鲎试剂灵敏度复核试验
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版本：鲎试剂灵敏度复核试验作业指导书
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1.0 目的
对细菌内毒素检查试验所用的鲎试剂的灵敏度进行复核。
2.0 职责
质量与法规部负责本规程的起草，QC及相关人员执行本规程。
3.0 范围
适用于本公司细菌内毒素检查法。
4.0 参考文件
2010年版《中国药典》二部附录ⅪE细菌内毒素检查法
2010年版《中国药品检验标准操作规范》细菌内毒素检查法
《细菌内毒素检查法及其应用》第一版，气象出版社
5.0 定义
鲎试剂灵敏度复核试验：在细菌内毒素检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度（λ），用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。
反应终点浓度：指鲎试剂灵敏度复核试验中，系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。
6.0 设备/工具及物料
6.1 设备/工具
6.2 物料
6.2.1 细菌内毒素工作标准品除另有规定外，使用由中国药品生物制品检定所统一
发放的标准品。
6.2.2 细菌内毒素检查用水指内毒素含量小于0.015EU/ml（凝胶法）且对内毒素试
验无干扰的灭菌注射用水。
6.2.3 鲎试剂规格一般选用0.25 EU/ml。
7.0 操作步骤
7.1 提前30 min开启超净工作台，试验操作过程中不要开启风机，完毕后用75%乙醇擦拭
超净工作台。试验操作过程应防止微生物和细菌内毒素污染。
7.2 制备细菌内毒素标准溶液
7.2.1 取细菌内毒素工作标准品1支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈上部
划痕，用75%乙醇擦拭后启开，避免玻璃屑落入瓶内。
7.2.2 按照工作标准品说明书，加入细菌内毒素检查用水溶解。封口膜封口，置漩涡
混合器上混匀15 min后用细菌内毒素检查用水进行稀释，制成2.0 λ、1.0 λ、
0.5 λ、0.25 λ四个浓度的内毒素标准溶液。每稀释一步均应在漩涡混合器上混
匀30 s。
注：在使用过程中，标准品溶液若静置超10min，必须重新混匀30s再重新使用。
7.2.3 试验举例
设细菌内毒素工作标准品为100 EU/支；待测鲎试剂λ=0.25 EU/ml。稀释过程
如下：
取细菌内毒素标准品100 EU/支+1 ml检查用水100 EU/ml
取0.2 ml 100 EU/ml溶液+1.8 ml检查用水10 EU/ml
取0.2 ml 10 EU/ml溶液+1.8 ml检查用水 1 EU/ml
取0.9 ml 1 EU/ml溶液+0.9 ml检查用水0.5 EU/ml
取0.9 ml 0.5 EU/ml溶液+0.9 ml检查用水0.25 EU/ml
取0.9 ml 0.25 EU/ml溶液+0.9 ml检查用水0.125 EU/ml
取0.9 ml 0.125 EU/ml溶液+0.9 ml检查用水0.0625 EU/ml
即得2.0 λ、1.0 λ、0.5 λ、0.25 λ四个浓度的内毒素标准溶液。
7.3 溶解鲎试剂
7.3.1 取0.1 ml装量的鲎试剂18支，安瓿开启过程同6.2.1工作标准品。
7.3.2 每支鲎试剂加入0.1 ml细菌内毒素检查用水溶解，在试管架上按下面的形状排
列。
注：在复溶鲎试剂时，应使用可调式移液器连接无热原吸嘴加样，而不是使用移液
管加样。鲎试剂复溶后不能放到漩涡混合器上去混合，因为强烈混合容易使复溶后
的鲎试剂产生泡沫，影响凝胶的形成。实际上只需将鲎试剂复溶后静置1~2分钟鲎
试剂就可变澄清。
7.4 加样（鲎试剂安瓿排列如下图）
第1列每支加入 2.0 λ浓度的细菌内毒素标准溶液0.1 ml
第2列每支加入1.0 λ浓度的细菌内毒素标准溶液0.1 ml
第3列每支加入0.5 λ浓度的细菌内毒素标准溶液0.1 ml
第4列每支加入0.25 λ浓度的细菌内毒素标准溶液0.1 ml
第5列每支加入细菌内毒素检查用水0.1 ml，作为阴性对照
注：每次加样浓度必须是从高到低，加不同浓度的样品需更换新的移液器吸嘴。
7.5 加样结束后，用封口膜封口，将鲎试剂安瓿中溶液轻轻混匀，应避免产生气泡，连同
试管架垂直放入37℃± 1℃的恒温水浴箱中，试管架保持水平状态，保温60 min ± 2 min。
使用温度计监测恒温水浴箱温度是否满足实验要求，每30分钟进行温度记录，记录表格参见。
7.6 判断及计算
7.6.1 将鲎试剂安瓿从恒温水浴箱中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并
且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性“＋”；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、
变形并从管壁滑落者为阴性“－”。
注：保温和拿取鲎试剂安瓿的过程应避免受到振动造成假阴性结果。
7.6.2 当最大浓度2.0 λ 4管均为阳性，最低浓度0.25 λ 4管均为阴性，阴性对照管为
阴性，试验方为有效。
7.6.3 按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。
λc=lg -1（ΣX/4）
式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是系列递减的内毒素标准
溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。
当λc在0.5 λ~2 λ（包括0.5 λ和2 λ）时，判定该批鲎试剂灵敏度复核合格，方
可用于干扰试验和供应品细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵
敏度。
7.6.4 试验举例
如果待复核的鲎试剂的标示灵敏度为0.25 EU/ml，试验结果如下：
则鲎试剂灵敏度的测定值
λc = lg -1（ΣX/4）
=lg -1 [ (lg0.25 + lg0.25 + lg0.125 + lg0.25) / 4]
=0.21 EU/ml
结果λc在0.5 λ~2.0λ范围内，符合规定。以标示灵敏度0.25EU/ml为该批鲎试剂的
灵敏度λ。
8.0 记录和表格
设备温度记录表
鲎试剂灵敏度复核试验报告
注：在细菌内毒素测试报告中填写复核数据、复核结果、日期、检测人签名等相关内容。
1 试剂灵敏度的复核
1 试剂灵敏度的复核 细菌内毒素检查法至药典收载以来，每版都有明确规定：每使用新批量的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果改变时，应进行鲎试剂灵敏度的复核试验。在例行的药品制剂检查验收中发现，有些单位的检验人员在常规进行的细菌内毒素检查时，对所使用的鲎试剂从未进行过灵敏度复核，部分检验人员对此项工作不甚明了，完全忽视了复核鲎试剂灵敏度的重要性。 鲎试剂的灵敏度，即鲎试剂在本试验法规定的条件下能检测出的细菌内毒素标准液或供试品溶液中的最低内毒素浓度（用Eu/ml 表示），而灵敏度的测定即为鲎试剂在制备过程中受到各种因素影响，各批鲎试剂与内毒素形成凝胶反应的活力不一样，必须规定一种标准的内毒素按规定的方法测定。鲎试剂灵敏度复核的意义在于：(1)考查操作技能；(2)考查实验条件；(3)验证鲎试剂灵敏度是否准确，鲎试剂在生产、销售、运输、储存过程中易受诸如温度、光线、时间等外界因素的影响，使促凝活力降低；(4)验证细菌内毒素标准品的效价是否准确。因此为了保证细菌内毒素检查法的准确可靠性，检验者应对每批新购入的鲎试剂进行灵敏度的复核。 2 干扰试验 干扰试验目的是要确定出供试品在什么样的有效浓度内进行细菌内毒素检查时即可以克服的干扰因素，又能客观反映其所含内毒素是否符合根值。如氧氟沙星氯化钠注射液的细菌内毒素检查（2005版新收载，其限值为1ml 中含内毒素量应小于0.5Eu ）初次接触，笔者用不同灵敏度鲎试剂对该样品进行了干扰抑制试验，见表1。表1 氧氟沙星氯化钠注射液的浓度干扰试验结果说明，干扰抑制作用与药物浓度有关。药物原液或药物稀释两倍均存在干扰，PPC 不产生凝集，需再换高灵敏度鲎试剂，对供试品进行4 倍稀释， 样才能有效地排除氧氟沙星的干扰作用。所以当初次接触到一个样品时，必须对其做干扰试验，制定其检测方法。 3 检查法中的供试品阳性对照 在进行常规细菌内毒素检查时，规定了阳性对照（PC）、阴性对照（NC）及样品阳性对照（PPC ）等必备项目，阳性对照的目的是证明在实验条件下所用鲎试剂灵敏度符合规定，阴性对照的目的是证明所用的超纯水（BET ）中不存在可被检验到的内毒素，供试
QC-7129B鲎试剂灵敏度复核操作规程
正文 规范鲎试剂灵敏度复核的操作过程和要求，确保鲎试剂灵敏度复核结果的可靠性。 适用于质监处药理室对鲎试剂灵敏度的复核。 质监处药理室分析人员负责本规程的实施和完成相关记录。 USP版附录85； CP版附录Ⅺ E 。 细菌内毒素检查法：本法系利用从鲎的变形细胞中提取的试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的含量是否符合规定的一种方法。细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。 鲎试剂：是鲎变形细胞的溶出物经提取而成。 鲎试剂灵敏度：在本检查法规定的条件下能检测出内毒素标准溶液或供试品溶液中的最低内毒素浓度，用EU/ml表示。 细菌内毒素检查用水(BET水)：系指与灵敏度为0.03EU/ml 或更高灵敏度的鲎试剂在37 1 C 条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。 细菌内毒素标准品：USP细菌内毒素参考标准品(RSE)或已标定的细菌内毒素工作标准品(CSE)。 反应终点浓度：是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈现阳性结果的浓度。 一、试剂、材料与仪器设备 试剂： 鲎试剂批号、灵敏度、规格、生产商。 细菌内毒素检查用水(BET水) 批号、规格、生产商。 细菌内毒素标准品批号、效价、生产商。 材料及仪器设备： 电热恒温水箱型号、设备编号。 电热鼓风干燥箱型号、设备编号。 漩涡混合器型号。 无热原试管规格：1075mm。 正文 无热原玻璃瓶规格：25ml。 无热原玻璃吸管规格：1ml、2ml、5ml、10ml。 试管架、无热原封口膜、洗耳球、酒精棉球、砂轮片。
二、试验准备 试验所用的容器、用具都必须经过处理，250C以上干烤至少1小时，以去除外源性内毒素。试验操作过程应避免微生物的污染。 三、内毒素溶液配制 细菌内毒素标准品系列溶液配制取RSE或CSE 1瓶，按照使用说明书加入规定量的细菌内毒素检查用水使溶，并用漩涡混合器间歇混匀30分钟，然后用细菌内毒素检查用水进一步稀释至2.0、、 0.5、 0.25四个浓度的内毒素标准溶液，每一步稀释应混匀至少30秒钟。 四、试验过程 取被复核的鲎试剂原安瓿18支，分别用0.1ml细菌内毒素检查用水复溶。其中16支加入0.1ml细菌内毒素系列标准溶液，每浓度溶液平行做4支；另外2支加入0.1ml 细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将安瓿中的溶液轻轻混匀后，用封口膜封闭管口，垂直放入371℃电热恒温水箱中，保温602分钟。反应结果记录在鲎试剂灵敏度复核记录中。 五、试验结果观察和有效性 结果观察将安瓿从电热恒温水箱中轻轻取出，缓缓倒转180°时，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为(+)；凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为(–)。保温和拿取安瓿过程应避免受到振动造成假阴性结果。 有效性对于细菌内毒素标准品系列溶液，如果最大浓度2.0管均为阳性，最低浓度0.25管均为阴性，阴性对照管均为阴性，试验方为有效。 六、灵敏度复核结果的计算 计算公式为： c=lg-1(Σe/4) 正文 式中e为细菌内毒素标准品反应终点浓度的对数值。 合格标准当0.5≤c<1.3时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度为该批鲎试剂的灵敏度。 鲎试剂有效期按厂家规定执行。 鲎试剂应在2～10℃条件下保存。 当鲎试剂的批号改变时需进行鲎试剂灵敏度的复核。
显色基质鲎试剂盒使用说明(终点显色法,含偶氮化试剂)
显色基质鲎试剂盒使用说明(终点显色法，含偶氮化试剂) 货号：T7571 保存：阴凉处，最佳2-8℃，避光贮存。 产品内容： 细菌内毒素工作品，5支 鲎试剂， 1.7ml/支，5支 显色基质，1.7ml/支，5支 偶氮化试剂1，10ml/支，5支 偶氮化试剂2，10ml/支，5支 偶氮化试剂3，10ml/支，5支 HCl(反应终止剂)，50ml/瓶，1瓶 细菌内毒素检查用水，50ml/瓶，3瓶 用途： 显色基质鲎试剂(Chromogenic End-point TachypleusAmebocyte Lysate，CE TAL)用于体外细菌内毒素的定量检测，禁止以任何途径进入机体。 原理： 鲎试剂为鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的冷冻干燥品，鲎试剂中含有Ｃ因子、Ｂ因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。在适宜的条件下（温度，pH值及无干扰物质），细菌内毒素激活C因子，引起一系列酶促反应，激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的显色基质，使其分解为多肽和黄色的对硝基苯胺（pNA，λmax=405nm）。在一定时间内，pNA 的生成量与细菌内毒素浓度成正相关，据此，可以定量供试品的内毒素浓度。 同时，对硝基苯胺（pNA）也可用偶氮化试剂染成玫瑰红色（λmax=545nm），避免了供试
品本身的颜色对405nm处吸收峰的干扰。 检测限： 按反应时间不同可检测0.1EU/ml-1EU/ml和0.01EU/ml-0.1EU/ml两个区间(反应时间T1和T2见出厂检验报告)。 用法： 1.材料和设备 1.1试剂 鲎试剂、细菌内毒素工作品、显色基质、偶氮化试剂1、偶氮化试剂2、偶氮化试剂3、HC l (反应终止剂)、细菌内毒素检查用水。 1.2器材 无热原试管、无热原吸头、旋涡混合仪、移液器、多道移液器、封口膜、试管架、恒温水浴箱（37±1℃）、分光光度计。 注意：接触试剂及供试品的所有器皿必须是无热原的(我公司提供无热原耗材)。 玻璃器皿可经250℃干烤至少60分钟去除热原。 2.供试品的贮存与预处理 备注：若供试品为血液类，请参照我厂配套血液相关处理试剂使用说明书。 2.1供试品的pH值应在6-8之间，若超出此范围，需用无热原缓冲液、0.1N氢氧化 钠或0.1N盐酸调节。 2.2若供试品中可能存在鲎实验的干扰物质，处理参见【供试品的干扰试验】。 2.3若供试品中可能含有β－葡聚糖（β－葡聚糖会产生G因子旁路反应，干扰内毒素 检测），需选用特异性鲎试剂（我公司提供）。 2.4若供试品为一些抗菌素如头孢类抗菌素和磺胺制剂会对偶氮染色剂产生偶联反应
鲎试剂灵敏度复核试验
鲎试剂灵敏度复核试验 一.试验目的 当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 二.试验步骤 1.根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ）,将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟, 然后制成2λ、1λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。 2.取复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管各加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。 3.将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃的适宜恒温器中，保温60分钟±2分钟。 三.结果分析 1.将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°时，若管内形成凝胶，且不从管壁滑脱者为阳性；若不形成凝胶，或形成凝胶但倒转180°后从管壁滑脱者为阴性。 2.若最大浓度2.0λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc），计算方法见中国药典。 3.反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性
结果的浓度。 4.当λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。 四.注意事项 1.保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。 2.安瓿开启前应先用砂石划痕(不管是色点或包环易折安瓿)，用手半拉半掰将颈部折断，千万不能用镊子敲击，防止碎玻屑掉入安瓿。
鲎试剂实验方法
鲎试剂实验方法 鲎试剂按实验方法可分为：凝胶法、动态浊度法鲎试剂、终点浊度法鲎试剂、动态显色法鲎试剂、终点显色法鲎试剂。 凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量内毒素的方法。凝胶法是通过观察有无凝胶形成作为反应的终点。此法操作比较简单，经济，不需要专用测定设备，可以进行定性或半定量测定。 凝胶法鲎试剂常见规格为0.1ml/支或0.2ml/支的单个测试或0.5ml/支至5.2ml/瓶的真空封口西林瓶装的多个测试。使用时一般应加细菌内毒素检查用水复溶后使用。厦门市鲎试剂实验厂有限公司的真空封口试管凝胶法鲎试剂是把鲎试剂直接灌装在试管中，在真空中压盖封口的新产品。使用时直接用样品溶解鲎试剂，不会割伤手，更加简单方便安全。 特异性鲎试剂，即弃G因子鲎试剂，是厦门市鲎试剂实验厂有限公司国内首创的产品，它专一对内毒素起反应，避免了G因子旁路的干扰，使检测结果更加可靠，在药检和临床检验方面是不可或缺的理想检测试剂。目前厦门市鲎试剂实验厂有限公司提供的各种内毒素检测鲎试剂均为特异性鲎试剂，都能对抗葡聚糖的干扰，只对内毒素起反应。因此不列为独立品种。 动态浊度法鲎试剂、终点浊度法鲎试剂、动态显色法鲎试剂、终点显色法鲎试剂，这四种方法都是定量检测内毒素的。这几种定量法鲎试剂统称光度法鲎试剂。 根据检测原理，终点浊度法和动态浊度法都属于浊度法。浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。终点浊度法未见商品化产品。动态浊度法（又称动态比浊法）是检测反应混合物的浊度上升某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。 动态浊度法的特点为：1. 能准确定量。2.检测范围宽，可达4个数量级。3.灵敏度高达0.005EU/ml。4. 操作简便，系统自动检测分析，一步即成。5. 经济实用，试剂样品需要量少，可降至50μL。6. 和微生物检测系统Elx808（配套IU）及专用软件TALgent使用，一次可同时检测多达96个样品。 终点显色法和动态显色法都是属于显色基质法。显色基质法系利用鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物显色释放出的呈色团的多少而测定内毒素含量的方法，根据产物颜色判断内毒素浓度，又称为比色法。显色基质法由于不依赖凝固蛋白形成凝胶，抗干扰能力强，特别适用于生物制品（蛋白、疫苗等）和临床样品（黄疸、血液、尿液）的细菌内毒素检测。 终点显色法是目前反应时间最短的鲎试验法，只需要16分钟就能得出结果。而且可以偶氮化染色剂，避开某些有色检品自身颜色对鲎试验的干扰。终点显色法不需要特殊的检测仪器就能准确定量。 动态显色法鲎试剂兼有动态浊度法和终点显色法鲎试剂的优点，抗干扰能力强，使用简单方便，检测范围宽，灵敏度高达0.005EU/ml, 是目前世界上最好的鲎试剂。但是价格较高。 如果您仅需要检测样品的内毒素限量，可以选择凝胶法鲎试剂，通过确定内毒素限值及最大有效稀释倍数，做样品的干扰试验从而确定使用的鲎试剂的灵敏度。如果您需要定量测定样品中内毒素含量则应选择显色基质鲎试剂盒或动态浊度法鲎试剂。日常检测量不大时，可以选择终点显色法鲎试剂，用普通的分光光
显色基质鲎试剂盒使用说明书 (终点显色法,含偶氮化试剂)
显色基质鲎试剂盒使用说明书(终点显色法，含偶氮化试剂) 【用途】显色基质鲎试剂( Chromogenic End-point Tachypleus Amebocyte Lysate , CE TAL )用于体外细菌内毒素的定量检测，禁止以任何途径进入机体。 【原理】鲎试剂为鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的冷冻干燥品,鲎试剂中含有Ｃ因子、Ｂ因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。在适宜的条件下（温 度，pH值及无干扰物质），细菌内毒素激活C 因子，引起一系列酶促反应， 激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的显色基质，使其分解为 多肽和黄色的对硝基苯胺（pNA，λmax = 405nm）。在一定时间内，pNA的生成量与细菌内毒素浓度成正相关，据此，可以定量供试品的内毒素浓度。同时，对硝基苯胺（pNA）也可用偶氮化试剂染成玫瑰红色（λmax = 545nm），避免了供试品本身的颜色对405nm处吸收峰的干扰。 【检测限】按反应时间不同可检测0.1EU/ml-1 EU/ml和0.01EU/ml -0.1EU/ml两个区间( 反应时间T 1 和T 2 见出厂检验报告) 。 【试剂盒组成】 细菌内毒素工作品，2支 鲎试剂， 1.7ml/支，2支 显色基质，1.7ml/支，2支 偶氮化试剂1，10ml/支，2支 偶氮化试剂2，10ml/支，2支 偶氮化试剂3，10ml/支，2支 HCl (反应终止剂)，50ml/瓶，1瓶 细菌内毒素检查用水，50ml/瓶，2瓶 【贮存】阴凉处, 最佳2-8℃,避光贮存。 【用法】 1 .材料和设备 1.1 试剂 鲎试剂、细菌内毒素工作品、显色基质、偶氮化试剂1 、偶氮化试剂2 、偶氮化试剂3、HC l ( 反应终止剂) 、细菌内毒素检查用水。 1.2器材 旋涡混合仪、移液器、多道移液器、封口膜、试管架。 恒温水浴箱（37±1℃）、分光光度计。 注意：接触试剂及供试品的所有器皿必须是无热原的(我公司提供无热原耗材)。 玻璃器皿可经250℃干烤至少60分钟去除热原。 2. 供试品的贮存与预处理 备注：若供试品为血液类，请参照配套血液相关处理试剂使用说明书。 2.1供试品的pH值应在6 - 8之间，若超出此范围，需用无热原缓冲液、0.1N氢氧化钠或0.1N 盐酸调节。
动态显色法内毒素检测鲎试剂盒使用说明书
动态显色法内毒素检测鲎试剂盒使用说明书 货号：T7570 规格：48T/盒1.7ml 保存：阴凉处，最佳2-8oC，避光保存。 产品说明： 鲎试剂为鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的冷冻干燥品,鲎试剂中含有Ｃ因子、Ｂ因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。在适宜的条件下(温度，pH值及无干扰物质），细菌内毒素激活C因子，引起一系列酶促反应，激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的显色基质，使其分解为多肽和黄色的对硝基苯胺（pNA，λmax=405）。反应液的吸光度(OD值)增加,OD值增加的速度与内毒素浓度成正相关。换言之，OD值上升某一预设限值(启动OD)所需要的时间(定义为启动时间)与内毒素浓度成负相关，启动时间的对数与内毒素浓度的对数成线性关系，据此，可以定量供试品的内毒素浓度。 试验所需材料和器材： 内毒素工作标准品、鲎试剂、显色基质、细菌内毒素检查用水、除热原试管、除热原吸头、除热原96孔微板（或可拆式板条）、旋涡混合器、移液器、试管架、带温育系统的动态光度测定仪器及配套软件，例如，微板鲎试仪ELx808及软件TALgent或Gen5。 注意事项： ①该试剂盒用于体外细菌内毒素的定量检测，严禁试剂以任何途径进入机体。 ②接触试剂及供试品的所有器皿必须是除热原的。试验过程应防止微生物的污染。 该说明书中的除热原指内毒素浓度小于0.005EU/ml。 ③供试品的pH值应在6.0–8.0之间，若超出此范围，需用除热原的缓冲液、0.1M氢氧化钠或0.1M 盐酸调节。 ④当供试品中可能存在鲎试验的干扰物质时，须进行干扰试验，参见【供试品的干扰试验】。 操作步骤：
1、动态光度测定仪器的设定，以鲎试验微生物快速检测系统ELx808IU为例： 预热仪器，设置温育温度为37oC。 设置模板及程序。 设定读板波长为405nm，设定动力学参数：读板120分钟，每30秒读一次。 2、内毒素标准溶液配制（浓度10，1，0.1，0.01EU/ml） 2.1、取内毒素工作标准品1支，用砂轮沿安瓿颈部划痕，开启，加入适量（建议在0.5ml-1.2ml 之间）细菌内毒素检查用水，置旋涡混合器上剧烈振摇5分钟。 2.2、将上述内毒素溶液进一步用细菌内毒素检查用水稀释成所需浓度，每稀释一步均应在旋涡混合器 上剧烈振摇1分钟。 稀释的内毒素溶液静置时间超过10分钟，用前在旋涡混合器上剧烈振摇1分钟，放置4小时以上的内毒素溶液应丢弃。 (参见《内毒素工作标准品使用说明书》)。 3、阴性对照为细菌内毒素检查用水。 4、鲎试剂的溶解：按标示量加细菌内毒素检查用水于显色基质中，轻轻摇晃溶解显色基质，再将溶解的 显色基质全部加入到鲎试剂中，轻轻摇晃使鲎试剂完全溶解。注意不要用旋涡混合器剧烈振摇。溶解的鲎试剂应在10分钟内使用。 若采用多道移液器，将溶解的鲎试剂转移到除热原加样槽，并轻轻摇匀。 5、实验操作 取除热原微板，在各孔中分别加入100μl细菌内毒素检查用水、内毒素标准溶液，或供试品。 将微板放置于鲎试验微生物快速检测系统ELx808IU中，37oC预热10分钟。 预热结束，用移液器或多道移液器每孔加入100μl鲎试剂（避免产生气泡!)，中速振摇10秒混匀，于37oC温育120分钟，并且在405nm波长处，每30秒读一次OD值。 6、数据处理 设定启动OD为0.2，软件自动给出其启动时间(T)。 建立标准曲线：lgT=b lgC+a，其中T为启动时间，C为内毒素的浓度，b为直线斜率，a为Y轴截
去内毒素实验方法介绍
去内毒素质粒提取Protocol 内毒性也称为脂多糖或LPS，是革兰氏阴性（如大肠杆菌，E.coli）胞膜上一种成分。细菌外膜的外部脂质成分完全由内毒素分子组成。一个E.coli包含约2百万个LPS分子，每个LPS 分子又由疏水性的脂质A、复杂的多糖链以及带负电荷的磷酸基团组成。因此每个内毒素既包含疏水区域也包含了亲水和带电区域，从而赋予其与其它分子相互作用的独特性质。 图1. 内毒素结构图。 细菌在其活跃生长时表面的内毒素成分较少，而一旦其死亡则会释放大量内毒素。在质粒提取的裂解过程中，内毒素会从细菌的外膜释放到裂解液中。内毒素的存在会严重的影响质粒转染细胞的效率，此外会激活造血细胞（如B细胞、巨噬细胞等）的非特异免疫反应，造成实验的假阳性，所以转染级质粒的提取纯化必须去除内毒素。 内毒素如何测定？ 历史上，内毒素测定主要是基于内毒素与鲎（一种海洋节支动物，也称马蹄型蟹）血液中的变形细胞冻融后的溶解物（鲎试剂）接触时可发生凝血反应。鲎试剂与细菌内毒素产生凝胶反应的机理是：鲎的血液及淋巴液中有一种有核的变形细胞，胞浆内有大量的致密颗粒，内含凝固酶及凝固蛋白原。当内毒素与鲎变形细胞冻融后的溶解物（鲎试剂）接触时，可激活凝固酶原，继而使可溶性的凝固蛋白原变成凝固蛋白而使鲎变形细胞冻融物呈凝胶状态。现在已经发展出更加灵敏的光度计测试方法，该方法主要基于鲎试剂以及一种人工合成的可产生颜色反应的底物。 LPS污染通常用内毒素单位（Endotoxin Units, EU）表示，通常情况下，1ng LPS对应于1到10个EU。
Protocol 常用的试剂盒选择包括Qiagen、Sigma都挺好用的。或者omega、天根等。在选择取出内毒素的质粒提取试剂盒的时候有一个小窍门，就是有的盒子上写着“Endofree”字样，这种试剂盒是专门用来提取用于细胞转染实验的质粒的。一般这种质粒提取试剂盒采用独特的硅胶膜吸附技术，高效专一地结合质粒DNA。同时采用特殊的溶液P4和过滤柱CS，可以有效的去除内毒素、蛋白等杂质。没有这个字样的试剂盒，对于常规的分子克隆实验，如，PCR，酶切，克隆等完全够用了。 如果不是特别的试验，建议采用手工方法，丁香园战友推荐以下的protocol提的质粒免疫动物没有问题，曾用于制备DNA疫苗，可进行大量的去内毒素质粒提取。 1）挑取一个新鲜菌落接种于含5ml LB及相应抗生素的试管，37℃培养8-12小时。 2）用上述新鲜培养物小提质粒鉴定后，剩余的菌液接种于含相应抗生素的400ml LB培养基中，37℃培养12-16小时。 3）用500ml离心筒收集菌液，5000rpm离心10分钟，弃上清。 4）用40ml预冷的STE重悬菌体，转移至2支30ml离心管中，6000rpm 5分钟，弃上清。 5）用3ml预冷的溶液I重悬菌体，再加入6ml新鲜配制的溶液II，轻轻颠倒混匀；再加入4.5ml预冷的溶液III，轻轻颠倒混匀。 6）4℃12000rpm离心10分钟，将上清转移至另外的30ml管中。 7）加等体积的异丙醇，颠倒混匀，置于－20℃20分钟以上。 8）4℃12000rpm离心15分钟，弃上清，70％乙醇洗涤沉淀，37℃蒸发至沉淀边缘透明。 9）加入5ml TE使DNA溶解后，加入5mol/L的LiCl溶液5ml，轻轻混匀，-20℃放置5-10分钟。 10）4℃12000rpm离心15分钟，转移上清，加入等体积的异丙醇，-20℃放置20分钟以上。 11)4℃12000rpm离心15分钟，弃上清，用70％的乙醇洗涤沉淀，倒置控干后，37℃蒸发至沉淀基本透明。 12）用2ml TE溶解沉淀，并加入50μl/管的RNase（5mg/ml），37℃消化过夜。
09T-I660-01细菌内毒素检查法(一部)检验标准操作规程
09T-I660-01细菌内毒素检查法(一部)检验标准操作规程
—————————— 文件类别：技术标准 1/10 1.目的：建立细菌内毒素检查法(一部)检验标准操作规程，并按规程进行检验， 保证检验操作规范化。 2.依据： 2.1.《中华人民共和国药典》2010年版一部。 3.范围：适用于所有用细菌内毒素检查法(一部)测定的供试品。 4.责任：检验员、质量控制科主任、质量管理部经理对本规程负责。 5.正文： 5.1. 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断 供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 5.1.1. 细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法 和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。本试验操作过程应防止微生物和内毒素的污染。 5.1.2. 细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU） 相当。 5.1.3. 细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成。用于标定、复核、 仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。 5.1.4. 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用 于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。 5.1.5. 凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶 法）或0.005EU/ml（用于光度测定法）且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。
5.1. 6. 试验所用器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。 5.2. 供试品溶液的制备：某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的PH值在 6.0～8.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的PH值，可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节PH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。 5.3. 内毒素限值的确定：药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：L=K/M。 5.3.1. 式中：L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg 或EU/U（活性单位）表示； 5.3.2. K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kg.h)表示，注射剂K=5EU/(kg.h)，放射性药品注射剂K=2.5EU/(kg.h)，鞘内用注射剂 K=0.2EU/(kg.h)； 5.3.3. M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/(kg.h)、mg/(kg.h)或U/(kg.h)表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62m2计算。注射时间若不足1小时，按1小时计算。供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量（M）。 5.3.4. 按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需说明理由。 5.4. 确定最大有效稀释倍数（MVD）：最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许稀释的最大倍数（1→MVD），在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD：MVD=CL/λ。
鲎试剂使用说明书
凝胶法鲎试剂使用说明书 一、检测步骤 1、标准品稀释：开启后加入检查用水（W）1.2ml，置漩涡混合器上混合5min，得到 浓度为10EU/ml的内毒素溶液，标记为（E10），其余各梯度稀释方法如下： 0.3ml 1.5ml 1.5ml 1.5ml 1.5ml 1.5ml E10 －－－→E1－－－→E0.5－－－→E0.25－－－→E0.125－－－→E0.06－－－→E0.03 2.7mlW 1.5mlW 1.5mlW 1.5mlW 1.5mlW 1.5mlW 此步骤为新开启标准品者操作，各梯度做好标记，其余操作人员可直接使用。 2、取鲎试剂8支，折断安瓿瓶颈，其中2支作供试品检查管，2支作阴性对照管，2 支作阳性对照管，2支作供试品阳性对照管，做好标记。 3、阴性对照管加入0.2ml检查用水，其余各管加入0.1ml检查用水，每支供试品检查 管另加入0.1ml供试品；阳性对照管加入0.1ml浓度为2λ（即0.1ml 的E0.125）内 毒素溶液，供试品阳性对照管加入0.1ml含2λ（即0.1ul 的E1）内毒素的供试品。 4、封闭管口，轻轻摇匀，垂直放入37℃的恒温金属浴中60min，然后取出观察结果。 在孵育期间避免任何震动！ 二、结果判断 1、将试管从恒温器中轻轻取出，缓慢倒转180°，若管内形成凝胶，不变形，不滑落者 为阳性，记录为（+）；反之为阴性，记录为（—）。取出试管应尽量避免受到震动 造成假阴性结果！ 2、阴性对照管必须为阴性，阳性对照管、供试品阳性对照管必须为阳性，否则实验结 果无效。 3、若阴性对照管为阳性，表明鲎试剂或检查用水货实验器具受到污染；若阳性对照管 为阴性，表明鲎试剂或标准内毒素已失效，或鲎试剂的灵敏度及标准内毒素的效价 标示不准，或实验条件不满足；若供试品阳性对照管为阴性，表明反应体系内有抑 制反应的干扰因素存在。
细菌内毒素检测标准操作
细菌内毒素检测（凝胶法）标准操作 目的：规范细菌内毒素的检测操作，保证细胞质量。 范围：适用于所有从治疗中心发放的细胞（包括CIK、DC、干细胞等）内毒素限量检测。 责任人：质量检测人员 材料： 一、电热干燥箱除外源性内毒素用，温度应能达到180℃。 二、恒温水浴箱或适宜的恒温器（37℃±1℃）。 三、水银温度计，精度在1℃以下，量程不小于50℃。 四、旋涡混合器。 五、可调式移液器 六、0.25EU/ml鲎试剂。 七、细菌内毒素工作品。 八、凝胶法细菌内毒素检查用水。 九、实验用具无热原吸头（1000μl、200μl）、带铝盖的凝集管（10mm×75mm）、试管架、计时器、75%酒精棉球、封口膜、剪刀、镊子、砂轮。所用玻璃器皿使用前须经250℃干烤至少1小时或180℃干烤至少4小时。 操作方法 一、取样 1、细胞发放前3天，取细胞培养液约2ml，分装于2个带铝盖的凝集管中各约1ml左右，如不立即试验4℃存放（可存放多长时间）。 2、细胞发放当天，取细胞生理盐水混悬液约2ml，分装于2个带铝盖的凝集管中各约1ml左右，如不立即试验4℃存放。（可存放多长时间）。 3、取样应以无菌操作技术取样，所用器材在使用前应无热原或已去除热原。 二、鲎试剂灵敏度复核 鲎试剂灵敏度复核的目的是考察鲎试剂的灵敏度是否正确、考察检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。 在使用一批新的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进
行鲎试剂灵敏度复核实验。 （一）实验操作 1、细菌内毒素工作品溶液的制备 取细菌内毒素工作品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，开启过程中应防止玻璃屑落入瓶内。 按照工作品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。然后用倍倍稀释方式进行稀释，即0.5ml各浓度工作品溶液+0.5ml检查用水（以下稀释方式同此法），制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2.0λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。 2、待复核鲎试剂的准备 取0.1ml/支的鲎试剂18支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。若待复核鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，取若干支按其标示量加入检查用水复溶，充分溶解后将鲎试剂溶液混合在一起，然后每0.1 ml分装到10mm×75mm凝集管中，要求至少分装18管备用。 3、加样 将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）。4支（管）4列每列每支分别加入0.1ml的2λ、λ、0.5λ和0.25λ的内毒素标准溶液；另2支（管）加入0.1ml检查用水。 4、加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温60±2分钟。 5、观察并记录结果。将试管架从水浴或适宜恒温器中轻轻取出，避免振动，将每管拿出缓缓倒转180°观察，管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（＋）；未形成凝胶或凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（－）。 （二）实验结果计算
关于鲎试剂在细菌内毒素检查法中使用的探讨
关于鲎试剂在细菌内毒素检查法中使用的探讨 鲎试验因其简单﹑快速﹑灵敏﹑准确的特点，被世界各国广泛采用，中国药典和欧美药典将其定为法定的细菌内毒素检查法，大范围地替代了热源检查法。为了确保其检查结果的准确性，本文对鲎试剂的使用进行了探讨，以规范鲎试剂的正确使用。 【关键词】鲎试剂;细菌内毒素检查法 【Abstract】TAL reagent test because of its simple, fast and accurate characteristics was widely adopted around the world. Chinese Pharmacopoeia, European and the United States Pharmacopoeia set it as the statutory bacterial endotoxins test, replaces the pyrogen test on a large scale. In order to ensure the accuracy of test results, the main discussion of this paper is the use of tachypleus tridentatus leach(TAL),to regulate the proper use of TAL. 【Key words】TAL;bacterial endotoxins test 1 鲎试剂的分类 鲎试剂是从栖生于海洋的节肢动物“鲎”的蓝色血液中提取变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥而成的生物试剂，专用于细菌内毒素检测。 1.1 按原料来源分一种是由美洲鲎血液提取的称美洲鲎试剂(Limulus Amebocyte Lysate)，缩写为LAL，由美国生产;另一种是由东方鲎血液中提取的称东方鲎鲎试剂(Tachypleus Amebocyte Lysate)，缩写为TAL。TAL与LAL有相同的功效。 1.2 按实验方法分细菌内毒素检查法包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者又包括浊度法和显色基质法[1]。则鲎试剂可分为：凝胶法鲎试剂、动态浊度法鲎试剂、终点浊度法鲎试剂、动态显色法鲎试剂和终点显色法鲎试剂。 凝胶法鲎试剂通过与内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量内毒素的方法。 动态浊度法鲎试剂、终点浊度法鲎试剂、动态显色法鲎试剂和终点显色法鲎试剂则都是定量检测内毒素的。 1.3 按使用特点分 1.3.1 普通鲎试剂灵敏度0.5～0.125EU/ml，适用于仅需要检测内毒素限量的样品。 1.3.2 高灵敏度鲎试剂灵敏度0.06～0.015 EU/ml，适用于内毒素限量较低的样品细菌内毒素检查。 1.3.3 特异性鲎试剂灵敏度0.5～0.015EU/ml，适用于成分较为复杂，会对鲎试剂产生干扰的样品[2]。 1.3.4 定量法鲎试剂最低检测限0.03～0.005 EU/ml，适用于需要对内毒素进行定量测定的样品。 2 鲎试剂在细菌内毒素检查法中的正确使用 内毒素检查法结果准确与否与所用鲎试剂的灵敏度相关性很大[3]，而鲎试剂的灵敏度与它的正确使用又密切相关。所以，一定要严格执行鲎试剂的质量标准，规范使用鲎试剂。 2.1 保证所使用鲎试剂的质量鲎试剂的质量主要表现在其灵敏度、自凝时间与成胶状态三个方面：灵敏度稳定;自凝时间不低于24h[4];具有一定的缓冲能力与合适的pH;反应后即形成坚实凝胶，将成胶安瓿翻转180°而不会被破坏。而质量稍差的鲎试剂存放一定时间后(如半年)其灵敏度可能发生变化，而灵敏度的改变会使测定结果所反映的供试品中内毒素的允许限值发生变化[5]。因此，需选择具有国家颁发的批准文号,质量稳定的鲎试剂。
鲎试剂灵敏度复核记录
文件名称File Name Record of Review for Limulus Reagent Sensitivity File Number REC-SOP-C003059-01 -02 生效日期Effective Date 2018-10-18 有效期至 Expiry Date 2021-10-17 审批及颁发/APPROV AL & ISSUANCE 部门签名日期起草质量控制部 审核 质量控制部 质量保证部 批准质量负责人 颁发质量保证部 会审/COLLECTIVE REVIEW 部门签名日期部门签名日期/ / / 分发/DISTRIBUTION Copy-1 Copy-2/ 质量保证部质量控制部/
文件名称File Name Record of Review for Limulus Reagent Sensitivity File Number REC-SOP-C003059-01 -02 生效日期Effective Date 2018-10-18 有效期至 Expiry Date 2021-10-17 变更历史/CHANGES 版本号修改简述提出人生效日期 01 由原文件RE-C003060《鲎试剂灵敏度复核记录》变 更而来；文件编码改变。 魏永红2017-06-01 02 增加所使用仪器及试剂的信息汪华2018-10-18 附：记录样张
REC-SOP-C003059-01-02 鲎试剂灵敏度复核记录 Record of Review for Limulus Reagent Sensitivity 起草人/日期审核人/日期批准人/日期执行日期 2018-10-18 制订依据SOP-C003059 《细菌内毒素检查法标准操作规程》 1 试剂鲎试剂批号：；规格： ml×支； 生产厂家：□湛江安度斯生物有限公司；□福州新北生化工业有限公司； 细菌内毒素检查用水批号：；规格： ml×支；内毒素含量： EU/ml； 生产厂家：□湛江安度斯生物有限公司；□福州新北生化工业有限公司； 细菌内毒素标准品批号：；规格：支/盒；效价：______EU/支； 生产厂家：□中国药品生物制品检定所；□； 2 仪器试管恒温仪型号：TAL-40D 编号：□QC-187 □QC-216 □QC-217 3 操作根据鲎试剂灵敏度标示值（λ）将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器混匀15分钟，然后制成2.0λ、1.0λ、0.5λ、和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液。每稀释一步均在旋涡混合器上混匀30秒钟，按检查法项试验，每一浓度平行做4支，同时用细菌内毒素检查用水做2支阴性对照管。 保温时间： ~ 浓度 2.0λ 1.0λ0.5λ0.25λ阴性对照 管别 管 1 管 2 管 3 管 4 〈注：结果判断以＋、－表示阳性、阴性〉 如最大浓度2.0λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管均为阴性，按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。 计算公式：λc＝lgˉ1（∑X／4） ＝ ＝ X为反应终点浓度的对数值（lg） 当λc在0.5λ-2λ（包括0.5λ和2λ）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。 4 结论：该批鲎试剂的灵敏度为 EU/ml。 检验人/日期：复核人/日期：
[精华]鲎试剂试验方法
[精华]鲎试剂试验方法 鲎试剂实验方法 鲎试剂按实验方法可分为:凝胶法、动态浊度法鲎试剂、终点浊度法鲎试剂、动态显色法鲎试剂、终点显色法鲎试剂。 凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量内毒素的方法。凝胶法是通过观察有无凝胶形成作为反应的终点。此法操作比较简单，经济，不需要专用测定设备，可以进行定性或半定量测定。 凝胶法鲎试剂常见规格为0.1ml/支或0.2ml/支的单个测试或0.5ml/支至 5.2ml/瓶的真空封口西林瓶装的多个测试。使用时一般应加细菌内毒素检查用水复溶后使用。厦门市鲎试剂实验厂有限公司的真空封口试管凝胶法鲎试剂是把鲎试剂直接灌装在试管中，在真空中压盖封口的新产品。使用时直接用样品溶解鲎试剂，不会割伤手，更加简单方便安全。 特异性鲎试剂，即弃G因子鲎试剂，是厦门市鲎试剂实验厂有限公司国内首创的产品，它专一对内毒素起反应，避免了G因子旁路的干扰，使检测结果更加可靠，在药检和临床检验方面是不可或缺的理想检测试剂。目前厦门市鲎试剂实验厂有限公司提供的各种内毒素检测鲎试剂均为特异性鲎试剂，都能对抗葡聚糖的干扰，只对内毒素起反应。因此不列为独立品种。 动态浊度法鲎试剂、终点浊度法鲎试剂、动态显色法鲎试剂、终点显色法鲎试剂，这四种方法都是定量检测内毒素的。这几种定量法鲎试剂统称光度法鲎试剂。 根据检测原理，终点浊度法和动态浊度法都属于浊度法。浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。终点浊度法未见商品化产品。动态浊度法(又称动态比浊法)是检测反应混合物的浊度上升某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。
细菌内毒素检测方法验证讲解
细菌内毒素检测方法验证方案 起草人 起草日期 审核人 审核日期 批准人 批准日期
目的-------------------------------------------------------------------------范围-------------------------------------------------------------------------责任人----------------------------------------------------------------------内容------------------------------------------------------------------------- 1.实验材料及用具------------------------------------------------------- 2 实验准备---------------------------------------------------------------- 3.具体验证步骤----------------------------------------------------------3.1. 鲎试剂灵敏度复核------------------------------------------------3.2..干扰实验-------------------------------------------------------------- 3.3.供试品细菌内毒素检查-------------------------------------------- 4.验证结论--------------------------------------------------------------附： 表1.鲎试剂灵敏度复核记录 表2.干扰试验记录 表3.细菌内毒素检查记录
凝胶法鲎试剂测内毒素
凝胶法测内毒素 1)实验原理: 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成。用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。 凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。试验所用器皿需经处理，以除去可能存在的外源性内毒素，常用的方法是250℃干烤至少1小时，也可用其它确证不干扰细菌内毒素的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。试验操作过程应防止微生物的污染。 制备供试品需根据灵敏度λ确定最大有效稀释倍数（MVD）最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD： MVD=c L/λ 其中医用级透明质酸的内毒素限度为0.5EU/mg 2)实验方法 使用的是湛江安度斯生物有限公司生产的鲎试剂盒——灵敏度为λ=0.125-0.25EU/ml.选择λ=0.25EU/ml，孵育时间25分钟的使用方法 1，制备供试液 将所检医用级透明质酸样品配成c=1mg/ml的溶液S0待用，根据灵敏度λ=0.25EU/ml，L=0.5EU/mg,求得最大稀释倍数MVB=cL/λ为2。用水将S0稀释至2倍得供试液 2，制备内毒素溶液：取内毒素检测用水（ETW）及工作标准内毒素（CSE）各一支，开启，