小的PAGE胶。 保存条件: 1M Tris-HCl, pH8.8、10% SDS、Ammonnium persulfate (过硫酸铵)和1M Tris-HCl, pH6.8室温保存。30% Acr-Bis (29:1)和TEMED 4℃避光保存。过硫酸铵配制成10%溶液后,分装成小管-20℃保存,通常半年内有效。 注意事项: 过硫酸铵配制成10%溶液后,应当-20℃保存。同时应尽量减少室温存放时间,以防失效。 TEMED易挥发,使用后请盖紧瓶盖。另外凝胶凝聚的速度和温度及光照关系密切,可通过适当调节TEMED的用量,控制在不同的室内环境下凝胶凝聚的速度。 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。 使用说明: 1. 根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度,再按照下面的表格配制SDS-PAGE的分离胶(即下层胶):

使用本产品的文献: 1. Deng XQ, Chen LL, Li NX. The expression of SIRT1 in nonalcoholic fatty liver disease induced by high-fat diet in rats. Liver Int. 2007 Jun;27(5):708-15. 2. Wang PH, Gu ZH, Huang XD, Liu BD, Deng XX, Ai HS, Wang J, Yin ZX, Weng SP, Yu XQ, He JG. An immune deficiency homolog from the white shrimp, Litopenaeus vannamei, activates antimicrobial peptide genes. Mol Immunol. 2009 May;46(8-9):1897-904. 3. Liang QL, Wang BR, Li GH. DcR3 and survivin are highly expressed in colorectal carcinoma and closely correlated to its clinicopathologic parameters. J Zhejiang Univ Sci B. 2009;10(9):675-82. 4. Deng XQ, Cheng JL, Zhang YP, Li NX, Chen LL.

电泳条件及不同胶浓度配制

试剂配制: (1)30%聚丙烯酰胺贮液:将聚丙烯酰胺(电泳级)150g,N,N′—甲叉双丙烯酰胺(电泳级)4g溶剂于400ml双蒸水中,补充双蒸水至500ml,滤纸过滤后,于棕色瓶中4℃避光保存。 (2)1.5mol/l Tris碱(pH8.8):将90.75Tris碱溶解于400ml双蒸水中,用1mol/l HCl调至pH8.8,补充双蒸水定容至500ml,4℃冰箱保存。 (3)1.0mol/l Tris碱(pH6.8):将12.1Tris碱溶解于80ml双蒸水中,用1mol/l HCl调至pH6.8,补充双蒸水定容至100ml,4℃冰箱保存。 (4)10%SDS:将10gSDS溶剂于100ml双蒸水中,混匀后,室温保存。 (5)10%过硫酸铵:将0.1过硫酸铵(电泳级)溶解于1ml双蒸水中(用时加水溶解),4℃冰箱保存。 (6)10倍电泳缓冲液(25mmolTris,192mmol甘氨酸,0.1%SDS,pH8.3):在10L大玻璃管中加8L双蒸水,303gTris碱,1442g甘氨酸,100gSDS溶解后调pH8.3补水至10L,混匀后,室温保存。 (7)样品缓冲液:将1.6ml10%SDS,0.8ml甘油,1.0ml1.0mol/l Tris(pH6.8),加入到4.0ml 双蒸水中,加0.01%溴酚蓝,0.4ml巯基乙醇。 (8)染色液配制 0.25%考马斯亮蓝(CCB)染色液:考马斯亮蓝R-250甲醇-醋酸混合液。取1.25g考马斯亮蓝R-250,溶于227ml蒸馏水中,加甲醇227ml,再加入冰乙酸46ml(近似5:5:1)搅拌使其充分溶解,室温保存备用。 (9)脱色液配制:甲醇:水:醋酸=5:5:1混合备用。或用20%乙醇水溶液。 实验步骤 1待测蛋白样品制备 (1)根据每种方法提取的蛋白,用含SDS的样品缓冲溶液溶解,充分溶解后沸水加入3-5min,1600r/min离心5min,取3上清液进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。 (2)用不含SDS的样品缓冲液溶解蛋白,充分溶解后沸水加入3-5min,1600r/min离心5min,取上清液进行无SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。 垂直板状SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制 1 安装:根据电泳仪说明书安装在灌胶架上。 2根据下表配制分离胶溶液 加入1过硫酸铵,立即摇匀,将其迅速、联系地灌注在两块玻璃板的间隙中,高度据玻璃上边2cm。之后,用带有针头的注射器小心的在丙烯酰胺溶液的上部覆盖上一层去离子水(不要冲击胶面),在室温下垂直放置30min左右,使其完全聚合凝固。 吸出覆盖层溶液,用去离子水洗涤顶部1-2次,弃去多余的溶液。将配置好的浓缩胶溶

SDS-PAGE分离胶缓冲液(4×)

SDS-PAGE 分离胶缓冲液(4×) 简介: 本试剂为配制SDS-PAGE 分离胶缓冲液,可用于配制各种浓度的变性及非变性PAGE 凝胶,方便、快捷。产品中已加入10%SDS ,使用时不用另外加入。 组成: 自备材料: 1、 凝胶模具 2、 Acr-Bis(30%,29:1) 3、 10%APS(过硫酸铵) 4、 TEMED 5、 蒸馏水 操作步骤(仅供参考): 根据目的蛋白分子量大小选择合适的PAGE 分离胶配制浓度,最佳胶浓度请参考附表1。 (一)灌制分离胶(各试剂使用量请参考附表2) 1、参照凝胶模具说明书,装配好凝胶模具。(注:加入上层筛板有助于加样时保持填料与样品均匀接触,是否加入上层筛板可根据实际情况选择。) 2、将不同体积的Acr-Bis(30%,29:1)、分离胶缓冲液和蒸馏水在小烧杯或试管中混合。 3、加入APS 和TEMED ,轻轻搅拌使其混匀,避免产生气泡。 4、在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液(对于mini-gel ,凝胶液加至约距前玻璃板顶端 1.5 cm 或距梳齿约0.5cm 即可),然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层水层, 使凝胶表面保持平整。 6、 静置,待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后,表面凝胶已聚合。 (二)灌制浓缩胶(各试剂使用量请参考附表3) 1、小心倾倒出覆盖在分离胶上的水层。 2、将不同体积的Acr-Bis(30%,29:1)、浓缩胶缓冲液和蒸馏水在一个小烧杯或试管中混 合。 编号 名称 PW0097 PW0097 Storage SDS-PAGE 分离胶缓冲液(4×) 100ml 500ml 4℃ 使用说明书 1份

SDSPAGE分离胶配方表及其原理

S D S P A G E分离胶配方 表及其原理 The Standardization Office was revised on the afternoon of December 13, 2020

SDS-PAGE电泳原理: 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 (简称Acr) 和交联剂N,N’—亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂作用下,聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶,并以此为支持物进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带,如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质,蛋白质样品电泳后,就应只分离出一条区带。 SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键,并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物,使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷,掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此,各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率,不再受原有电荷和分子形状的影响,而只是棒长的函数。这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称SDS—PAGE)。由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度,因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度,如果被鉴定的蛋白质样品很纯,只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质,那么SDS—PAGE 后,就只出现一条蛋白质区带。 TEMED:通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。 过硫酸铵(AP):提供驱动丙烯酰胺与双丙烯酰胺所必须的自由基。 SDS—PAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。本实验采用垂直板状不连续系统。所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。 1.蛋白样品浓缩效应 在不连续电泳系统中,含有上、下槽缓冲液(Tris—Gly,、浓缩胶缓冲液(Tris—HCl,、分离胶缓冲液(Tris—HCl,,两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。在这种条件下,缓冲系统中的HCl 几乎全部解离成Cl-,两槽中的Gly (pI =,pK a=只有很少部分解离成Gly 的负离子,而酸性蛋白质也可解离出负离子。这些离子在电泳时都向正极移动。C1—速度最快(先导离子),其次为蛋白质,Gly 负离子最慢(尾随离子)。由于C1—很快超过蛋白离子,因此在其后面形成一个电导较低、电位梯度较陡的区域,该区电位梯度最高,这是在电泳过程中形成的电位梯度的不连续性,导致蛋白质和Gly 离子加快移动,结果使蛋白质在进入分离胶之前,快、慢离子之间浓缩成一薄层,有利于提高电泳的分辨率。 2.分子筛效应 蛋白质离子进入分离胶后,条件有很大变化。由于其pH 升高(电泳进行时常超过,使Gly 解 离成负离子的效应增加;同时因凝胶的浓度升高,蛋白质的泳动受到影响,迁移率急剧下降。此两项变化,使Gly 的移动超过蛋白质,上述的高电压梯度不复存在,蛋白质便在一个较均一的pH 和电压梯度环境中,按其分子的

4×SDS-PAGE分离胶缓冲溶液

4×SDS-PAGE 分离胶缓冲溶液 货号:S1051规格:100ml/500ml 保存:室温保存,有效期12个月。 产品说明:本试剂是由Tris 和SDS 混合而成的,主要用于SDS-PAGE 凝胶(变性聚丙烯酰胺凝胶)制备实验。配制分离胶时,10ml 制胶体系中加入2.5ml(4倍稀释)。组分 浓度Tris-HCl(pH=8.8) 1.5mol/L SDS 0.4%(W/V) 注意事项:若有白色沉淀析出,可置于37℃水浴,析出溶解后再使用。根据目标蛋白分子量选取凝胶浓度,按下表配制。先配分离胶,再配浓缩胶。(仅供参考) 备注:S1052(4×SDS-PAGE 浓缩胶缓冲溶液)配方如下:组分 浓度 分离胶15% 分离胶12%分离胶10%分离胶8%浓缩胶5%总体积 10ml 10ml 10ml 10ml 5ml 30%丙烯酰胺(29:1)5ml 4ml 3.3ml 2.7ml 0.83ml 4×SDS-PAGE 浓缩胶缓冲溶液 1.25ml 4×SDS-PAGE 分离胶缓冲溶液 2.5ml 2.5ml 2.5ml 2.5ml 10%过硫酸铵100ul 100ul 100ul 100ul 75ul TEMED 10ul 10ul 10ul 10ul 7.5ul ddH2O 2.4ml 3.4ml 4.1ml 4.7ml 2.84ml 最佳分离范围 10-40kD 12-60kD 20-80 kD 30-90kD —

Tris-HCl(pH=6.8)0.5mol/L SDS0.4%(W/V) 本试剂是由Tris和SDS混合而成的,主要用于SDS-PAGE凝胶(变性聚丙烯酰胺凝胶)制备实验。配制浓缩胶时,10ml制胶体系中加入2.5ml(4倍稀释)。

SDS-PAGE配方

SDS-PAGE 1)根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度,再按照下面的表格配制SDS-PAGE的 分离胶(即下层胶):

注:如果配制非变性胶,参考上述配方,不加10%SDS即可配制成非变性PAGE胶。10%过硫酸铵配好后可以在4D冰箱放两周,但是最好新鲜配置效果好。 1)按照如下表格配制SDS-PAGE的浓缩胶(也称堆积胶、积层胶或上层胶): 5XTris-Glycine 电泳缓冲溶液1L 0.125M Tris,1.25M Glycine,0.5% W/V SDS Tris 15.1 g Glycine 95 g SDS 5.0 g

5X SDS-PAGE 加样缓冲液:5ml 250mM Tris-HCl (pH6.8), 10% SDS, 0.5% BPB, 50% glycerol, 5% 2-ME 1M Tris-HCl (pH6.8): 1.25 mL SDS:0.5 g BPB: 25mg Glycerol: 2.5ml 2-ME: 使用时加入小份(25微升),新鲜使用。 TBST缓冲液 每2L体积中含: 1)抗体去除液 每50mL抗体去除液中含:

SDS-PAGE电泳的基本原理: SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基硫酸钠),SDS会与变性的多肽,并使蛋白带负电荷,由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关,因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关,在达到饱和的状态下,每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时,蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,符合下式:logMW=K-bX,式中:MW为分子量,X为迁移率,k、b均为常数,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

SDS-PAGE浓缩胶缓冲液(4×)

SDS-PAGE 浓缩胶缓冲液(4×) 简介: 本试剂为配制SDS-PAGE 浓缩胶缓冲液,可用于配制各种浓度的变性及非变性PAGE 凝胶,方便、快捷。产品中已加入10%SDS ,使用时不用另外加入。 组成: 自备材料: 1、 凝胶模具 2、 Acr-Bis(30%,29:1) 3、 10%APS(过硫酸铵) 4、 TEMED 5、 蒸馏水 操作步骤(仅供参考): 根据目的蛋白分子量大小选择合适的PAGE 分离胶配制浓度,最佳胶浓度请参考附表1。 (一)灌制分离胶(各试剂使用量请参考附表2) 1、参照凝胶模具说明书,装配好凝胶模具。(注:加入上层筛板有助于加样时保持填料与样品均匀接触,是否加入上层筛板可根据实际情况选择。) 2、将不同体积的Acr-Bis(30%,29:1)、分离胶缓冲液和蒸馏水在小烧杯或试管中混合。 3、加入APS 和TEMED ,轻轻搅拌使其混匀,避免产生气泡。 4、在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液(对于mini-gel ,凝胶液加至约距前玻璃板顶端 1.5 cm 或距梳齿约0.5cm 即可),然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层水层, 使凝胶表面保持平整。 6、 静置,待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后,表面凝胶已聚合。 (二)灌制浓缩胶(各试剂使用量请参考附表3) 1、小心倾倒出覆盖在分离胶上的水层。 2、将不同体积的Acr-Bis(30%,29:1)、浓缩胶缓冲液和蒸馏水在一个小烧杯或试管中混 合。 编号 名称 PW0096 PW0096 Storage SDS-PAGE 浓缩胶缓冲液(4×) 100ml 500ml 4℃ 使用说明书 1份

SDS-PAGE凝胶配方表

; 浓缩胶(5% Acrylamide) 各种组分名称1ml 2ml 3ml 4ml 5ml 6ml 8ml 10ml 双蒸水0.68 1.4 2.1 2.7 3.4 4.1 5.5 6.8 30%Acrylamide 0.17 0.38 0.5 0.67 0.83 1.0 1.3 1.7 1.0M Tris-HCl(PH 6.8) 0.13 0.25 0.38 0.5 0.63 0.75 1.0 1.25 10%过硫酸铵(AP) 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.08 0.1 10% SDS 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.08 0.1 TEMED 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.008 0.01 分离胶 (3) 10%Gel 各种组分名称5ml 10ml 15ml 20ml 25ml 30ml 40ml 50ml 双蒸水 1.8 4.0 5.9 7.9 9.9 11.9 15.9 19.8 30%Acrylamide 1.7 3.3 7.9 6.7 8.3 10.0 13.3 16.7 1.5M Tris-HCl(PH 8.8) 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.5 10%过硫酸铵(AP) 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02 (4) 12%Gel 各种组分名称5ml 10ml 15ml 20ml 25ml 30ml 40ml 50ml 双蒸水 1.6 3.8 4.9 6,6 8.2 9.9 13.2 16.5 30%Acrylamide 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 16.0 20.0 1.5M Tris-HCl(PH 8.8) 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.5 10%过硫酸铵(AP) 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02 (5) 15%Gel 各种组分名称5ml 10ml 15ml 20ml 25ml 30ml 40ml 50ml 双蒸水 1.1 2.3 3,4 4.6 5.7 6.9 9.2 11.5 30%Acrylamide 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 20.0 25.0 1.5M Tris-HCl(PH 8.8) 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.5 10%过硫酸铵(AP) 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02 注意:浓缩胶用5ml,15%的分离胶用10ml ’.

SDS-PAGE分离胶配方表-及其原理

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 (简称Acr) 和交联剂N,N’—亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂作用下,聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶,并以此为支持物进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带,如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质,蛋白质样品电泳后,就应只分离出一条区带。 SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键,并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物,使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷,掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此,各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率,不再受原有电荷和分子形状的影响,而只是棒长的函数。这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称SDS—PAGE)。由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度,因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度,如果被鉴定的蛋白质样品很纯,只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质,那么SDS—PAGE 后,就只出现一条蛋白质区带。 TEMED:通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。 过硫酸铵(AP):提供驱动丙烯酰胺与双丙烯酰胺所必须的自由基。 SDS—PAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。本实验采用垂直板状不连续系统。所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。 1.蛋白样品浓缩效应 在不连续电泳系统中,含有上、下槽缓冲液(Tris—Gly,pH8.3)、浓缩胶缓冲液(Tris—HCl,pH6.8)、分离胶缓冲液(Tris—HCl,pH8.8),两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。在这种条件下,缓冲系统中的HCl 几乎全部解离成Cl-,两槽中的Gly (pI=6.0,pK a=9.7)只有很少部分解离成Gly 的负离子,而酸性蛋白质也可解离出负离子。这些离子在电泳时都向正极移动。C1—速度最快(先导离子),其次为蛋白质,Gly 负离子最慢(尾随离子)。由于C1—很快超过蛋白离子,因此在其后面形成一个电导较低、电位梯度较陡的区域,该区电位梯度最高,这是在电泳过程中形成的电位梯度的不连续性,导致蛋白质和Gly 离子加 快移动,结果使蛋白质在进入分离胶之前,快、慢离子之间浓缩成一薄层,有利于提高电泳的分辨率。 2.分子筛效应 蛋白质离子进入分离胶后,条件有很大变化。由于其pH 升高(电泳进行时 常超过9.0),使Gly 解 离成负离子的效应增加;同时因凝胶的浓度升高,蛋白质的泳动受到影响,迁移率急剧下降。此两项变化,使Gly 的移动超过蛋白质,上述的高电压梯度不复 存在,蛋白质便在一个较均一的pH 和电压梯度环境中,按其分子的大小移动。分离胶的孔径有一定的大小,对不同相对分子质量的蛋白质来说,通过时受到的阻滞程度不同,即使净电荷相等的颗粒,也会由于这种分子筛的效应,把不同大小的蛋白质相互分开。

SDS-PAGE分离胶配方表-及其原理之令狐采学创编之欧阳家百创编

SDSPAGE电泳原理: 欧阳家百(2021.03.07) 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 (简称Acr) 和交联剂N,N’—亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂作用下,聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶,并以此为支持物进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带,如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质,蛋白质样品电泳后,就应只分离出一条区带。 SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键,并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物,使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷,掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此,各种蛋白质SDS 复合物在电泳时的迁移率,不再受原有电荷和分子形状的影响,而只是棒长的函数。这种电泳方法称为SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称SDS—PAGE)。由于SDSPAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度,因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度,如果被鉴定的蛋白质样品很纯,只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质,那么SDS—PAGE 后,就只出现一条蛋白质区带。TEMED:通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双 丙烯酰胺的聚合。

过硫酸铵(AP):提供驱动丙烯酰胺与双丙烯酰胺所必须的 自由基。 SDS—PAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。本实验采用垂直板状不连续系统。所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。 1.蛋白样品浓缩效应 在不连续电泳系统中,含有上、下槽缓冲液(Tris—Gly, pH8.3)、浓缩胶缓冲液(Tris—HCl,pH6.8)、分离胶缓冲液(Tris—HCl,pH8.8),两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。在这种条件下,缓冲系统中的HCl 几乎全部解离成Cl-,两槽中的Gly (pI=6.0,pK a=9.7)只有很少部分解离成Gly 的负离子,而酸性蛋白质也可解离出负离子。这些离子在电泳时都向正极移动。C1—速度最快(先导离子),其次为蛋白质,Gly 负离子最慢(尾随离子)。由于C1—很快超过蛋白离子,因此在其后面形成一个电导较低、电位梯度较陡的区域,该区电位梯度最高,这是在电泳过程中形成的电位梯度的不连续性,导致蛋白质和Gly 离子加快移动,结果使蛋白质在进入分离胶之前,快、慢离子之间浓缩成一薄层,有利于提高电泳的分辨率。 2.分子筛效应 蛋白质离子进入分离胶后,条件有很大变化。由于其pH 升高(电泳进行时常超过9.0),使Gly 解离成负离子的效应增加;同时因凝胶的浓度升高,蛋白质的泳动受到影响,迁移率急剧下降。此两项变化,使Gly 的移动超过蛋白质,上述的高电压梯度不复

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