玄参新鲜根和干燥根总DNA提取方法的比较研究
第27卷第6期
2009年11月
北京工商大学学报(自然科学版)
Journal of Beijing Technology and Business University (Natural Science Edition )
Vol 127No 16Nov.2009
文章编号:167121513(2009)0620004203
玄参新鲜根和干燥根总D NA 提取方法的比较研究
沈志雯, 刘 蕾, 徐 瑾, 杨业然, 何聪芬
(北京工商大学化学与环境工程学院,北京 100048)
摘 要:用十二烷基磺酸钠法分别提取玄参新鲜根及干燥根的DNA.电泳结果显示,从玄参新鲜根中可提取到完整DNA ,而从“发汗”后的玄参干燥根中提取的DNA 已降解.使用紫外分光光度
法对新鲜根中提取的DNA 进行纯度鉴定,A 260/A 280为1183.结果表明,所采用的十二烷基磺酸钠法可经济高效地从玄参根部提取到高质量的DNA.关键词:玄参;DNA 提取;十二烷基磺酸钠法中图分类号:TS218;Q751 文献标识码:A 收稿日期:2009204210
基金项目:北京市教育委员会自然科学基金资助项目(KM200910011001).
作者简介:沈志雯(1988—
),女,浙江宁波人,研究方向为生物工程;何聪芬(1966—
),女,河北无极人,教授,博士,主要从事植物分子生物学方面的研究.通讯作者. 玄参(Scrophularia ni ngpoensis Hemsl.)为玄参科玄参属多年生宿根类草本植物,以根入药,别名元参、黑参、浙玄参、乌元参等,主产于浙江、湖北、江苏、江西等省,为常用中药.玄参始载于《神农本草经》,列为中品,其味甘、苦、咸,性微寒,归肺、胃、肾经,具有凉血滋阴、泻火解毒之功效.高质量DNA 的提取已经成为分子生物学研究的重要技术环节之一,能否快速、经济地提取植物总DNA 以及所提取的DNA 质量的高低将直接影响整个实验结果.与其他提取植物DNA 方法比较,曾有报道十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate ,SDS )法对植物根中DNA 的提取有效,本文主要研究玄参根部DNA 提取方法的优化,以建立适宜药材玄参DNA 的提取方法.
1 材料与方法
111 实验材料
玄参新鲜根购于浙江省磐安大盘镇中药材市场;玄参干燥根购于北京市航天桥同仁堂药房,产自浙江.112 SDS 法所用试剂提取缓冲液:100mmol/L 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris 2HCl )(p H 值为810)、50mmol/L ED TA
(p H 值为810)、100mmol/L 氯化钠、1%巯基乙醇、20%十二烷基硫酸钠215mol/L 醋酸钾(p H 值为418);3mol/L 醋酸钠(p H 值为418);酚氯仿(1∶1);
异丙醇;70%乙醇;无菌水;RNA 酶(RNase A )(sig 2ma );所用试剂均为国产或进口分析纯.113 实验仪器
4K15型超速冷冻离心机,Sigma ;Power Pac 1000型电泳仪,B IO RAD ;D YCP 233A 型电泳槽,北
京市六一仪器厂;Alphalmager HP 型凝胶成像系统等.
114 实验方法[1-4]
11411 干燥根部DNA 提取方法
玄参根部含有大量的酚、萜、苷[5]类物质,这些物质对DNA 的提取有一定的影响,因此,对玄参干燥根设置平行对照组,一组为不处理,一组为70%乙醇浸泡2h 处理.
1)取玄参根部011g 液氮研磨,加入600μL 65℃预热的提取缓冲液及66μL 20%SDS ;2)65℃水浴保温45min ,4℃10000r/min 离心10min ;3)取上层清液加入2/3体积的醋酸钾溶液,冰上静置30min ;4)4℃10000r/min 离心10min ;5)取上层清液加入等体积酚氯仿溶液,充分混匀后4℃10000r/min ;6)取上层清液加入016倍体积的异丙醇,混
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匀后于-20℃保存2h ;7)4℃10000r/min 离心10min ;8)沉淀物干燥后溶于400μL 无菌水中,加入等体积酚氯仿溶液,充分混匀;9)4℃10000r/min 离心10min ;10)加入上层清液体积1/10的醋酸钠溶液,混匀后加入2倍体积的无水乙醇,-20℃保存2h ;11)4℃10000r/min 离心20min ,用70%乙醇洗涤,干燥后溶于50μL 无菌水中,放置于-20℃保存.
11412 以新鲜根为材料SDS 法提取DNA
第1)至7)步与11411中相同.沉淀物干燥后溶于400μL 无菌水中,加入2μL RNA 酶(RNase A ),37℃水浴30min ,其后步骤与11411中9)至11)步相同.
115 D NA 质量检测
电泳5μL DNA 与1μL 6×Loading Buffer 混合均匀,1×T AE 电泳缓冲液,018%琼脂糖凝胶,150V 30min 快速电泳,EB 染色后使用凝胶成像系统分
析.稀释50倍后用紫外分光光度法测量DNA 纯度.
2 实验结果分析
对玄参干燥根进行预处理结果显示,70%乙醇浸泡2h ,处理后溶液呈棕色.玄参根部含有环烯醚萜苷类成分[6],该类成分是玄参发汗后变黑的主要成分,在乙醇溶液中容易被析出.211 SDS 法提取干燥根D NA 结果分析
图1 SDS 法提取玄参干燥根DNA 结果
1～2:未处理的玄参干燥根DNA 提取结果;3～4:70%乙醇浸泡处理的玄参干燥根DNA 提取结果.
用SDS 法提取玄参干燥根中DNA ,结果如图1.由图1可见,无完整的DNA 主带出现,但有大量
弥散的条带,根据大小判断DNA 片段已降解为小分子;点样孔亮度较低,蛋白质及酚污染较少.70%
乙醇浸泡处理(图1中3～4)得到的DNA 亮度明显
高于未处理组(图1中1～2),证明70%乙醇浸泡可有效减少根部多酚物质对DNA 的影响.212 SDS 法提取新鲜根D NA 结果分析
SDS 法提取玄参新鲜根中DNA 结果如图2.由图2可见,DNA 主带明显且清晰无拖尾,可以提出玄参新鲜根的总DNA.结果说明,本研究所使用的SDS 法可以有效去除蛋白质及多酚类物质;加入RNA 酶可有效去除RNA ,则电泳图无RNA 条带出现.然而,DNA 主带的亮度不高,产率较低,推测原因是玄参根叶片中含有较多的酚类物质,极易自发氧化褐变或在多酚氧化酶(PPO )作用下发生酶促褐变,生成褐色的醌类物质等,这些物质与核酸发生不
可逆结合而使提出的核酸产率下降.
图2 SDS 法提取玄参新鲜根DNA 结果
1～2:为玄参新鲜根DNA
因以玄参干燥根为材料无法提取到完整的
DNA ,所以仅对新鲜根为材料SDS 法提取到的DNA 进行纯度检验,OD 260/280为1183,接近理论值118,DNA 质量浓度为40215μg/mL.根据电泳图结
果及分光光度计检测结果,提取到的DNA 质量较高.
3 结 论
使用SDS 法提取玄参新鲜根可以得到条带清晰,纯度(OD 260=1183)较高的DNA.
试验结果说明,采用玄参新鲜根能提取到完整的DNA ,而采用玄参干燥根提取的DNA 已被降解,推测是玄参的制药过程经过“发汗”作用所造成的影响.“发汗”过程是将供药用的块根,白天晾晒,夜间
堆积,反复堆积晾晒至半干,堆积2～3d “发汗”,使块根内部变黑,再进行白天晾晒、夜间堆积,直至全干;遇雨天则用炕烘烤,温度60℃左右,并适时翻
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第27卷第6期 沈志雯等:玄参新鲜根和干燥根总DNA 提取方法的比较研究
动,烘至半干时进行“发汗”,再烘干,随后又经长时间存储、运输,导致DNA在这些过程中被降解,在提取过程中无法得到完整DNA.此外,玄参根部含有大量的酚、萜、苷类物质.酚类物质极易自发氧化褐变或在多酚氧化酶(PPO)作用下发生酶促褐变,生成褐色的醌类物质等.这些物质与核酸发生不可逆结合而使提取的核酸产率下降.其中,环烯醚萜类和苯丙素苷类化合物含量较高,这两类化合物溶于乙醇,经70%乙醇浸泡处理后,可使部分环烯醚萜类和苯丙素苷类物质溶出,如果能够去除一部分这类物质,可减少其对DNA提取的影响.
本研究在干燥根的DNA提取中,对直接研磨与液氮研磨干燥根提取DNA分别进行了研究,结果表明,直接研磨效果与液氮研磨一致.推测原因是干燥根本身质地较为坚硬同时缺少水分,DNA酶活性很低,不会对干燥根中的DNA造成太大的影响.
本研究对加入异丙醇后-20℃保存时,时间对DNA提取的影响进行了研究,选择的保存时间分别为1h、2h、过夜.结果表明,加入异丙醇后-20℃保存1h产率最低,而保存2h及过夜产率较高且相近.因此,选择2h为最优保存时间.
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COMPARATIVE STU DY ON EXTRACTING D NA FR OM FRESH R OOTS AN D DESICCATED R OOTS OF
SCRO P HUL ARIA NIN GPO ENSIS HEMSL.
SHEN Zhi2wen, L IU Lei, XU Jin, YAN G Y e2ran, HE Cong2fen
(College of Chem ical and Envi ronmental Engi neeri ng,Beiji ng Technology and
B usi ness U niversity,Beiji ng100048,Chi na)
Abstract:Scrophularia ni ngpoensis Hemsl.is a typical tradtitonal Chinese herb,which contains phe2 nolics,terpenes and glycoside,et al.In this paper,the modified methods of SDS were used to extract genomic DNA from fresh roots and desiccated roots respectively.The results show that the genomic DNA can extract from fresh roots,but can not extract from desiccated roots.And the A260/A280of ge2 nomic DNA from fresh roots is1183.In conclusion,this provides an economic,convenient and effec2 tive method of DNA isolation for a biological study of scrophularia ni ngpoensis Hemsl.
K ey w ords:scrophularia ni ngpoensis Hemsl.;DNA isolation;modified SDS
(责任编辑:叶红波)
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