蔗糖酶的提取

一、实验目的和要求

学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法，学习使用高速冷冻离心机，认识制冰机。

二、实验内容和原理

1.蔗糖酶简介：

蔗糖酶为水解酶类，主要存在于酵母中，如啤酒酵母、面包酵母，也存在于曲霉、青霉和毛霉等霉菌和细菌及植物中，可专一性地催化蔗糖水解为果糖和葡萄糖的反应。

酵母蔗糖酶的分子量约为270000D（因来源不同，分子量也存在差异）。本实验中所用酵母蔗糖酶的PI约为4.8，最适pH为4.6，耐酸和热，最适温度50C，耐乙醇，在47.5%的乙醇溶液中能够沉淀且活性保持，因此可用乙醇纯化法进行分离提纯。

2. 酵母蔗糖酶的制备原理：

上层：脂溶性物质（本实验用的提取液关系本酵母缓冲液、石英砂破细离心层不明显）

细胞研磨胞中层（水层）：蔗糖酶、可溶性杂质等

下层（沉淀）：细胞碎片、变性蛋白等

上清：蔗糖酶、可溶性杂质（如糖类、 50℃水浴中代谢中间物、RNA、DNA和未变取中层保温30min 使热不稳定离心性的酶和蛋白质）等

（水层）蛋白变性沉淀：变性蛋白

上清：杂蛋白及可溶性杂质等加入等体积95%乙醇使蔗糖酶离心

取上清沉淀

冰浴20min 沉淀：蔗糖酶、杂蛋白（已变性或者

与蔗糖酶在乙醇中行为一的

酶）等

3. 本实验中由于蔗糖酶位于酵母细胞内，所以需要先将细胞破碎，将蔗糖酶从细胞中提取出来。

细胞破碎常用的方法如下图所示：

本实验采取研磨的方法，通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎。

三、实验材料和试剂

1.实验材料：

市售干酵母粉 10g/组(3人）。

2.实验试剂：

⑴石英砂;

⑵ 95% 乙醇(-20℃);

⑶ 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液。

四、实验器材与仪器

1. 电子天平（称量样品）；

2. 研砵（每组一套）；

3. 50ml高速离心管（4支/组、4孔50ml离心管架一个/组）；

4. 托盘天平（离心管平衡用）；

5. 高速冷冻离心机；

6. 恒温水浴箱（50℃）；

7. 制冰机；

8. 1.5ml离心管（留样品Ⅰ、Ⅱ用）及离心管架；

9. 7ml离心管（留样品Ⅲ用）及离心管架；

10. －20℃冰箱。

五、操作方法和实验步骤

1. 酵母细胞破碎：

称取市售干酵母粉10g，约3g石英砂放入研钵中直接研磨至尽可能成细粉末状（约15分钟），量取总体积50ml的20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液，分2次加在研砵内研磨10

分钟，使呈糊状液体；将糊状液体转移到2支50ml离心管中，两支离心管平衡后，4℃、15000r/min 离心20分钟，收集上清液并量出体积V1（样品I）,留1ml上清液（样品I ）放置－20℃冰箱保存，用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE分析。

2. 热处理：

将上一步抽提液（样品I），迅速放入50℃恒温水浴中，保温30分钟（其间用玻璃棒温和搅拌抽提液使受热均匀）后，迅速放入冰中冷却。然后转移至两支50ml离心管中，平衡， 4℃，12000r/min离心15分钟，收集上清液并量出上清液体积V2（样品Ⅱ），留1ml 上清液（样品Ⅱ）放置－20℃冰箱保存，用于蔗糖酶蛋白含量测定、测定蔗糖酶活力和SDS-PAGE分析。

3. 有机溶剂（乙醇）沉淀：

量取与上步上清液相同体积的－20℃的95%乙醇，冰浴条件下滴入上清液中，温和搅动混匀，静置20分钟，然后转移至两支50ml离心管中，平衡，4℃，12000r/min离心10分钟，弃去上清液。沉淀留作下一次实验。

六、实验数据记录和处理

数据:

称取的市售干酵母粉m=10.00g；

第一次离心后上清液体积V1=37.0ml；

第二次离心后上清液体积V2=32.6ml。

第三次离心后上清液体积V3=13.0ml。

现象：

1. 干酵母粉呈淡黄色细颗粒状，有发酵面包的特殊气味，研磨后呈粉末状。

2. 加入缓冲液后混合物呈乳黄色，底部有少量沉淀。

3.第一次离心后分层，上层呈白色，中层清液呈黄色，下层为乳黄色沉淀。

4.上清液放于恒温水浴搅拌后，溶液稍显浑浊。

5.第二次离心后分层，上层清液呈淡黄色，下层为沉淀。

6.上清液放于冰浴中后，溶液稍显浑浊。

7.第三次离心后分层，上清液几乎无色透明，沉淀呈白色。