生物化学 蛋白质化学

生物化学

第一章蛋白质化学

第一节蛋白质的重要性

?蛋白质是机体最丰富的有机分子，占人体重量的16~20%，占干重的45%，肺组织高达80%。

?蛋白质的生物学功能：生物催化作用、调节作用（激素，基因表达调控作用）、免疫防御与保护作用（细胞因子、补体、抗体）、转运和储存作用（转运蛋白）、结构功能（保护和维持细胞、组织、器官的正常生理形态，细胞骨架）、运动与支撑作用、信息接收传递作用（受体蛋白）、生物膜功能

?蛋白质组学：蛋白质组指的是基因组编码的全部蛋白质，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质；蛋白质组学本质上指的是在机体整体水平上系统地研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平、翻译后的修饰、蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生、细胞代谢等过程的整体而全面的认识。

第二节蛋白质的化学组成

?蛋白质含氮量平均为16%，蛋白质的含量=含氮量x6.25。

?天然存在的氨基酸约180种，组成蛋白质的氨基酸只有20余种（基本氨基酸）。

?基本氨基酸的共同特点：①除脯氨酸为α-亚氨基酸外，其他组成蛋白质的基本氨基酸均为α-氨基酸；②除甘氨酸外，其他氨基酸的α-碳原子为手性碳原子，且天然蛋白质中基本氨基酸皆为L-型；③不同的氨基酸的R链不同，对蛋白质的空间结构和理化性质有重要影响。

?20种常见氨基酸的名称和结构式（见书P11）

?氨基酸的分类非极性R基氨基酸：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸；极性不带电R基氨基酸（易溶于水）：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；带负电的R基氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸；带正电的R基氨基酸：赖氨酸、组氨酸、精氨酸。

?氨基酸的物理性质：①高熔点，200℃以上，以离子状态存在；②一般均溶于水，溶于强酸、强碱；不溶于乙醚、氯仿等有机溶剂；③氨基酸一般有味；④除甘氨酸外均有旋光性。

?氨基酸的化学性质：①两性解离与等电点：pH高于等电点带负电，低于等电点带正电。

等电点时主要以两性离子存在，极少量以中性分子存在。中性氨基酸的pI在微酸性范围，践行氨基酸的pI在碱性范围，酸性氨基酸的pI在酸性范围。②紫外吸收性质：色氨酸（280nm）、酪氨酸（275nm）和苯丙氨酸（257nm）含有苯环共轭双键系统，具有紫外吸收特性。③茚三酮反应：与大多数α-氨基酸加热反应产生蓝紫色物质，与脯氨酸、羟脯氨酸反应呈黄色，与天冬酰胺反应呈棕色；④α-羧基的反应：与碱、醇、硼氢化锂反应；⑤R基的反应：Million反应（Tyr-红色）、Folin反应（Tyr-蓝色）、坂口反应（Arg-红色）、Pauly反应（His、Tyr-橘红色）、乙醛酸的反应（Trp-紫红色环）。

?氨基酸的功能：①寡肽、多肽、蛋白质的基本结构单位；②多种生物活性物质的前体；

③作为神经递质或神经营养素；④参与生物体内的物质代谢和能量代谢。

第三节蛋白质的分子结构

?蛋白质的一级结构包括：①组成蛋白质的多肽链的数目；②多肽链的氨基酸顺序；③多肽链内或链间二硫键的数目和位置。

?体内多肽和蛋白质生物合成时，均是从氨基端开始，延长到羧基端终止，因此N末端被定为多肽链的头。

?蛋白质一级结构的概念：蛋白质是由不同种类、数量和排列顺序的氨基酸，通过肽键而构成的高分子有机含氮化合物。它是蛋白质作用的特异性、空间结构的差异性和生物学功能多样性的基础。

?活性多肽：谷胱甘肽GSH（还原剂、与毒性药物结合、维持红细胞膜结构的稳定、使巯基酶的活性基团维持还原状态）、降钙素基因相关肽（舒血管作用，参与心血管系统调节）、肽类激素、多肽类抗生素。

?蛋白质的水解反应：①酸水解: 6M盐酸或4M硫酸，回流20小时，完全水解；得到L-氨基酸，不引起消旋，色氨酸被破坏，酰胺被水解。②碱水解: 5M氢氧化钠，回流10-20小时，完全水解；得到等摩尔D-氨基酸L-氨基酸，引起消旋；色氨酸稳定。③酶水解: 不引起消旋，不破坏氨酸酸，但一种酶水解不彻底，需要几种酶协同作用。

?蛋白质一级结构测定的原理及方法：

1)氨基酸的组成分析：蛋白质样品的纯化→多肽链数目的测定→氨基酸组成的分析。

2)N端氨基酸的分析：①二硝基氟苯法（DNFB）：N末端氨基与DNFB反应，生成DNP

多肽衍生物；用酸水解，所有肽键被水解生成相应氨基酸和DNP-末端氨基酸。②二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl）：DNS-氨基酸有强烈荧光，灵敏度高。DNFB法和DNS法的不足之处是不能在同一个肽链上重复应用。③Edman降解法（PITC、PTH-氨基酸）：可标记并仅水解释放多肽链的N末端氨基酸残基，留下其他氨基酸残基的完整肽链。④氨肽酶法：肽链外切酶，从N端开始逐个切掉氨基酸。

3)C末端氨基酸的分析：①肼解法：多肽与无水肼加热发生肼解，C末端氨基酸以自由形

式释出；②羧肽酶法：特异地从C末端依次将氨基酸水解下来，有A、B、C、Y四种。

4)二硫键的确定：快原子轰击、等离子体解吸、电喷雾典礼等软电离质谱技术。

5)大分子多肽氨基酸顺序的测定：先将大分子多肽裂解为小的肽片，经分离纯化后，分

别测定各肽片的顺序。此法适用于无二硫键的单链多肽组成的蛋白质。

6)核酸推导法。

?蛋白质的构象：蛋白质分子中原子和基团在三维空间上的排列、分布及其走向称为蛋白质的构象，又称蛋白质的空间结构、立体结构、高级结构和三维结构等。

?维持构象的化学键（次级键）：氢键、疏水键、盐键、配位键、二硫键、范德华力。?蛋白质的二级结构：是指多肽链的主链骨架中若干肽单位，各自沿一定的轴盘旋或折叠，并以氢键为主要的次级键而形成有规则的重复构象。蛋白质的二级结构仅限于主链原子的局部空间排列，不包括与肽链其他区段的相互关系及侧链构象。

?肽单位：肽键与相邻两个α碳原子所组成的基团，称为肽单位或肽平面。肽单位具有以下特性：①肽键中的C-N键具有部分双键的性质，不能自由旋转；②肽单位上六个原子处于同一平面；③肽单位中与C-N相连的氢和氧原子与两个α碳原子呈反向分布。多肽链的盘旋或折叠是由肽链中许多α-碳原子的旋转所决定的。

?α螺旋：是蛋白质中最常见、最典型、含量最丰富的二级结构。（详见书P28-29）

?β折叠：又称β片层结构。（详见书P29-30）

?β转角：又称β弯曲，是球状蛋白形成的主要原因。（详见书P30）

?无规卷曲：也称无规线团。不能被归入明确二级结构的多肽区段，既不是卷曲，也不是完全没有规律，有着明确而稳定的结构。

?超二级结构（基序、模体或模序）：是指多肽链内顺序上相邻的二级结构常常在空间折

叠中靠近，彼此相互作用，形成规则的、在空间上能辨认的二级结构聚集体。

?结构域：空间结构上相近的几个超二级结构单元进一步折叠盘曲而形成的一个或多个相对独立的致密的三维实体。结构域是三级结构的一部分，结构域之间靠无规则卷曲连接。

结构域是球状蛋白质的独立结构单元。

?蛋白质的三级结构：整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置，包含了一条多肽链的主链构象和侧链构象。具有二级结构、超二级结构或结构域的一条多肽链，由其序列上相隔较远而空间上相近的氨基酸残基侧链的相互作用，进行范围更广泛的盘曲折叠而形成包括主、侧链在内的空间整体排布，称为三级结构。

?蛋白质的四级结构：由两个或两个以上的亚基之间相互作用，彼此以非共价键相连而形成构象更为复杂的聚集体结构，成为蛋白质的四级结构。在具有四级结构的蛋白质中，每一条具有三级结构的肽链均被称为亚基或亚单位，由2~10个亚基组成的具有四级结构的蛋白质称为寡聚体蛋白。对称性是具有四级结构蛋白质的重要性质之一。维持蛋白质四级结构的主要化学键是疏水键，位于亚基表面的疏水基侧链为了避开水相而相互作用形成疏水键进而导致亚基的聚合。

?蛋白质和多肽的化学合成法：①氨基酸侧链活性基团的保护，常用保护剂是苄氧羰酰氯（Cbz-Cl）和叔丁羰酰氯（BOC-Cl）；②多肽的液相/固相合成。

?采用生物技术合成蛋白质：基因工程、细胞工程、酶工程

第四节蛋白质的结构与功能

?蛋白质一级结构和功能的关系：①一级结构不同，其生物学功能各异。（加压素和缩宫素）基因突变可导致蛋白质一级结构的变化，使蛋白质的生物学功能降低或丧失，甚至可引起生理功能的改变而发生疾病。这种由遗传突变引起的、在分子水平上仅存在微观差异而导致的疾病，称为分子病。②一级结构相似的蛋白质，其基本构象及功能也相似。

③一级结构中关键序列变化，其生物活性或功能发生改变。

?蛋白质空间构象和功能的关系：①蛋白质前体的活化。生物体中有许多蛋白质是以无活性的蛋白质原的形式在体内合成、储存和分泌的，在机体应急或细胞需要时，这些蛋白质原中某条或某些肽链方才以特定的方式断裂，生成有活性的蛋白，进而发挥他们所特有的生物学功能。分泌性蛋白质除含有特征性的信号肽或导肽序列外，几乎所有蛋白质都有其前体，即原蛋白，含有信号肽或导肽或插入肽，这些需切除的肽段是在蛋白质生物合成中生成转运以及形成独特生理活性所需的空间结构所必需的。但一旦其相应的功能完成，肽段便被切除。（胰岛素）②蛋白质的变构现象。受别构剂或配基等因素的影响，其一级结构不变而空间结构发生一定的变化，进而导致其生物学功能的改变，称为蛋白质的变构效应。组成蛋白质的各个亚基共同控制着蛋白质分子的生物活性，并对别构剂或配基等信息信号物做出反应，信号物与一个亚基的结合可传递到整个蛋白质分子，这个传递是通过亚基构象的改变而实现的。（血红蛋白）

?蛋白质空间构象改变可引起疾病：一些蛋白质尽管其一级结构不变，但折叠发生错误，使其构象发生改变，进而影响到其正常功能，严重时可导致疾病的发生。因蛋白质折叠错误或折叠导致构象异常变化而引起的疾病，成为蛋白质构象病。（朊病毒）

第五节蛋白质的性质

?蛋白质的两性解离与等电点：体内多数蛋白质的酸碱氨基酸比例相近，其等电点大多为中性偏酸，约在5.0左右。所以在生理条件下（pH约为7.4），它们大都以负离子形式存在。

?蛋白质的变性：天然蛋白质分子受环境因素的影响，从有规则的紧密结构变为无规则的松散状态，即变性作用。构象的破坏是蛋白质变性的结构基础。在某些物理/化学因素的作用下，蛋白质分子的空间构象发生改变或破坏，进而导致其理化性质发生改变和生物活性降低或丧失，这种现象称为蛋白质的变性作用。蛋白质变性作用的本质是破坏了形成与稳定蛋白质分子空间构象的各种次级键从而导致其空间构象的改变或破坏，并不涉及一级结构的改变和肽键的断裂。变性作用有以下特征：生物活性丧失和理化性质改变（溶解度降低、黏度增加、结晶能力消失、易被蛋白酶水解）。分可逆变性和不可逆变性。

?蛋白质的胶体性质：蛋白质分子直径在2~20nm，在溶液中易形成大小介于1~100nm的质点。蛋白质表面易于发生水合作用形成水化层，使蛋白质颗粒不致聚集而沉淀。蛋白质表面具有同性电荷，与周围的反离子构成双电层。

?蛋白质的沉淀反应：①中性盐沉淀反应。逐渐向蛋白质溶液中加入中性盐，低盐浓度可使蛋白质溶解度增加，这种现象称为盐溶，其原因为蛋白质表面吸附了某种离子，导致其颗粒表面同性电荷增加而排斥加强，同时与水分子作用也增强，从而提高了其溶解度；

随着盐浓度的不断增加，因蛋白质水化层的破坏并中和了其表面电荷，而促使蛋白质颗粒相互聚集而沉淀，这种现象被称为盐析。主要特点是沉淀出的蛋白质不变性。②加热使蛋白质凝固变性。③加入有机溶剂使蛋白质表面水化层削弱或破坏并使其介电常数降低而增加带电质点的相互作用，从而使得蛋白质颗粒更易相互聚集沉淀。有时可引起蛋白质变性。④重金属盐沉淀反应。蛋白质在pH大于pI的溶液中呈负离子，可与重金属离子结合成不溶性蛋白盐或蛋白络合物而沉淀。⑤生物碱试剂的沉淀反应。蛋白质在pH小于pI时呈正离子，可与生物碱试剂结合成不溶性盐而沉淀。

?蛋白质分子量的测定：蛋白质分子量一般为1x104 ~ 1x106Da或更高。蛋白质在溶液中的形状可根据不对称常数分为球形、椭圆形、纤维状等。①凝胶过滤法。②SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。③生物质谱法。（详见书P48-49）

?蛋白质分子的免疫学性质。凡能刺激机体免疫系统产生免疫应答，并能与相应的抗体和（或）致敏淋巴细胞受体发生特异性结合的物质，统称为抗原。异物性、大分子性、特异性。抗原刺激机体产生能与相应抗原特异结合并具有免疫功能的免疫球蛋白，称为抗体。注意抗体与免疫球蛋白之间的区分。

?蛋白质免疫性质的应用：①疾病的免疫预防：卡介苗、脊髓灰质炎糖丸疫苗、白喉类毒素、乙肝的基因工程疫苗等；②疾病的免疫诊断：α-甲胎蛋白诊断肝癌，血型、HBsAg 检测等；③疾病的免疫治疗：破伤风抗毒素、狂犬病毒抗血清、抗蛇毒抗毒素、胸腺素和干扰素等，单克隆抗体也常作为靶向药物载体用于肿瘤治疗；④免疫分析：免疫扩散、免疫电泳；⑤标记免疫分析：放射免疫分析（RIA）、酶联免疫分析（EIA）、荧光标记免疫分析等；⑥免疫分离纯化：免疫亲和层析。

?蛋白质的紫外吸收：由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm 波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。蛋白质浓度mg/ml＝1.45A280 - 0.74A260

?蛋白质的呈色反应：①茚三酮反应。蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应，生成蓝紫色化合物。②双缩脲反应。蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。

第六节蛋白质的分离纯化与分析基本原理

?蛋白质的提取：增加蛋白的纯度，以增加单位蛋白质中所需要的蛋白质重量和生物活性。

既要尽量提取所需目标的蛋白质，又要防止蛋白酶等的降解和其他因素对其空间构象的破坏作用。

?根据蛋白质的溶解度差异分离：①等电点沉淀。蛋白质在等电点时溶解度最小。单纯使用此法不易使蛋白质沉淀完全，常与其他方法配合使用。②盐析法。是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素被去除沉淀。优点：沉淀的蛋白质保持着它的天然构象，能再溶解。③有机溶剂分级分离法。是将有机溶剂（丙酮、乙醇）加入蛋白质溶液中，导致溶液介电常数降低，增加了相反电荷之间的吸引力，蛋白质分子表面可解离基的离子化强度减弱，水化程度降低，因此促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。注意事项：使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃下进行。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离，防止变性。④温度对蛋白质溶解度的影响。一般在0～40℃，多数球状蛋白的溶解度随温度的升高而增加；40～50℃以上，多数蛋白质不稳定并开始变性。因此，对蛋白质的沉淀一般要求低温条件。

?根据蛋白质的分子量差异分离：①透析及超滤法。透析指利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。只用于除盐类和小分子杂质。超过滤指应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。用于除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质。②凝胶过滤法。也称分子排阻层析，层析柱内填满带有小孔的颗粒，一般由葡聚糖制成。蛋白质溶液加于柱顶部，小分子蛋白质进入孔内，因而在柱中滞留时间较长，大分子不能进入孔内而径直流出，因此不同大小的蛋白质得以分离。分子筛：具有三维空间网状结构的物质，有天然的，也可人工合成。常用分子筛有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。③密度梯度离心。蛋白质颗粒的沉降速度取决于它的大小和密度。当其在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质梯度时，即停滞不前，可分步收集进行分析。

?根据蛋白质的电离性质差异分离：①电泳法。根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。几种重要的蛋白质电泳：A.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。在蛋白质样品和聚丙烯酰胺凝胶系统中加入带负电荷较多的十二烷基磺酸钠（SDS），使所有蛋白质颗粒表面覆盖有一层SDS分子，导致蛋白质分子间的电荷差异消失，此时蛋白质在电场中的泳

动速率仅与蛋白质颗粒大小有关。常用于蛋白质分子量的测定。SDS的作用：a.由于SDS 是阴离子，使多肽表面覆盖的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原来的电荷差异。b.SDS是变性剂，它能破裂蛋白质分子中的氢键和疏水作用，巯基乙醇打开二硫键，因此使蛋白质分子处于伸展状态。改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其分子量的大小成正比变化。B.醋酸纤维薄膜电泳。它以醋酸纤维薄膜作为支持物，电泳效果比纸电泳好，时间短、电泳图谱清晰。临床用于血浆蛋白电泳分析。C.等电聚焦电泳。在聚丙烯酰胺凝胶中加入系列两性电解质载体，在电场中形成一个连续而稳定的线性pH梯度，也即pH从凝胶的正极向负极依次递增，电泳时被分离蛋白质处在偏离其等电点的pH位置时带有电荷而移动，至该蛋白质pI值相等的pH区域时，其静电荷为零而不再移动，这种通过蛋白质的等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法称为等电聚焦电泳。D.双向凝胶电泳。第一向为蛋白质等电聚焦电泳，第二项为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过被分离蛋白质等电点和分子量的差异，将复杂蛋白质混合物在二维平面上分离。E.免疫电泳。把电泳技术和抗原与抗体反应的特异性相结合，一般以琼脂或琼脂糖凝胶为支持物。本法常用于蛋白质的鉴定及其纯度的检查。目前此类方法已有许多新的发展，如荧光免疫电泳、酶免疫电泳、放射免疫电泳、Western Blot分析等。②离子交换层析法。利用离子交换树脂作为支持物，将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。分类：阳离子交换树脂，带负电，如羧甲基纤维素等；阴离子交换树脂，带正电，如二乙基氨基乙基纤维素。③亲和层析分离。

利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力，把待纯化的某一蛋白质的特异配体通过适当的化学反应共价的连接到像琼脂糖凝胶一类表面的功能基，当蛋白质混合物加到填有亲和介质的层析柱时，待纯化的某一蛋白质则被吸附在含配体的琼脂糖颗粒表面上时，而其它的蛋白质则因对该配体无特异的结合部位而不被吸附，它们通过洗涤可除去，被特异结合蛋白质可用含游离的相应配体溶液把它从柱上洗脱下来。

蛋白质纯度的鉴定：①层析法：用分子筛或离子交换层析检查样品时，如果样品是纯的应显示单一的洗脱峰，称为“层析纯”。②电泳法：用PAGE检查样品呈现单一区带，也是纯度的一个指标，这表明样品在电荷和质量方面的均一性。纯的蛋白质电泳仅有一条区带，但仅有一条区带却不一定是纯的，仅能表明它在电泳上的均一性，称为“电泳纯”。③免疫化学法：免疫学技术是鉴定蛋白质纯度的有效方法，它根据抗原与抗体反应的特异性，可用已知抗体检查抗原或已知抗原检查抗体。④其他方法：还有超速离心法，蛋白质化学组成和结构分析等。