二维色谱-质谱技术在蛋白质组学中的研究和应用

复旦大学

硕士学位论文

姓名：王静

申请学位级别：硕士

专业：分析化学

指导教师：杨芃原

20040519

二维色谱．质谱技术在蛋白质组学中的研究和应用

摘要

在蛋白质组学研究中，目前采用的技术主要有二维凝胶电泳（２Ｄ—ＰＡＧＥ）一质诺（ＭＳ）方法和多维色谱（ＬＣ）一质谱方法。随着全自动割胶、酶解、点样仪的出现，２Ｄ－ＰＡＧＥ技术自动化程度相对提高，整个分析时间也有所缩短，但是对于等电点极端的蛋白或膜蛋白仍无法达到很好的分离效果。近几年对该方法进行了～些改进，如对电泳前生物样品进行预浓缩和预分离、分步提取以及对凝胶的染色过程进行优化，但均未有实质性的进展。发展高通量分析技术平台是蛋白质组学研究的需要和方向，强阳离子交换（ＳＣＸ）色谱一反相（ＲＰ）色谱一质谱（ＭＳ）技术是其中引人注目的技术平台之一。本论文以二维色谱．质谱技术为基础，优化蛋白的提取、酶解、前处理以及后继的二维分离条件和步骤，以求在本实验室建立一个适用于复杂蛋白质混合物分离分析的高通量平台。

本论文的工作主要是围绕二维一色谱．质谱技术来展开的。考虑到酶解步骤在ＳｈｏｔｇＵＩ＇Ｉ技术中的重要性，首先利用标准蛋白来考察各种蛋白变性方法对酶活性以及蛋白去折叠的影响，同时也讨论了蛋白还原烷基化的必要性和有效性。并且考察了新型去垢剂ＡＬＳ在蛋白酶解中的应用，与ＳＤＳ相比，它具有很好的溶解能力，对酶活性的影响远比ＳＤＳ小，它在酸性条件下可以自动降解，降解物质不会影响后继的色谱分离，可以替代ＳＤＳ来溶解膜蛋白。根据溶液酶解的特点，结合现有的顺序提取蛋白的方法，对用二维色谱．质谱系统分离鉴定的蛋白提取方法作了如下改进：将提取步骤分为三步，第一步用水提取偏亲水性蛋白，第二步用含尿素和硫脲的溶液提取亲水性、中性和偏疏水性蛋白，第三步用去垢剂ＡＬＳ代替ＳＤＳ溶解剩余的不溶物质。

第二部分主要是二维色谱一质谱系统的建立及应用。首先对强阳离子交换色谱的实验条件进行优化，比较了流动相的ｐＨ值、有机溶剂的含量等因素对色谱分离的影响。根据优化实验条件的结果，以实验室现有的仪器装置为基础，建立了离线二维系统和在线二维系统。通过肌红蛋白的酶解肽段的分离鉴定，对离线二维系统中的反相上样时的传输溶液、组分收集时间以及在线系统中的进样盐浓度等一些参数进行了讨论。并且比较了在线和离线系统，离线系统灵活性比较强，可以分别优化每一维的实验条件，上样量不受第二维反相色谱的制约，能够富集低丰度肽段：在线系统整合性比较强，适合于少量样品的分离鉴定，而且对控制

ＳＣＸ柱的色谱仪损害比较小。最后，利用离线二维系统分离Ｄ２０裸鼠肝肿瘤组织的水溶性蛋白，鉴定得到１０１个蛋白组分，在大分子范围（相对分子量＞２００，０００Ｄａ）及碱性范围（ｐＩ＞１０）内均有蛋白被检出，蛋白数量也明显多于用２Ｄ—ＰＡＧＥ．ＭＳ技术鉴定出来的蛋白个数。另外，利用去垢剂ＡＬＳ溶解红细胞膜蛋白，用在线二维系统分离鉴定出大量的膜蛋白，弥补了常规的二维凝胶一质谱技术对膜蛋白的歧视效应，

关键词：蛋白质组学、多维色谱．质谱技术、蛋白酶解、蛋白提取、强阳离子交换色谱、离线二维系统、在线二维系统

ＴｈｅＳｔｕｄｙｏｆ２Ｄ－－ＬＣ－－ＭＳａｎｄＩｔｓＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｔｏ

Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ

Ａｂｓｔｒａｃｔ

Ｉｎｐｒｏｔｅｏｍｉｃｒｅｓｅａｒｃｈ，ｐｒｏｔｅｉｎｓａｒｅｔｙｐｉｃａｌｌｙｓｅｐａｒａｔｅｄｂｙｔｗｏ—ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（２Ｄ—ＰＡＧＥ），ｔｈｅｎｄｉｇｅｓｔｅｄａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｍａｓｓ

ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＭＳ）、Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅＣａｎｎｏｔｂｅａｐｐｌｉｅｄｔｏｔｈｏｓｅｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｗｉｔｈｅｘｔｒｅｍｅｐｌａｎｄｙｉｅｌｄｓｐｏｏｒｒｅｓｕｌｔｓｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｆｏｒｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，

ｉｔｉｓｖｅｒｙｔｉｍｅｃｏｎｓｕｍｉｎｇａｎｄｄｉｆｆｉｃｕｌｔｔＯｈｅｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙａｕｔｏｍａｔｅｄ．Ｔｈｕｓ，ｔｈｅｒｅｉｓａｎｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｄｅｍａｎｄｉｎｇｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈｎｅｗｈｉ曲?ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔａｎｄｈｉ曲ａｃｃｕｒａｃｙｔｅｃｈｎｉｃａｌｐｌａｔｆｏｒｍｓｆｏｒｐｒｏｔｅｏｍｉｃｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｍｕｃｈａｔｔｅｍｐｔｈａｓｂｅｅｎｔｈｒｏｗｎｔｏｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｍｕｌｔｉ—ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ—ｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ＿ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｏｎｅｏｆｔｈｅｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｉｓ２Ｄ—ＳＣＸ－ＲＰＬＣ－ＭＳ，ｉｎｗｈｉｃｈｐｅｐｔｉｄｅｓａｒｅｆｉｒｓｔ

ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄｂｙＳＣＸａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｉｒｃｈａｒｇｅａｎｄｔｈｅｎｓｅｐａｒａｔｅｄｂｙＲＰＨＰＬＣａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｉｒｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ，Ｉｎｔｈｉｓｔｈｅｓｉｓｗｏｒｋ，ｂｏｔｈｏｎ—ｌｉｎｅａｎｄｏｆｆ－ｌｉｎｅｓｙｓｔｅｍｓｈａｖｅｂｅｅｎｆｕｒｔｈｅｒｏｐｔｉｍｉｚｅｄｆｏｒｔｈｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃｏｍｐｌｅｘｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓａｍｐｌｅｓｓｕｃｈａｓｔｈｅｃａｎｃｅｒｔｉｓｓｕｅａｎｄｔｈｅｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｎｅｗｔｙｐｅｏｆ

ｅｎｈａｎｃｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙＳｏａｓｔｏｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｄｅｔｅｒｇｅｎｔｉｓｓｔｕｄｉｅｄｈｅｒｅｔｏ

ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｏｆｔｈｅｗｈｏｌｅｓｙｓｔｅｍ．

Ｔｈｅｆｉｒｓｔｐａｒｔｏｆｔｈｉｓｔｈｅｓｉｓｉｎｖｏｌｖｅｓｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｅｎｚｙｍａｔｉｃｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓａｎｄｓａｍｐｌｅｈａｎｄｌｉｎｇ，ｗｈｉｃｈａｒｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｆｏｒｔｈｅＳｈｏｔｇｕｎｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｔｈｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆ

ａｎｄｔｈｅａｂｉｌｉｔｙｏｆｐｒｏｔｅｉｎｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ，ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｒｅｄｕｃｔｉｏｎ／

ｔｒｙｐｓｉｎｄｉｇｅｓｔｉｏｎ

ａｌｋｙｒｌａｔｉｏｎｗｅｒｅｄｉｓｃｕｓｓｅｄｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｅｎｚｙｍａｔｉｃｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｆｏｒｓｔａｎｄａｒｄｐｒｏｔｅｉｎｓ．

ｔｗｏ

Ｉｎｔｈｉｓｐａｒｔ，ｕｓｅｏｆｔｈｅｎｅｗｄｅｔｅｒｇｅｎｔＡＬＳｉｓｐｒｏｐｏｓｅｄ，ｗｈｉｃｈｉｓｄｅｇｒａｄｅｄｉｎｔｏ

ｄｏｎｏｔｉｎｔｅｒｆｅｒｅｔｈｅ

ｐｒｏｄｕｃｔｓｕｎｄｅｒａｃｉｄｉｃｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓ

ＬＣ—ＭＳａｎａｌｙｓｉｓ．ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｄｅｔｅｒｇｅｎｔＳＤＳ，ＡＬＳｈａｓａｇｏｏｄａｂｉｌｉｔｙｏｆｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓｌｉｋｅＳＤＳ，ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ，ｉｔｄｏｅｓｎｏｔｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｔｒｙｐｓｉｎａｃｔｉｖｉｔｙ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｌｙ，ＡＬＳｉｓａｒｅａｌｉｚｅｄｄｅｔｅｒｇｅｎｔａｎｄｃａｎｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＳＤＳｔｏｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎｓ．

Ｃｏｎｓｉｄｅｒｉｎｇｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆｉｎ—ｓｏｌｕｔｉｏｎｄｉｇｅｓｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｅｘｔｒａｃｔ

ｍｅｔｈｏｄｗｈｉｃｈｉｓｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒ２Ｄ－ＰＡＧＥ，ｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｎｇｓｔｅｐｓｕｓｅｄｉｎ２Ｄ－ＬＣ—ＭＳａｒｅ

ｍｏｄｉｆｉｅｄ．

Ｉｎｔｈｅｓｅｃｏｎｄｐａｒｔ，ｗｏｒｋｉｎｇｐａｒａｍｅｔｅｒｓｏｆｔｈｅｈｏｍｅ—ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ２Ｄ—ＬＣ—ＭＳ

ｓｙｓｔｅｍｈａｓｂｅｅｎｏｐｔｉｍｉｚｅｄａｎｄｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｈａｖｅｂｅｅｎａｐｐｌｉｅｄｔｏｔｈｅｐｒｏｔｅｏｍｉｃａｎａｌｙｓｉｓＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓｏｆｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇｔｈｅｐＨｏｆｓｏｌｖｅｎｔ，ａｄｄｉｎｇａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅｉｎＳＣＸｍｏｂｉｌｅ

ａｎｄａｄｊｕｓｔｉｎｇｔｈｅｇｒａｄｉｅｎｔｏｆｓａｌｔａｒｅｕｓｅｄｔｏｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｐｈａｓｅ，ｄｅｓａｌｔｉｎｇｔｈｅｓａｍｐｌｅ

ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｏｆＳＣＸｃｏｌｕｍｎｉｎｐｅｐｔｉｄｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎ．ＳａｍｐｌｅｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｔｉｍｅａｎｄｓｏｌｖｅｎｔｆｏｒｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇＳＣＸｆｒａｃｔｉｏｎｓｔｏｔｈｅＲＰｃｏｌｕｍｎｉｎｔｈｅｏｆｆｉｉｎｅｓｙｓｔｅｍｏｆ２Ｄ－－ＬＣ?－ＭＳａｎｄｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｓａｌｔｉｎｔｈｅｏｎｌｉｎｅｓｙｓｔｅｍａｒｅｔｅｓｔｅｄａｎｄｏｐｔｉｍｉｚｅｄＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｏｎｌｉｎｅｓｙｓｔｅｍ，ｔｈｅｏｆｆｉｉｎｅ２Ｄ—ＬＣｓｙｓｔｅｍｉｓｍｕｃｈｅａｓｉｅｒｔｏｍａｎａｇｅｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆＳＣＸａｎｄＲＰｃｏｌｕｍｎｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｏｎｔｈｅｏｔｈｅｒｈａｎｄ，ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｔｈｅｑｕａｎｔｉｔｙｏｆｓａｍｐｌｅｗｉｌｌｅｎｒｉｃｈｔｈｅｌｏｗａｂｕｎｄａｎｃｅｐｅｐｔｉｄｅｓｉｎｔｈｅｏｆｆｉｉｎｅｓｙｓｔｅｍ，ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｉｓａｐｐｒｏａｃｈｉｓｎｏｔｓｕｉｔｅｄｆｏｒｔｈｅｏｎｌｉｎｅｓｙｓｔｅｍｄｕｅｔｏｔｈｅｌｉｍｉｔｅｄｓａｍｐｌｅｌｏａｄｉｎｇｑｕａｎｔｉｔｙｏｆｔｈｅｓｅｃｏｎｄｄｉｍｅｎｓｔｉｏｎ．Ｉｎｃａｓｅ，ｔｈｅｓａｍｐｌｅｉｓｔＯＯｌｅｓｓｉｎｑｕａｎｔｉｔｙ，ｔｈｅｏｎｌｉｎｅｓｙｓｔｅｍｉｓｕｓｅｄｐｒｉｏｒｔｏｔｈｅｏｆｆｉｉｎｅｓｙｓｔｅｍ．Ｔｈｅｏｆｆｉｉｎｅｓｙｓｔｅｍｈａｓｂｅｅｎａｐｐｌｉｅｄｔｏｔｈｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｃａｎｃｅｒｔｉｓｓｕｅｏｆｎｕｄｅｍｉｃｅｉｎｏｃｕｌａｔｅｄｂｙａｈｕｍａｎ—ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ－ｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌ—ｌｉｎｅＤ２０．Ｔｈｅｅｘｔｒｅｍｅｂａｓｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓ（ｐｌ＞１０）ａｎｄｌａｒｇｅｒｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＭＷ＞２００，０００Ｄａ），ｗｈｉｃｈａｒｅｄｉｆｆｉｃｕｌｔｔｏｉｓｏｌａｔｅｂｙ２Ｄ—ＰＡＧＥ，ｈａｖｅｂｅｅｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｔｗｏｒｋＩｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎｓａｒｅｄｉｓｓｏｌｖｅｄｂｙｔｈｅｐｒｏｐｏｓｅｄｄｅｔｅｒｇｅｎｔＡＬＳ，ａｎｄｓｅｐａｒａｔｅｄｂｙｏｎｌｉｎｅｓｙｓｔｅｍ．Ａｌａｒｇｅｎｕｍｂｅｒｏｆｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎｓａｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ，ｗｈｉｃｈａｒｅｎｏｔｓｕｉｔａｂｌｅｔｏｂｅｉｓｏｌａｔｅｄｂｙ２Ｄ—ＰＡＧＥ．

ＫｅｙｗｏｒｄｓＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：Ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ—ｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ—ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ；Ｓｔｒｏｎｇｃａｔｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；Ｐｒｏｔｅｉｎｄｉｇｅｓｔｉｏｎ；Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｅｘｔｒａｃｔ：Ｏ母ｉｎｅ２Ｄ．ＬＣ：０ｎｌｉｎｅ２Ｄ—ＬＣ

４

第一章前言

这种技术，对于高等真核细胞，可以得到超过１０，０００个蛋白点［Ｉｌ，‘２１。另外，将胶条的长度增加，使用２４ｃｍ的胶条可以增加分离的距离，提高分辨率㈣。

图ｌ传统二维凝胶电泳一质谱研究蛋白质组学流程图

随着自动点切割仪（用于胶上蛋白质点切割）、自动样品处理机（用于胶上蛋白质酶切、回收与点靶）等仪器的出现，大大减轻了２－ＤＥ后样品处理的繁复的手工操作，缩短了时间，提高了效率，更重要的是提高了样品处理的重复性，避免了手工操作易产生的污染。另外，一种可同时运行１２块胶的二向ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳槽已经研制成功并商品化，使得二向电泳一次可平行分析的样品数量与一向ＩＥＦ电泳相匹配（一向电泳槽可乎行进行１２个样品的分析），从而大大提高了２－ＤＥ分析的通量。

目前。胶上酶解的肽段主要是用ＭＡＬＤＩ（ｍａｔｒｉｘ．ａｓｓｉｓｔｅｄｌａｓｅｒｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）一ＴＯＦ（ｔｉｍｅｏｆｆｌｉ曲ｔ）质谱仪１１４］来检测。该仪器操作方便，自动化程度高，具有良好的质量精度、分辨率和灵敏度，可以通过肽质量指纹法（ｐｅｐｔｉｄｅｍｏｓｓｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｅｉｎｇ，ＰＭＦ）【Ｊ””ｌ进行蛋白质鉴定。同时，它也可以进行串级质谱分析，通过肽段的碎片信息来鉴定蛋白。

尽管２－ＤＥ在蛋白质组研究中已获得广泛的应用，但是以２－ＤＥ为基础的蛋

此，该系统能够在一维色谱一质谱和二维色谱．质谱之间进行转化以满足不同复杂程度样品的分离鉴定。

幽４，Ｄａｖｉｓ等设计的一维色谱一质谱分离鉴定技术平台

图５．ＬＣＰＡＣＫＩＮＧＳ公司的二维毛细管液相色谱。

另外，也有在ＳＣＸ柱之后通过十通阀并行连接多个反相柱，通过阀切换，使得每根柱子处于不同的状态（上样、洗脱、平衡），只将处于洗脱状态的反相柱与质谱连接‘２争２７’（图６）。这种系统装置也已商品化，是ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ公司

纂器事

蚕奄简辫解条镣爨窦艨蚕镐撵品确凌藏

第二章蛋白的酶解条件发实际蛋白样品的处理第一节用标准蛋白优化酶解条件

在蛋白质组学研究中，高通量分析生物样品是关键所在。其中的一个方法就是采用Ｓｈｏｔｇｕｎ技术，它是先将所有的蛋白酶解，然后将获得的肽段用多维ＬＣ．ＭＳ分离鉴定。除了优化多维ＬＣ—ＭＳ的操作条件来增加整个体系的柱容量和灵敏度外，混合蛋白的酶解效率也不容忽视。为了尽可能多的得到体系中蛋白的信息，要求所有的蛋白都被酶解，并且能够提供一定数量的肽段，但是每个蛋白各不相同，最佳的酶解条件也不一样。因此，在本文中选取一些比较常见的酶解方法，通过对比标准蛋白的酶解效果，找出一种较具普适性的方法。

本文选择肌红蛋白（Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ，马心）、细胞色素Ｃ（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣ，马一ｔｌ，）和牛血清白蛋白（ＢＳＡ）三种标准蛋白作为实验对象。肌红蛋白是一种水溶性的球蛋白，它由８个ｃｃ．ｈｅｌｉｃｅｓ组成，基本上所有的疏水部分都在蛋白内部，而亲水部分向外，因此它易溶于水，但是不容易被酶解１４８ｌ，利用它来评价蛋白变性的方法。细胞色素Ｃ正相反，它不仅溶于水，而且很容易被酶解，对酶解的条件也很敏感””，可以用它来评价胰蛋白酶（ｔｒｙｐｓｉｎ）的酶解效率。ＢＳＡ含有１７个二硫键，可以用来评价还原烷基化反应的必要性和有效性。

１Ｃ

１Ａ

１Ｂ

掺鞲

图１，蛋白的结构。（１Ａ）肌红蛋白的结

构（ｏｘｙ，ｐＨ８．４，ｓｐｅｒｍｗｈａｌｅ），（１Ｂ）细

胞色素ｃ的结构（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍｖｉｎｏｓｕｍ

ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣ’ｄｉｍｅｒ）。（１Ｃ）牛血清白蛋

白的结构。

１．实验部分

１．１实验仪器和试剂

ＨＰｌｌ００毛细管液相色谱二元泵（安捷伦公司），六通阀（７７２５，Ｒｈｅｏｄｙｎｅ），Ｅｓｑｕｉｒｅ３０００电喷雾离子阱质谱仪（Ｂｒｏｋｅｒ公司，德国），ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４７００

第二章蛋白的酶解条件及实际蛋白样品的处理

ＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓＡｎａｌｙｚｅｒ（ＭＡＬＤＩ—ＴＯＦ－ＴＯＦ，ＡＢＩ公司）。

反相色谱柱（ＺＯＲＢＡＸ３００ＳＢ，０．３ｘ１５０ｔｕｒｎ，３．５ｕｍ）购自安捷伦公司。

肌红蛋白（Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ，马心）、细胞色素Ｃ（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃ，马心）、胰蛋白酶（ｔｒｙｐｓｉｎ，非测序级）和ＣＨＣＡ（Ⅸ一Ｃｙａｎｏ一４－ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｒｍａｍｉｃａｃｉｄ）购自Ｓｉｇｍａ公司，牛血清白蛋白（ＢＳＡ）购自华美生物工程公司，甲醇（ＭｅＯＨ，ＨＰＬＣ级）、乙腈（ＡＣＮ，ＨＰＬＣ级）购自Ｍｅｒｃｋ公司，甲酸（ＦＡ，９９％）购自Ａｃｒｏｓ公司，三氟乙酸（ＴＦＡ）购自ＴＥＤＩＡ公司，碳酸氢铵购自上海化学分析试剂有限公司，二硫代苏糖醇（１，４．Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，ＤＴＴ）和尿素（Ｕｒｅａ）购自上海博光生物科技有限公司，碘乙酰胺（ＩＡＡ）购自Ｆｌｕｋａ公司，ＰＭＳＦ（苯甲基磺酰氟，ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ）购自上海华舜生物工程有限公司，ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍｎ—ＤｏｄｅｃｙｌＳｕｌｆａｔｅ）购自ＣＡＬＢｌ０ＣＨＥＭ公司，ＡＬＳ（Ａｃｉｄｌａｂｉｌｅｓｕｒｆａｃｔａｎｔ，ＲａｐｉＧｅｓｔｒＭＳＦ）购自Ｗａｔｅｒｓ公司。

１．２标准蛋白的酶解

将肌红蛋白、细胞色素Ｃ、牛血清白蛋白分别配成一定浓度的蛋白溶液（２ｇｇ／ｐＪ或４ｐ∥肚１），根据实验条件加入各种试剂（含有８ＭＵｒｅａ的蛋白溶液，采用含５０ｍＭＮＨ４ＨＣ０３的８ＭＵｒｅａ溶液来溶解蛋白固体），最后以底物，酶质量比为４０／１加入胰蛋白酶，３７℃酶解过夜。

还原烷基化的实验条件［２９１：加入一定浓度的ＤＴＴ，３７。Ｃ恒温ｌｈ，然后再加入ＩＡＡ，在室温黑暗处反应Ｏ．５ｈ。

用ＡＬＳ作为变性剂时，酶解时问相应缩短，酶解完后加入５５０ｍＭＨＣＩ（加入的体积为样品体积的１／１０）将样品酸化，然后３７℃恒温反应４５ｍｉｎ，将样品取出离心（１３，０００ｒｐｍ）１０ｍｉｎ，取上清液保存。

１．３干扰测试

取２ｐｌ２斗ｇ／ｐｌ的ｃｙｔｏｅｈｒｏｍｅｃ和ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ的酶解肽段（含５０ｍＭＮＨ４ＨＣ０３）各２“ｌ，分别与２山的Ｏ．５％ＳＤＳ、Ｏ．１％ＳＤＳ、Ｏ．０５％ＳＤＳ、８ＭＵｒｅａ、４ＭＵｔｅａ、２ＭＵｒｅａ、５０ｍＭＤＴＴ、１０ｍＭＤＴＴ、ｌｍＭＤＴＴ、０．５％ＡＬＳ、Ｏ．１％ＡＬＳ、０．０５％ＡＬＳ（蛆上溶液均用５０ｍＭＮＨ４Ｈｃ０３配置）混合，然后用含０．１％ＴＦＡ的水溶液稀释４０倍，留待后面的质谱检测。

１．４质谱的检测和鉴定条件

将肌红蛋白和细胞色素ｃ、牛血清白蛋白的酶解溶液用含Ｏ．１％ＴＦＡ的水溶液分别稀释至Ｏ，０２５“ｇ似ｌ、０．０２５斗ｇ以上１、０．０５０“∥Ⅲ，取Ｏ．３“ｌ点样至ＭＡＬＤＩ

板上，然后再点上０．３ｕｌ饱和的ＣＨＣＡ溶液（用Ｏ．１％ＴＦＡ．５０％ＡＣＮ水溶液配置），吹干，用４７００检测，每个样品两个点。ＭＡＬＤＩ的激光电压设为３６００Ｖ，所有点均只作ＰＭＦ。将获得的实验数掘根据ｓ，Ｎ＝２０输出，利用Ｍａｓｃｏｔ的肽指纹谱（ＰＭＦ，ＰｅｐｔｉｄｅＭａｓｓＦｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ）数据搜索功能进行检索，允许漏切位点（ｍｉｓｓｅｄｃｌｅａｖａｇｅｓ）的最大数为２，肽谱中质量偏差±Ｏ．３Ｄａ，数据库选择ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ。

上述的部分样品还用ＬＣ．ＭＳ进步分离鉴定。反相色谱的流动相Ａ是０．１％ＦＡ—Ｈ２０，流动相Ｂ是Ｏ．１％ＦＡ．ＡＣＮ。色谱柱的流速为５ｇｌ／ｍｉｎ。采用如下梯度程序：０～４５ｒａｉｎ，Ｂ相由５％上升到６５％；４５～５０ｒａｉｎ，上升至９５％；５０～５５ｍｉｎ，保持９５％Ｂ。肽段上样量是０．５ｕｇ。质谱仪是Ｅｓｑｕｉｒｅ３０００，干燥气设为６Ｌ／ｍｉｎ。质谱采用自动串级分析，每次全扫描时，在质荷比ｒｎ／ｚ４００一１６００范围内选择２个强度最高的母离子打碎。断裂能量幅值为１．２Ｖ，母离子强度阈值设为１×１０５。将实验获得的肽段信息送入数据库，使用Ｍａｓｃｏｔ中的串级质谱数据搜索功能（Ｍｓ／ＭｓＩｏｎｓＳｅａｒｃｈ）进行检索，选择ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ数据库，选择胰蛋白酶为裂解酶，允许漏切位点（ｍｉｓｓｅｄｃｌｅａｖａｇｅｓ）的最大数为２，肽段电荷数（ｐｅｐｔｉｄｅｃｈａｒｇｅ）设为＋１，＋２ａｎｄ＋３，肽谱中质量偏差±２．０Ｄａ，串级质谱中质量偏差±Ｏ．８Ｄａ。

２．结果与讨论

２．１变性剂对肽段电离的影响

为了保证ＭＡＬＤＩ结果的准确性，事先将一定量的变性剂与己酶解的肽段混合，稀释一定的倍数，然后用ＭＡＬＤＩ—ＴＯＦ检测，发现这些变性剂在稀释到这样的浓度以后，对肽段的ＭＡＬＤＩ质谱分析基本没有影响，将加入变性剂的ＰＭＦ图与未加变性剂的ＰＭＦ图相比，谱图基本一致，离子强度也差不多。

２．２加热变性对酶解的影响

加热变性【５４，５５１是最常用的一种变性手段，只要将蛋白溶液在沸水浴中煮沸几分钟，就可以将蛋白结构打开，使得其结构松散，有利于进一步酶解，而且不会引入其它物质。将图２Ａ和２Ｂ比较，可以看出加热对ｃｙｔｏｃ｝啪ｍｅｃ的酶解没有很大的帮助，两张质谱图基本一样，说明ｃ”ｏｃｈｒｏｍｅｃ本身很容易酶解，不需要其它额外的助力。然而，对于ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ而言，不利用加热将蛋白的球形结构打开，它基本上不被酶解（图３Ａ和３Ｂ）。

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幽２，ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｃｃ的肽指纹谱图。酶解时，ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃ的浓度为２“∥山（含５０ｍＭＮＨ４ＨＣ０３），（２Ａ）未加热。（２Ｂ）］００＂Ｃ）Ｊｎ热２ｍｉｎ。

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．３Ａ

第二章蛋白的酶解条件发实际蛋白样品的处删

３Ｂ

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蚓３，ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ的肽指纹谱图。酶解时，ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ的浓度为２雌，ｐ．Ｉ（禽５０ｍＭＮＨ４ＨＣ０３）

（３Ａ）未加热，（３Ｂ）１００℃加热２

ｍｉｎ。但是加热的方法是有缺陷的，主要是在它引起蛋白变性的同时，还会导致某些蛋白沉淀。表１列出了ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣ和ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ加热后和酶解后溶液中的一些情况。对于ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｅ而言，一旦加热有沉淀产生，酶解后沉淀不消失，相反，ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ加热产生的沉淀一般在酶解后是能消失的。所以，采用加热这个方法时，要注意控制加热时间，并适当降低加热的温度，防止蛋白由于凝聚而引起的损失。另外，要避免在高浓度蛋白、低盐浓度及蛋白等电点附近的条件【５４１下使用加热方法。

加热时间ＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃＭｙｏｇｌｏｂｉｎ

Ｏ．５ｍｉｎ澄清／澄清

混浊／澄清２ｍｉｎ混浊／沉淀絮状沉淀／澄清

）ｍｌｎ絮状沉淀／沉淀絮状沉淀／澄清

１０ｍｉｎ

絮状沉淀／沉淀絮状沉淀／澄清表Ｉ，ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃ和ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ加热酶解的实验现象（加热后，酶解后）。加热温度为１００。Ｃ。

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