EM菌活菌总数检测方法
活菌数的检测方法
1主题内容与适用范围
本方法规定了活菌总数的测定方法；
本方法适用于EM菌中活菌总数。
2方法提要
活菌总数是指水样在一定条件下培养后(培养基成分，培养温度和时间、pH、需
氧性质等)所得1mL水样所含菌落的总数。
3 培养基与试剂
3.1 营养琼脂成分
LB培养基：(用于检测酵母菌数)
蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaCl 1%，琼脂2%。121℃，30min灭菌。
MRS培养基：(用于检测乳酸菌数)
葡萄糖2%，蛋白胨1%，牛肉膏1%，酵母膏1%，乙酸钠0.5%，Tween-80 0.2%，柠檬酸铵0.2%，K2HPO4 0.2%，MgSO4·7H2O 0.06%，MnSO4·H2O 0.02%，pH 6.5，琼脂2%，115℃，30min灭菌。
3.2 制法: 将上述成分混合后，加热溶解，调整pH为7.2，分装于玻璃容器中
(如用国产含杂质较多的琼脂时，应先过滤)，经121℃灭菌20min，储存于冷暗处备
用。
3.3生理盐水的制备：按总体积的0.9%称量NaCl并混合均匀，然后用移液枪或
移液管吸取9ml生理盐水加入到试管中，并在121℃灭菌20min备用。
4 仪器
高压蒸汽灭菌器，干热灭菌箱，培养箱，36±1℃，电炉，天平，冰箱，
pH计，灭菌试管，平皿(直经9cm)、刻度吸管等。
5活菌计数方法
5.1 固体样品取5.0g，溶于95mL蒸馏水(此时稀释20倍)，加入适量已灭菌玻璃珠，于200rpm摇床中振荡20min；液体样品直接吸取1ml样品液至装有9ml无菌水的试管中进行梯度稀释。
5.2用移液枪从锥形瓶取1ml样品液至装有9ml无菌水的试管中，逐步稀释至适当梯度。
5.3 吸取0.2mL适当稀释梯度的菌液放入对应平板中，用已灭菌的涂布棒来回涂匀。
5.4 涂匀的平板置于30℃培养箱中培养20~30h，待长出清晰可见的菌落，进行计数。
6菌落计数及报告方法
作平皿菌落计数时，可用眼睛直接观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记
下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。在求同
稀释度的平均数时，若其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无
片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落不到平皿一半，而其余
一半中菌落数发布又很均匀，则可将此平皿计数后乘2 以代表全皿菌落数。然后再
求该稀释度的平均菌落数。
7 不同稀释度的选择及计数方法
7.1 首先选择平均菌落数在30～300之间者进行计算，若只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则将该菌落数乘以稀释倍数报告之。
7.2有两个稀释度，其生长的菌落数均在30～300之间，则视二者之比值来决定，若其比值小于2应报告两者的平均数。若大于2 则报告其中稀释度较小的菌落总数。若等于2亦报告其中稀释度较小的菌落数。
7.3 若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
7.4 若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应以按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告。
7.5 若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，则应以最接近30或300
的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
7.6 若所有稀释度的均无菌落生长，则以〈1乘以稀释倍数报告之。
7.7 菌落计数的报告: 菌落数在100以内时按实有数报告，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示。
细菌总数测定操作规程
细菌总数检测操作规程 1 原理 试样经过处理，稀释至适当浓度，在一定条件（如使用特定的培养基，在温度30℃±1℃培养72h±3h等）下培养后，所得1g（mL）试样中所含细菌总数。 2 试剂与仪器 2.1 所用器具 三角烧瓶、玻璃珠、具塞试管、培养皿、1000μL枪头、5mL枪头、称量勺、接种环、接种针、移液器 2.2 仪器：分析天平、恒温培养箱、微型振荡器、超净工作台、高压灭菌锅 2.3 所用试剂和培养基 营养琼脂 取营养琼脂32.0g，加入蒸馏水1L，搅拌加热至完全溶解，分装三角瓶，121℃高压灭菌15min，备用。 3、操作步骤 3.1配制0.85%生理盐水。 称取氯化钠8.5g溶于1000mL蒸馏水中。 3.2三角烧瓶加入生理盐水90mL和玻璃珠，试管中加入生理盐水9mL，121℃灭菌30min。（三角烧瓶个数与样品数量一致，试管数量与稀释次数相关） 3.3将1000μL枪头、培养皿、5mL枪头、称量勺，121℃灭菌30min。（注意计算数量）3.4将枪头、培养皿置于烘箱103℃烘干。（1-3步需提前一天完成） 3.5对称量房间进行紫外灭菌30分钟，关灯静置60 min。以无菌操作取样品10g于含90mL 生理盐水三角烧瓶中，于振荡器上振荡30min，制成1:10的均匀稀释液。 3.6用1000μL枪头吸取1:10稀释液1mL，沿管壁慢慢注入含有灭菌生理盐水9mL的试管中，于振荡器上混合均匀，制成1:100的均匀稀释液。 3.7另去一只1mL灭菌吸管，按照上述操作方法，作10倍递增稀释，如此每递增稀释一次，即更换一支灭菌吸头。 3.8选择2个~3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个培养皿。 3.9稀释液移入培养皿后，及时将凉至46℃±1℃的培养基（可放置46℃±1℃水浴锅内保温）注入培养皿约15mL，小心转动培养皿使试样与培养基充分混匀（从稀释试样到倾注培.
em菌发酵剂怎么发酵鸡粪
em菌发酵剂是微生物制剂，可以用来发酵多种的粗饲料来饲养动物，例如：粪便、潲水、豆渣、秸秆、豆粕等。em菌发酵剂来发酵鸡粪喂猪可以提高猪的免疫力减少生病，还可以改变鸡粪的适口性，像鸡粪我们都知道，鸡的肠胃较短吃进去的饲料有些根本来不及消化吸收就随着粪便排解出去，不过这些粪便在经过em菌发酵剂发酵过之后却是用来喂猪很好的饲料，因为从本身改变了鸡粪的适口性，所以猪非常爱吃。 那怎么来使用em菌发酵剂来发酵鸡粪喂猪的呢？ 由于鸡的肠子较短，食物在肠道中逗留的时间不长，吃下饲料中的养分一般只能吸收30%左右，大部分通过直肠而被排出体外。鸡粪中含有的营养物质随鸡所摄取饲料的不同而有所差异，一般地说，每公斤鸡粪的干物质中有13.4～18.8千焦的总能量，其含氮量达30～70克。现在使用农盛乐粪便发酵剂即（农盛乐饲料发酵剂）将鸡粪发酵过后就可以直接来喂猪了，因为鸡粪发酵过后是很好的喂猪饲料。 既然鸡粪里面含有这么多的营养成分，那该怎么用粪便发酵剂来发酵鸡粪喂猪的呢？ 1、鸡粪的收集 (1)使用的鸡粪必须是健康鸡的粪便，越新鲜质量越好。如果是饲喂大剂量抗生素添加剂的鸡粪，使用 (2)为避免营养的损失，夏季不要超过一日清粪，冬季不要超过三日，以当日清理当日发酵效果最好 2、发酵料配制
将无霉变无病菌的新鲜鸡粪60%(或鸽子粪、鸭粪也可发酵使用)，玉米粉15%，谷糠10%、麦麸5%、农盛乐粪便发酵剂0.5-1%(加入与菌液等比例红糖效果更好)，充分搅拌均匀，调节水分到60%左右(可以提前将农盛乐粪便发酵剂加入适量水中稀释，更利于其搅拌均匀)。其简单判断办法为：即用手紧抓物料一把能成团，松手落地能散开为宜，水分过高过低均不利。然后装入塑料袋或能密封的池子(缸或者做个小发酵池)，密封发酵5-7天(冬天时间略长)，当鸡粪呈黄绿色，无臭味而略带酒酸味时(发酵时间过长酒味过浓)，发酵基本完成，即可饲喂。饲喂时应注意遵从“由少到多，慢慢适应”的原则，猪很爱吃，不易生病，皮毛红润发亮，喜睡，一般能替代最多30%的精饲料。 3、鸡粪发酵后喂猪的技术 发酵后鸡粪的缺点是：能值仍然较低，非蛋白氮仍然较多，所以，需要结合能量高的饲料如玉米、大小麦、薯粉，高粱、麦麸等一起喂养，同时供给大量的清洁饮水，而对于生长较快的动物如肉用仔鸡，肉用仔猪等，不宜多喂。 ①空怀母猪和怀孕前90天的母猪：发酵鸡粪50%、玉米37%、麦麸7%、豆粕6%。(注意先从5%开始用起，慢慢增加用量，有一个适应的过程)，将上述混合饲料混合拌匀后喂猪更好。怀孕90天后的、哺乳母猪要少量饲喂或不饲喂发酵鸡粪。 ②中大猪：发酵鸡粪30%、玉米45%、麦麸5%、豆粕18%、鱼粉2%、。(注意先从5%开始用起，慢慢增加用量，有一个适应的过程)，将上述混合饲料混合拌匀后喂猪。
军团菌
军团菌：空调和热水系统中隐藏的危机 Marco & Mario Doninelli---Caleffi S.p.A 1．1军团菌的历史起源 军团菌（Legionella)一词来源于1976年7月发生在美国费城的一次越战退役军人聚会：参加聚会的约2000名士兵中221人感染了肺炎，其中34人死亡。经过调查发现了病源的起因为空调系统中滋生的一种前所未有的细菌。1978年国际上正式将这种病命名为军团菌病（Legionaire’s Disease）(注:Legionaire 为‘军团’的俚称)。 研究表明，军团菌的病原有近40种：其中的嗜肺军团杆菌（legionella pneumophilia）是最危险的一种，它会引起以肺炎为主的全身性疾病。 图1 水系统中存在的军团菌 1.2 军团菌的临床表现 军团菌从临床表现上分为以下两种：
?庞提亚克热（Pontiac Fever） 通常潜伏期在1-2天，临床表现为高烧、肌痛、头痛和肠胃不适（不经常）。 没有肺炎。这类军团菌的感染通常转化为普通感冒，可用抗生素药治疗，不用住院即可。 ?军团菌病 通常潜伏期在5-6天，临床表现为高烧、肌痛、头痛、胸痛、腹泻、干咳、肾衰竭、感觉迟钝、精神混乱、休克等。 这类感染与其它细菌性的或非典型的肺炎很难区别。 这种疾病如果发现太晚或治疗不及时，病死率高达45%。 1.3 军团菌的感染方式、发病机率等特征 军团菌通过呼吸道雾化吸入细菌水颗粒感染。饮用细菌感染的水或者人与人之间的接触不会感染。 中老年人以及有慢性心、肾、肺、血液病、吸烟、酗酒者易受感染，同样年龄和性别也是一大因素，图2为法国1998年调查的数据，表明男性年长者发病率更高。
大肠杆菌的检测(MPN计数法)
食品微生物检验技术课程综述 大肠杆菌的检测（MPN计数法） 院系：食品科学与药学学院 班级：食科114 姓名：张花 学号： 114031431 组长：张军玲 成员：张花 赵晶郁 朱娟娟 大肠杆菌Petrifilm测试片计数法 摘要 食品检测是反映食品加工、贮藏、运输、等环节的卫生与安全状况的重要手段，而大肠菌群检测则是食品检测的重要指标均之一。根据定义大肠菌群是在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和碱性厌氧的革兰氏阴性芽胞杆菌。其主要检测意义在于反映食品卫生状况并推测其在肠道致病菌的可能性。Petrifilm大肠菌群测试片是由美国3M生产的一种预先制备好的VRB平板培养基系统，并添加了TTC作为菌落指示剂便于菌落判读，而上层薄膜可以起到对大肠菌群发酵产生的气体截留的作用。该方法目前已被多数权威机构认可，并在国内很多实验室开展运用。 关键词大肠杆菌 Petrifilm测试法
1设备和材料 1.1恒温培养箱：36±1℃。 1.2冰箱2~5℃。 1.3恒温水浴箱:44.5±0.2℃。 1.4天平：感量0.1g。 1.5均质器 1.6振荡器。 1.7无菌吸管：lmL(具0.01 mL刻度)、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。 1.8无菌锥形瓶：容量500mL。 1.9 玻璃珠:直径约5mm。 1.10pH计或pH比色管或精密pH试纸 1.11试管架。 2. 培养基和试剂 2.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（ LST ）肉汤。 2.2EC肉汤。 2.3蛋白胨水。 2.4缓冲葡萄糖蛋白胨水（MP-VP实验用）。 2.5磷酸盐缓冲液。 2.6无菌生理盐水:称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121℃高 压灭菌15min。 2.71mol/L氢氧化钠（NaOH ) ：称取40g 氢氧化钠溶于1000ml蒸馏
细菌总数的测定
细菌总数的测定 水与人类的生产活动和日常生活息息相关。经济建设的高速发展，往往会使生活用水的水源水受到水中有害有毒物质的污染；而生活污水、人、畜粪便会使甚或用水的水源水受到腐生性微生物的污染。被污染的水都不宜饮用。当水体中含大量的病原问生物是往往会引起传染病的发生，人体和动物体的肠道中大约有400多种细菌，虽然，其中的腐生菌进入水体不会引发人类的疾病，但随着粪便一起排除的致病菌，如霍乱弧菌、伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、阿米巴虫、脊髓灰质炎病毒和传染性感染病毒等致病性微生物，则会引发人体的肠道传染病。为保护人体健康，防止因水源水污染而造成的疾病发生和流行，必须对生活用水及其水源水进行严格的水中细菌学检查。 测定水样是否合乎引用标准，一般包括：水中细菌总数测定和大肠菌群测定。本实验以自来水和天然水为水样进行细菌总数的测定 一、实验目的 （1）学习水样的采取和水样中细菌总数测定的方法 （2）了解和掌握平板菌落计数的原则 二、试验原理 水中的细菌数可反映出水体被有机物污染的程度。细菌总数越多，说明水中有机物的含量就越高，本试验应用平板菌落计数来测定水样中的细菌总数。由于水中细菌的种属不一，它们对营养成分和生长条件的要求差别很大，不可能设计出一种培养基在同一固定的条件下，能满足水中所有细菌的营养要求使其都能生长繁殖，形成菌落。然而，肠道中的绝大多数腐生性和致病性的细菌，可在营养丰富的牛肉膏蛋白胨培养基上进行生长，出现肉眼可见的菌落，虽然这样设计出来的水中细菌的总数实际上是一种近似值，但它基本上能代表水样中细菌的数量。故而水中的细菌总数的测定和计算是指：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，1ml水样，经37℃，24h培养后所生出来的总菌数（包括腐生和致病细菌），我国饮用水的 卫生学指标规定：在1ml自来水中细菌总数不得超过100个（1×102）。 三、试验材料和用具 （1）培养基牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 （2）用具灭菌三角烧杯（体积为50ml或100ml），具玻塞的试剂瓶（体 积为250ml，需灭菌），灭菌培养基（Ф=9cm ），灭菌吸管或灭菌的 塑料吸嘴，稀释水样用无菌水（在Ф16mm×160mm试管中加9ml 蒸馏水，灭菌），酒精 四、试验方法 （1）以无菌操作、用10倍稀释法稀释水样。 （2）用平皿倾注制备待测水样平皿。 五、实验内容 1、水样的采取 （1）自来水先将自来水龙头用火焰（酒精灯火用长柄镊子夹酒精棉球）灼烧2-3min灭菌，再开启水龙头水水流出5min。以灭菌三角烧杯接取水样，待测（为节约用水，自来水龙头一次灭菌后，试验者依次采取水样）。 （2）池塘水、河水或湖水应取距水面10-15cm的深层水样。先将已灭菌具玻
使用em菌发酵剂发酵鸡粪的方法
鸡粪、鸽粪、鸭粪、猪粪、牛粪、羊粪等动物粪便有很多的营养价值，直接排放不仅污染环境，而且造成很大的浪费，其实这些粪便经过专业的发酵剂处理之后不仅可以制作成肥料，还可以发酵做成动物饲料。 （一）、利用农盛乐em菌发酵剂发酵鸡粪做肥料的方法： 1）发酵原料：如谷糠、杂草、人、畜、禽粪便、作物秸秆（切碎）、茎叶、锯末木屑、食用菌基质残渣和饼粕等。 2）工具：搅拌机；塑料容器或水泥池（或者土坑垫塑料薄膜）；塑料薄膜；粉碎机（普通农用型）；铁锹。 3）发酵菌：种植em菌发酵剂 4）配比：谷糠、杂草、人、畜、禽粪便、作物秸秆（切碎）、茎叶、锯末木屑、食用菌基质残渣和饼粕等。准备400公斤材料和种植em 菌发酵剂1公斤 5）操作规程： ①将发酵原料按配比准备400公斤，此为发酵原料待用； ②将1公斤种植em菌发酵剂倒入50公斤水中稀释搅拌均匀，稀释用水最好为井水或河水，若为自来水请放置24小时后再用；能够适当的溶解一些红糖在里面效果更佳。 ③如有搅拌机：可以先将发酵原料混合2分钟后，再倒入发酵剂稀释液搅拌6分钟；没有搅拌机：用铁锹搅拌按由少到多的原则，即先将菌液稀释液倒入少量发酵原料中搅拌均匀，直到没有团块，然后再将搅拌好的少量发酵原料倒入剩余发酵原料中搅拌均匀，直到没有团
块；（注意：视发酵原料干湿程度增减稀释用水水量，稀释的em菌发酵剂用水应是发酵原料的40%左右，拌成以手握成团，指缝见水但不滴水珠，松手即散为好。注意：水多了易酸，少了发酵不透。如发酵原料较湿，应减少稀释的用水量。） ④将混合后的发酵原料放入塑料容器或水泥池（或者土坑垫塑料薄膜）中，最后装满压实，排去空气后用塑料薄膜密封，一定要完全密闭，适宜温度为25-35℃，发酵5-10天（一般夏4天，春秋7天，冬10天），注意温度和时间的掌握，直到没有臭味含有酒味即为发酵成功。 （二）利用农盛乐em菌发酵剂发酵鸡粪做饲料的方法：将无霉变无病菌的新鲜鸡粪60%(或鸽子粪、鸭粪也可发酵使用），玉米粉15%，谷糠10%、麦麸5%、em菌发酵剂0.5-1%（加入与菌液等比例红糖效果更好），充分搅拌均匀，调节水分到60%左右（可以提前将em菌发酵剂加入适量水中稀释，更利于其搅拌均匀）。其简单判断办法为：即用手紧抓物料一把能成团，松手落地能散开为宜，水分过高过低均不利。然后装入塑料袋或能密封的池子（缸或者做个小发酵池），密封发酵5-7天（冬天时间略长），当鸡粪呈黄绿色，无臭味而略带酒酸味时（发酵时间过长酒味过浓），发酵基本完成，即可饲喂。饲喂时应注意遵从“由少到多，慢慢适应”的原则，猪很爱吃，不易生病，皮毛红润发亮，喜睡，一般能替代最多30%的精饲料。 发酵后鸡粪的缺点是：能值仍然较低，非蛋白氮仍然较多，所以，需
再谈热水系统军团菌灭菌方式
热水系统军团菌的灭菌新型方案 意大利卡莱菲公司办事处 舒雪松 在前几期的‘卡莱菲专题’里，我们就军团菌的形成，存在形式及清除军团菌的各种方法进行过探讨。在这一期里我们将更为深入地分析如何在热水系统中清除热水管道的军团菌，尤其是对于供水和循环水系统的温度及流量的平衡我们将提出多种解决方案。 首先，我们再次回顾一下Hodgson-Casey 图示，这是有关水温和军团菌存活关系的经典图表。从图1中可以看出，水温在70℃时军团菌立即死亡，在50℃以上时90%的军团菌在2小时死亡。在生活热水系统中，对军团菌进行热力杀菌的方式比化学杀菌更为合理。因为它不会造成水质的污染，而且热力杀菌更容易实施。 生活热水的热源部分，比如热水锅炉，换热水箱等，由于其自身特点及储存热量的需求，水温通常都在70℃以上，因此在水箱部不可能存在军团菌。而管道输送的热水在经过锅炉出水与冷水混合后往往都在50-55℃左右（根据欧洲的节能及安全标准，过高的水温直接输送到用户端容易造成烫伤及增大能耗）。由于管道保温及长度分布不一，所以很难保证 军团菌立即死亡 90%的军团菌2分钟内死亡 90%的军团菌2小时内死亡 军团菌滋生的理想温度 军团菌存活但不活跃 图1 Hodgson-Casey 图表 供水温度>50℃的管道 供水温度<50℃的管道 图2 热水供水系统中温度的变化示意图
在供水的最远端或循环回水管道的水温不低于50℃，而低于50℃的水温则为军团菌的滋生提供了条件。 如图2所示，假定热水以55℃供出，由于管道的热量损失等因素，在供水末端及循环水管道均出现低于50℃的区域，也就是容易产生军团菌的区域。因此，需要对热水的供水温度及循环回水温度进行控制。 接下来，我们将介绍一些新型的设备，它运用于热水系统中，使系统更易操控运行更加可靠。我们会从以下几个方面进行探讨： 1、热源部分热水的产生和调节 2、循环水系统的设计和平衡 3、防烫措施 4、热水系统的设计和改造建议 一、热水的产生和调节 以下我们将以3个系统图示说明热水的调节方式，三个系统均采用双重温度调节：第一个温度调节是将热水的温度控制在70-75℃左右，这样可以实现热量的贮存，用于热水供应和定期的高温消毒； 第二个温度调节则是管道供水温度的调节。 3 止回球阀 图3 储热式热水箱供水，循环水至水箱底部的系统
大肠菌群测定方法
大肠菌群及检验 一、大肠菌群介绍 大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工
作中。 二、大肠菌群检验方法：由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。 （一）国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18-24h，观察菌落形态。证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h，观察产气情况。报告：根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。 具体操作参见GB4789.3-94 《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验大肠菌群测定》 （二）原国家商检局制订的行业标准，等效采用美国FDA的标准方法，用于对出口食品中的大肠杆菌进行检测。本方法采用两步法：推测试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管LST肉汤。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。证
纯化水中需氧菌总数检测方法
纯化水微生物限度检测 计数方法适用性试验 1.供试液制备 根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时，应均勻加热，且温度不应超过45#C。供试液从制备至加人检验用培养基，不得超过1小时。 常用的供试液制备方法如下。如果下列供试液制备方法经确认均不适用，应建立其他适宜的方法。 (1)水溶性供试品取供试品，用PH7.0无菌氣化钠-蛋白胨缓冲液，或PH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1:10供试液。若需要，调节供试液pH值至6?8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步1 0倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。 2.接种和稀释 按下列要求进行供试液的接种和稀释，制备微生物回收试验用供试液。所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%。为确认供试品中的微生物能被充分检出，首先应选择最低稀释级的供试液进行计数方法适用性试验。 (1)试验组取上述制备好的供试液，加入试验菌液，混勻，使每lm l供试液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于100cfu。 (2 )供试品对照组取制备好的供试液，以稀释液代替菌液同试验组操作。 (3)菌液对照组取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液，按试验组操作加人试验菌液并进行微生物回收试验。若因供试品抗菌活性或溶解性较差的原因导致无法选择最低稀释级的供试液进行方法适用性试验时，应采用适宜的方法对供试%液进行进一步的处理。如果供试品对微生物生长的抑制作用无法以其他方法消除，供试液可经过中和、稀释或薄膜过滤处理后再加人试验菌悬液进行方法适用性试验。 供试品检查
检验量即一次试验所用的供试品量(g、m l或cm2)。 一般应随机抽取不少于2个最小包装的供试品，混合，取规定量供试品进行检验。除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml;膜剂为100cm2;贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供品，大蜜丸还不得少于4丸，膜剂还不得少于4片。 供试品的检査 按计数方法适用性试验确认的计数方法进行供试品中需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定。 胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基用于测定需氧菌总数；沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌和酵母菌总数。 阴性对照试验以稀释液代替供试液进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长，如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调査。 1.平皿法 平皿法包括倾注法和涂布法。除另有规定外，取规定量供试品，按方法适用性试验确认的方法进行供试液制备和菌数测定，每稀释级每种培养基至少制备2个平板。 培养和计数除另有规定外，胰酪大豆胨琼脂培养基平板在30?35°C培养3?5天，沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在20?25°C培养5?7天，观察菌落生长情况，点计平板上生长的所有菌落数，计数并报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级两个平板的菌落数平均值不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。 菌数报告规则需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于300cfu的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜选取平均菌落数小于lOOcfu的稀释级，作为菌数报告的依据。取最髙的平均菌落数，ij*算lg 、lm l或10cm2供试品中所含的微生物数，取两位4效数字报告。
EM菌的简易生产方法
EM菌的简易生产方法 1．EM菌的生产方法 (1)场地设备：生产场地可选择光线较暗的室内或能遮光的楼上阳台。主要生产设备是容量50千克或25千克的有盖塑料桶、提水桶、塑料瓶、锅和台秤。 (2)生产原料：EM菌种(原露)、红糖、干净的井水或自来水。 (3)发酵方法：以生产50千克为例，先将容量50千克的塑料桶洗干净，加入干净生水45千克静置24小时备用，再将2千克红糖溶于4千克热水中，冷却至35～37℃后加入EM菌种2千克，密封2小时使菌种活化，然后倒人大塑料水桶中盖上桶盖，不必完全密封，让其在半密封状态下发酵。在发酵期间要注意开盖观察，发酵到第四天，水面会出现泡沫，到第十天泡沫消失，水面浮起一片白色悬浮物，15天后悬浮物沉人桶底，发酵结束。一般气温在30℃以上，发酵15～20天完成，气温在30℃以下，发酵时间要延长到25～35天才完成(比原来资料介绍的时间要长得多)。 2．EM活菌剂质量检测方法 (1)看颜色：正常为棕黄色。若为乳白色，说明发酵失败。 (2)闻气味：有较浓的甜酸味。没有酸味或变味说明变质。 (3)pH值：用试纸检测pH值在3．2～3．8之间达标。若pH值未达标，说明发酵时间不够或红糖放得少，必须加糖继续发酵。 (4)把EM装入一个矿泉水瓶中，装到大半瓶就拧紧瓶盖，用力摇几下，如果瓶中有大量气体，说明发酵成功，没有气体说明发酵失败。瓶里出现一些悬浮物属于正常现象。 (5)有条件的要定期对EM菌液内5科、10属、80种微生物的含量进行检测，以保证EM菌种的质量。 3．EM贮存及使用的注意事项
(1)EM活菌制剂要保存在不透明的容器内，保存期为6个月。如用透明塑料瓶装，很快就会变质。自产EM用做2级菌种，使用期为3个月；用于养殖业，使用期为6个月。 (2)长时间不使用，要放在阴暗干燥处半密封保存。若完全密封保存时间过长，气味会发生变化，影响质量。 (3)一次引种，可连续不断生产使用。在生产过程中，应注意不断提纯复壮菌种。没有提纯复壮能力的，一般连续接种生产4～6代以后就要更换新菌种。 (4)在EM生产和使用过程中，不能接触任何抗生素药品。养殖使用抗生素药品，用EM时要注意间隔期(一般要求间隔12～24小时)。
水中军团菌检测(ISO11731-1998)
1.适用范围 本方法适用于各种环境中的样品包括饮用水、工业用水和自然界中的水及沉淀物和污泥中的军团菌测定。 2.培养基与试剂 2.1 GVPC： 2.1.1基础琼脂：军团菌CYE琼脂基础Oxoid (CM0655B)。 2.1.2添加剂：军团菌BCYE添加剂Oxoid (SR0110A)和军团菌GVPC选择性添加剂Oxoid (SR0152E)。 2.1.3制备：2.5g CYE溶解在90ml蒸馏水中, 121oC/15分钟灭菌, 冷却到50oC, 将 SR110A用10mL 50oC无菌蒸馏水溶解后无菌加入到以上的培养基中, 混合均匀, 再无菌吸取2mL SR0152E（用10mL无菌蒸馏水溶解）加入到上述培养基中，混匀后，倾倒平板。 2.2 BCYE： 2.2.1 基础琼脂：军团菌CYE琼脂基础Oxoid (CM0655B)。 2.2.2 添加剂：军团菌BCYE添加剂Oxoid (SR0110A)。 2.2.3 制备：2.5g CYE溶解在90ml蒸馏水中, 121oC/15分钟灭菌, 冷却到50oC, 将 SR110A用10mL 50oC无菌蒸馏水溶解后无菌加入到以上的培养基中, 混合均匀,倾倒平板。 2.3 BCYE-Cys： 2.3.1 基础琼脂：军团菌CYE琼脂基础Oxoid (CM0655B)。 2.3.2 添加剂：不含L-半胱氨酸的军团菌BCYE添加剂Oxoid (SR0175A)。 2.3.3 制备：2.5g CYE溶解在90ml蒸馏水中, 121oC/15分钟灭菌, 冷却到50oC, 将 SR175A用10mL 50oC无菌蒸馏水溶解后无菌加入到以上的培养基中, 混合均匀,倾倒平板。 2.4 酸缓冲液配制： A液 0.2M HCl（10mL 1M的HCl加入到40mL的蒸馏水中） 39ml B液 0.2M KCl (14.9gKCL溶解在1L无菌蒸馏水中) 250ml A, B液混合后用1M 的KOH调节pH至2.2±0.2,室温下的保质期一个月. 2.5血平板(BA) 2.6革兰氏染色液
水的大肠菌群检测方法
4．1 在2个装有50ml三倍浓缩乳糖胆盐培养液的大试管或烧杯内各加入水样100mL。 4．2 在10支装有5mL三倍浓缩乳糖胆盐培养液的试管里各加入水样10mL。 4．3 轻摇试管，使液体充分混匀，置36±1℃培养箱中，培养24h。 4．4 观察每管是否产气，如不产气则报告为大肠菌群阴性；若有气体产生则为推测性试验阳性，需做进一步的证实试验。 5 证实试验 5．1 平板分离 自推测性检验阳性管中取一接种环培养液，接种到伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃培养箱培养18～24h，观察菌落形态，典型的大肠菌群菌落为黑紫色或红紫色，具有金属光泽。 5．2 复发酵试验 挑取可疑大肠菌群菌落1或2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，于36±1℃培养箱中，培养24h。5．3 凡乳糖发酵管最终产酸产气，革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，为大肠菌群阳性。记下证实实验的阳性管数，查最大可能数（MPN）检索表得出1000mL水样中总大肠菌群的MPN值。 总大肠菌群（MPN）检索表 二、大肠菌群膜法测定 1 定义 大肠菌群（coliform bacteria）为需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌，将带菌滤膜贴在含乳糖的选择性培养基上，经37℃培养24小时后，呈现深暗红色带金属光泽的菌落。 2 仪器 2．1 滤器 2．2 滤膜，孔径0．45μm。直径根据滤器规格，目前常用的有35mm和27mm两种。 2．3 抽滤设备 2．4 无齿镊子 2．5 其它仪器见《GB/T ××××－××公共场所茶具微生物检验方法，大肠菌群测定》中第3章。 3 培养基 3．1 品红亚硫酸钠培养基 3．1．1 成分：蛋白胨10g 酵母浸膏5g 牛肉膏5g 乳糖10g 琼脂10～20g 磷酸氢二钾3．5g
EM菌液制作方法与配方
EM菌液制作方法与配方 信息来源：广宇生物加入日期：2009-2-13 点出：384 一、【ＥＭ原液发酵方法】：制作ＥＭ菌种发酵液——EM原液 EM菌液（100公斤）=12支EM菌种+70公斤水+15公斤红糖+食盐2汤勺+100公斤能够密封的水桶+前6天不要打开 注意：不要用自来水。红糖食盐用温水化开，最后加菌种，搅拌均匀，夏天3-6天，冬天10-15天左右，密封即可。 二、【水产养殖水肥配方】 1、有机肥：（发酵动物粪便 40%，桔杆或草粉 10%，泥碳土 20%、活性小肽 0.3%） 2、生物肥：（固N菌、解P菌、解K菌）10% 3、活菌制剂：（EM原液）1% 4、复合氨基酸1%，复合维生素1%，多糖0.5%，核酸0.5%，腐植酸1%，蛋白酶0.5%，淀粉酶0.5 （共5%） 5、微量元素 10%（N=0.5%、P=4%、K=4%、Ca、Na、Mg、Cu、Fe、Zn、Mn、B、Si） 三、【高效种植微生物肥料配方】 1、生物肥：（固N菌、解P菌、解K菌）4% 2、活菌制剂：EM菌原液1% 3、动物粪便：80%
4、微量元素1.5%、N=3.5%、P=5%、K=5%（合计15%） 四、【种植叶面微生物肥料配方】 1、生物肥：（固N菌、解P菌、解K菌）12% 2、活菌制剂：（EM原液）80% 3、复合氨基酸1%，复合多维生素1%，多糖0.4%，核酸0.1%，腐植酸1%，蛋白酶0.2%，淀粉酶0.3%（合计4%） 4、微量元素1.5%、N=0.5%、P=1%、K=1%（合计4%） 五、【微生物饲料—全价料配方】 玉米 50.0 小麦麸 8.00 大豆粕 8.00 棉籽粕 3.00 菜籽粕 2.00 微生物发酵秸秆粉 28.0 复合酶 0.15 复合微量元素 0.15 复合维生素 0.02 皮毛营养调控剂 0.02 无氟磷酸氢钙 0.16 食盐 0.20 复合赖氨酸 0.10 石粉 0.20 六、【微生物饲料—添加剂配方】
大肠菌群检测方法
大肠菌群检测方法 进入无菌室步骤 1．进入无菌室前应打开紫光灯进行灭菌，时间为0。5—1小时。 2．关灯后0?5小时后放可进入。 3．进入更衣间更换衣服，佩带口罩、帽子、鞋套 实验步骤 1，进入无菌室后，先把酒精灯点燃，然后在用酒精棉进行手部消毒。（酒精棉是用75%的酒精加入脱脂棉中制成） 2，准备双料管3根，单料管6根，培养皿7个。 3，直接从原液中吸取10ml放入双料管，（3根每根各10ml） 4，再吸取原液1ml放入单料管中（3根每根各1ml） 5，再吸取原液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml） 6，再吸取原液1ml放入盐水管中制成－1梯度的样液 7，更换一根吸管，从－1梯度的样液吸取1ml样液放入单料管中（3根每根各1ml） 8，再吸取－1梯度样液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml） 9，再把每个培养皿中到入营养琼脂平铺底部摇允（注另作3个培养皿：空气空白，把培养皿打开十分钟倒入营养琼脂平铺底部摇匀。琼脂空白，把培养皿中倒入营养琼脂平铺底部摇匀。盐水空白，吸1ml生理盐水放入培养皿中，倒入营养琼脂平铺底部摇匀。） 10，把全部作好的放入培养箱中，温度36C＋－1×C，大肠24H＋－2H，菌落48H＋－2H，（待培养皿中的琼脂凝固后反转过来放入培养箱中） 11，梯度：－1梯度为1ml原液加入9ml生理盐水配成 －2梯度为1ml－1梯度样液加入9ml生理盐水配成 －3梯度－4梯度配制方法和－1、－2梯度的配制方法一样 12，如果大肠初发酵产生气泡，用接种笔沾一个产气的液在伊红美兰平板上画之字形然后放入培养箱中36C，24H＋－2H 。（接种笔在每次使用前必须在酒精灯上消毒。所画之形不能划破伊红美兰琼脂表面） 13，取出后在用接种笔在伊红美兰平板之字形上挑菌，放入乳糖复发酵管中，然后再培养36C＋－1C，24H＋＋－2H。 14，再在伊红美兰平板之字形上挑菌，放到载玻片上作镜检。（方法见标准） 15，只有镜检成紫红色和乳糖复发酵管产气同时成立的情况下，才能断定这根管是不合格。16，清洗消毒这根试管前必须进行消毒霉菌，121C，0。5小时同时不能放气。
水 中 细 菌 总 数 的 检 测
水中细菌总数的检测 一、实验的目的要求 1、学习并掌握水的细菌学检测方法 2、了解水质状况与细菌数量在饮用水检测中的重要性。 二、实验原理 细菌总数是指1ml水样在营养琼脂培养基中，于37℃经24h培养后，所生长的细菌菌落的总数。细菌总数是评价水质污染程度的主要卫生指标。我国现行的生活饮用水标准检验方法GB5750—85规定水样中细菌总数测定是1ml水样在普通营养琼脂培养基中37℃经24小时培养所生长的细菌菌落的总数。所测定的细菌总数增多说明水被生活废弃物污染，但不能说明污染的来源。因此必须结合总大肠菌群数来判断水污染的来源和安全程度。 本实验应用平板计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。 平板菌落计数法的优点： 能测出样品中的活菌数。此法常用于某些成品和生物制品检定以及食品、水源的污染程度的检定等。 缺点：手续较繁，而且测定值常受各种因素的影响。 生活饮用水细菌卫生标准 我国饮用水卫生标准： ≤3个大肠菌群/1L饮水，≤100个细菌总数/1ml饮水
三、实验仪器和材料 1、高压蒸汽灭菌锅、恒温箱、冰箱、无菌接种间。 2、消毒酒精、消毒水。 3、试管、三角瓶、平皿、刻度吸管、涂布器等（实验前包扎灭菌处理好备用） 4、培养基 蛋白胨10g 牛肉膏3g 氯化钠5g 琼脂10~20g 蒸馏水1000ml 制备方法： 按照实际的需要量，按上述配方称取各成分混合后，加热溶解，调整pH 为7.4~7.6，，分装于玻璃容器中，用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20min，倒制成平板后储存于冷处备用。 5、水样：自来水、中水。 四、实验内容： （一）、培养基的制备： 实验前事先准备好培养基平板（方法见上），每小组2-4个平板。（二）、取水样： 1、自来水的取样：先将自来水龙头用酒精棉擦拭，再用酒精灯火焰灭菌， 打开龙头放水1-2分钟，用无菌空三角瓶接取水样200毫升。 2、纯净水取样：用消毒酒精棉擦拭纯水机出口后，先放走部分水，再用
EM菌液制作方法
E M菌液制作方法 This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020
制作EM菌液方法：比例：100克EM菌液，200克红糖，15公斤水，按这个比例剩余的就放在饮料瓶中密封保存 有以下两种制作方法： 【第一种方法】：直接制作：1瓶菌种+4斤红糖+36斤水+密封装起来发酵3到7天=40斤原液；优点是简单方便；缺点是发酵没有第二种充分； 【第二种方法】：激活菌种：取菌种10克 + 红糖公斤 + 水1公斤；密封培养1到2天后即可激活；激活后就是液体菌种了；随后转入原液制作阶段） 制作原液：（1公斤液体菌种+红糖2公斤+17公斤+密封发酵3到7天=制作成40斤EM菌原液）打开容器口闻到有酸甜味即制作成功。可以作为原液使用。 原液标准：（气味：酸甜；PH值：3～5；镜检活菌含量：100亿/ml左右） 【制作说明】第一：第一种方法简单容易操作；第二种方法制作原液效果更好；强烈推荐用第二种； 第二；有条件的可以加点食盐和尿素；加入的话会好些。但会影响气味和PH值； 第三；最好恒温35度制作速度会很快；气温低也可，只是需要延长发酵时间； 第四；本品制作过程菌种活性很强；会产生很强气压；务必缓慢打开容器；以免喷洒出来； 有以下两种制作方法： 【第一种方法】：直接制作：1瓶菌种+4斤红糖+36斤水+密封装起来发酵3到7天=40斤原液；优点是简单方便；缺点是发酵没有第二种充分； 【第二种方法】：激活菌种：取菌种10克 + 红糖公斤 + 水1公斤；密封培养1到2天后即可激活；激活后就是液体菌种了；随后转入原液制作阶段）
公共场所水系统军团菌风险防控
◎智慧水务◎ 公共场所水系统军团菌风险防控 The Risk Control and Prevention of Legionella in the Public Area 叶文瑾 YE Wen-jin (中交上海航道勘察设计研究院有限公司) (Zhongjiao Shanghai Waterway Survey and Design Research Institute Co., Ltd.) 【摘要】军团菌病是一种细菌性的呼吸道疾病，是以公共水系统为媒介进行传播的疾病。随着我国城市化的发展，军团病成为城市 发展和公共设施管理中面临的一个重要的卫生公共问题，文章分析了国内外军团菌病的流行状况、主要的风险控制环节，比较了 国内外军团菌风险控制的相关法规、技术规范，并且对当前军团菌检测方法的研究进展进行了综述。 【Abstract 】Legionellosis disease is a bacterial respiratory disease, which is spread by the public water system. With the development of urbanization in China, Legionellosis disease becomes an important public hygiene issue in the city development and public facility management. This article analyzed the Legionellosis^ disease epidemics and the major risk control point. It also compared the domestic and foreign regulations and standards of Legionella risk control, and reviewed the research progress of test method on Legionella. 【关键字】军团菌病；风险防控;公共场所；水系统 [Keywords 1 legionellosis disease; risk control : public area; water system 1引言军团菌病(legionellosis disease) 是一种细菌性的呼吸道疾病，发现于 1976年美国退伍军人会议后，其中有 34人死亡。1977年，美国疾病预防控 制中心(CDC)分离得到该病的病原菌， 并命名为军团菌(Legionella)［匕由军 团菌引起的发病症状有两种，分别为庞 蒂亚克热和军团病。庞蒂亚克热是一种 急性自限性的流感样疾病，表现为发热 乏力；而军团病主要症状为肺炎，并伴 随着多系统损害，病死率在5%~30%之 间军团菌属于革兰性阴性菌，广泛 存在于自然环境和人工水体中，并可以 长期存活。目前已经确认的军团属有50 个种70个血清型，与人类疾病关系最 为密切的是嗜肺军团菌种(Legionella pneumoph 订a, Lp),现已发现其有16 个血清型［3］o 军团菌广泛存在于水和土壤中，适 宜的温度和环境使其容易大量滋生繁 殖。其最常见的传播方式是人体吸入受 到污染的水喷雾、喷气产生的气溶胶， 主要来源于空调系统的冷凝水、冷却水， 淋浴喷头水，加湿器等［現 随着我国城 市现代化的发展，大型建筑的兴建、复 杂公共供水系统、以及广泛安装的中央 空调系统，以水系统为传播媒介的军团 菌病，成为城市发展和公共设施管理中 面临的一个重要的卫生安全问题。2军团菌感染流行病学自美国首次爆发军团病以来，世界 每年都有军团菌病大爆发事件的报道， 并且在经济发达的国家较普遍。1995 年-2005年期间，美国病预防控制中 心(CDC)共报告了 23076例军团病⑷， 2011年-2015期间，欧洲疾病预防和 控制中心(European Centre for Disease Prevention and Control, ECDC)报告 了欧洲共发生30532例军团病，并且发 病率逐步上升，每10万人口的发病率 从2011年0. 97例上升到2015年的1. 30 例⑸。2005年，西班牙卫生部发布消息， 萨拉戈萨市爆发军团病，21人感染，2 人死亡。2012年7-8月芝加哥酒店，发 现10例军团病,3人死亡。2013年6月， 澳大利亚昆士兰Brisbane^ Wesley 医 院，数人感染军团病，1人死亡。2013 年9月，德国发生大规模军团病事件， 发现165例，3人死亡。2014年美国阿 拉巴马州医院，发现8例军团病，其中 2人死亡。2015年7-8月，美国纽约市 区发生严重的军团病事件，导致12人 77 智能建筑与智慧城市2019-8期.indd 772019/8/20 14:42:31
饮用水中大肠杆菌的检测方法
饮用水中大肠杆菌的检测方法 (一)水样的采集 供细菌学检验的水样，必须按一般无菌操作的基本要求采集，并保证再运送、贮存过程中不受污染。水样从采集到检验不应超过4h，在0～4℃下保存不应超过24h ，如不能在4h 内分析，应在检验报告上注明保存时间和条件。 1、自来水取样：应在水龙头打开放水5min，再用无菌容器接取水样，待分析。如水样内含有余氯，则采样瓶灭菌后按每500mL水样加3%Na2S2O3.5H2O溶液1mL。 2、江、河、湖、池自然水体取样：可用采样器，采样瓶应先灭菌。采样后，瓶内应留有空隙。如果与其他化验项目联合取样，细菌学分析水样应采在其他样品之前。 (二)初发酵试验 1.水样稀释：制备水样10-1、10-2的稀释液，方法为用无菌移液管吸取水样10mL放于盛有90mL无菌水和若干玻璃珠的锥形瓶中，充分振荡使混合均匀，并使其中的细菌尽量呈单个存在，即为10-1稀释液;再从10-1制备10-2稀释液。以此类推，稀释到所需倍数。 2.接种和培养：以无菌操作于5支三倍浓缩培养基(接种前一定应先检查杜汉氏小管内有无气泡)中各加入水样10mL，5支普通培养基试管中加入水样1mL，5支普通培养基试管中加入10-1稀释液1mL，小心混匀放入37℃培养箱中培养24h 。此即5管法。 3.结果观察：37℃中培养24h后取出观察，观察有无气体(杜汉氏小管内有无气体)和酸产生(培养基有无变色)。在48h之间，培养管内倒置的杜汉氏小管内有任何量的气体积累，或培养基颜色从紫色变为黄色，便可初步断定为阳性反应。 若所测定的15支管中均为阳性反应，说明浓水样污染严重，可将样品进一步稀释后，再按上述方法接种、培养和观察。