miR_21真核表达载体的构建及其对胃癌细胞增殖与凋亡的影响

miR_21真核表达载体的构建及其对胃癌细胞增殖与凋亡的影响
miR_21真核表达载体的构建及其对胃癌细胞增殖与凋亡的影响

基础研究miR-21真核表达载体的构建及其对胃癌细胞增殖与凋亡的影响孙阳阳丁骏△周晓丽朱逸之

作者单位:213003常州南京医科大学附属常州市第二人民医院病理科;△南京医科大学附属常州市第二人民医院肿瘤中心实验室

【摘要】目的探讨人微小RNA-21(miR-21)重组表达质粒对人胃癌SGC-7901细胞增殖与凋亡的影响及可能机制。方法设计合成靶向miR-21的互补双链DNA,退火后与真核表达载体pPG-miR-EGFP克隆连接,构建pPG-miR-21-EGFP重组表达质粒,利用脂质体Lipofectamine TM2000将鉴定正确的重组表达质粒pPG-miR-21-EGFP转染人胃癌SGC-7901细胞,荧光显微镜下观察转染效率。实验分为3组:空白对照组、空载体组、重组表达质粒组。以RT-PCR检测转染前后胃癌细胞miR-21的表达水平。MTT法评价重组表达质粒抑制肿瘤细胞生长的效果,流式细胞术及Hoechst33258法检测转染后胃癌SGC-7901细胞周期的分布和凋亡。Western blot法、免疫细胞化学法分别检测转染前后PTEN、PCNA、PDCD4、bcl-2、cyclin D1蛋白表达的水平。结果酶切及测序鉴定证实成功构建重组质粒pPG-miR-21-EGFP,转染人胃癌SGC-7901细胞后,荧光显微镜下观察转染效率达75%。RT-PCR检测显示重组表达质粒组胃癌细胞miR-21的表达下调,与空白对照组和空载体组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。Western blot法、免疫细胞化学法检测结果显示重组表达质粒组胃癌细胞cyclin D1、PCNA、bcl-2蛋白的表达下调(P<0.05),而PDCD4、PTEN蛋白的表达上调(P<0.05)。重组表达质粒组的细胞生长缓慢,凋亡指数增加。流式细胞术检测结果显示重组表达质粒组G1期细胞的百分比较空白对照组增加[(69.71±

0.314)%vs(50.1±0.331)%],S期细胞较空白对照组明显减少[(14.68±0.448)%vs(28.47±0.316)%](P<0.05)。结论重

组表达质粒pPG-miR-21-EGFP可显著下调miR-21在胃癌SGC-7901细胞中的表达,并在一定程度上抑制胃癌细胞的增殖,促进其凋亡,使较多的细胞停留在G1期,S期细胞减少,其作用机制可能是通过下调cyclin D1、PCNA、bcl-2蛋白的表达,上调PDCD4、PTEN蛋白的表达而实现的。

【关键词】胃肿瘤;微小RAN-21;增殖;凋亡

【中图分类号】R735.2【文献标识码】A【文章编号】1674-5671(2013)01-06

DOI:10.3969/j.issn.1674-5671.2013.01.02

Construction of a recombinant eukaryotic expression vector of miR-21and its effects on

proliferation and apoptosis in gastric cancer cells

SUN Yang-yang,DING Jun△,ZHOU Xiao-li,ZHU Yi-zhi(Department of Pathology,The Second People′s Hospital of Changzhou Affili-ated to Nanjing Medical University;△Tumor Center Laboratory,The Second People′s Hospital of Changzhou Affiliated to Nanjing Medical University,Changzhou213003,P.R.China)

Corresponding author:SUN Yang-yang.E-mail:sunyangyang527111@https://www.360docs.net/doc/d52560583.html,

【Abstract】Objective To construct a recombinant expression plasmid encoding human miR-21,and explore the effects of miR-21 expression on the proliferation and apoptosis of gastric cancer cells.Methods Double-stranded DNA encoding human miR-21was designed and used to construct eukaryotic expression plasmid pPG-miR-EGFP.The plasmid was transfected into the human gastric cancer cell line SGC-7901using Lipofectamine TM2000,and the transfection rate was monitored by fluorescence microscopy.Levels of miR-21 were analyzed by RT-PCR in three sets of cells:untransfected cells(control group),cells transfected with empty vector(empty group),and cells transfected with expression plasmid(expression group).In addition,cell growth and proliferation were assayed using MTT,and

【基金项目】常州市卫生局青年人才科研基金资助项目(NQ201104)

【通信作者】孙阳阳。E-mail:sunyangyang527111@https://www.360docs.net/doc/d52560583.html,

cell cycle progression and apoptosis were analyzed using flow cytometry based on Hoechst33258staining.Expression of PTEN,PCNA,PDCD4,bcl-2,and cyclin D1were analyzed using Western blotting and immunohistochemistry.Results The recombinant expression plasmid pPG-miR-21-EGFP was successfully constructed and transfected into75%of cells.Levels of miR-21were significantly lower in the expression group than in the empty or control groups(t=7.12,5.78,P<0.05).Expression of cyclin D1,PCNA,and bcl-2was significantly lower in the expression group than in the other two groups(P<0.05),while expression of PDCD4and PTEN was significantly higher(P<0.05).Cells in the expression group showed lower growth and higher apoptosis rates than cells in the control group(P<0.05),and flow cytometry revealed a greater proportion of cells in G1phase[(69.71±0.314)%vs(50.1±0.331)%]and a smaller proportion in S phase[(14.68±0.448)%vs(28.47±0.316)%](P<0.05in both cases).Conclusions Recombinant expression plasmid pPG-miR-21-EGFP can down-regulate miR-21expression in human gastric cancer SGC-7901cells and suppress their proliferation to some extent.It can also promote apoptosis,such that many cells stop at the G1phase and do not proceed to S phase.These effects on growth and apoptosis may be related to down-regulation of cyclin D1,PCNA,and bcl-2and/or with up-regulation of PDCD4and PTEN.

【Key Words】Gastric neoplasms;miR-21;Proliferation;Apoptosis

微小RNA-21(microRNA-21,miR-21)是近年来发现的一种生理性的调控型小分子、单链非编码RNAs,广泛存在于真核细胞中。成熟的miRNA以单链形式与辅酶因子TRBP和PACT结合后形成RNA诱导沉默复合物(RISC),后者与靶基因mRNA的3′非编码区(3′UTR)特异性结合,导致mRNA的降解或翻译抑制,从而在转录后水平发挥基因表达沉默效应,广泛参与了生物体的发育、细胞的增殖、分化、凋亡和肿瘤的发生[1]。有研究表明miR-21在乳腺癌、子宫颈癌、神经胶质瘤和大肠癌等组织中均呈高表达,与肿瘤的浸润、生长有关[2~4]。我们前期的实验发现miR-21在胃癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织,它是一种胃癌促进性miRNA,但是其引起肿瘤的机制尚不清楚[5]。我们通过microRNA靶基因预测网站寻找与肿瘤细胞增殖与凋亡相关的基因,构建pPG-miR-21-EGFP重组表达质粒,并将其转染入人胃癌SGC-7901细胞株,观察沉默miR-21表达后对相关靶基因表达的影响,进一步观察重组表达质粒对胃癌细胞增殖与凋亡的影响。

1材料与方法

1.1主要材料

将人胃癌SGC-7901细胞株(南京医科大学附属常州市第二人民医院肿瘤实验中心提供)分为3组:重组表达质粒组(pPG-miR-21-EGFP);空载体组(pPG-miR-EGFP);空白对照组。质粒载体pPG21-miR-EGFP购于上海吉玛制药有限公司,限制性内切酶XholI、BamHI及T4DNA连接酶购于美国NEB公司,RT试剂盒购于Fermentas公司,TRIZOL、PCR试剂盒购于Takara公司,PCR引物序列由大连宝生物技术有限公司合成,小鼠抗人bcl-2、程序性细胞死亡因子4(programmened cell death4,PDCD4)单克隆抗体、兔抗人细胞周期素D1(cyclin D1)、磷酸酶和张力蛋白同源缺失基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome,PTEN)和细胞增殖核抗原(pro-liferating cell nuclear antigen,PCNA)多克隆抗体等购于SantaCruz公司,MTT试剂盒、Hoechst检测试剂盒购于碧云天公司。

1.2方法

1.2.1人has-miR-21真核载体的构建及鉴定从microRNA数据库中获取人miR-21序列(5′-TCAAC-ATCAGTCTGATAAGCTA-3′),设计合成两端带有XholI、BamHI粘性酶切位点的互补双链DNA,序列交由上海生工公司合成。合成的DNA序列正义链为:5′-TGCTGTCAACATCAGTCTGATAAGCTAGTTTTGGC-CACTGAVTGACAGGGATTCGGGAAAACTGGAC-3′;反义链为:5′-CCTGTCAACATCAGTCTGATAAGCTA-GTCAGTCAGTGGCCAAAACAGGGATTCCTGGGAAA-ACTGGACC-3′。XholI、BamHI双酶切质粒载体pPG-miR-EGFP,用T4DNA连接酶连接线性化质粒载体与目的基因退火片断,转化感受态细菌DH5α,挑选卡那霉素抗性单克隆菌落扩增培养,去内毒素质粒提取并进行酶切鉴定及测序鉴定,将构建成功的重组表达质粒命名为pPG-miR-21-EGFP。

1.2.2pPG-miR-21-EGFP重组表达质粒的转染人胃癌SGC-7901细胞用含10%FBS、100μg/ml青霉素、100U/ml链霉素的RPMI-1640完全培养基培养,培养条件为37℃、5%CO2、饱和湿度。实验分为空白对照组、空

载体组、重组表达质粒组,按照Lipofectamine TM2000脂质体说明书操作,分别转染细胞。

1.2.3RT-PCR法检测胃癌SGC-7901细胞miR-21的表达水平于转染48h后按TRIZOL试剂说明书提取3组细胞总RNA,对miR-21用茎环引物进行逆转录反应,茎环引物序列为:5′-CTCAACTGGTGTCGTG-GAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAACATC-3′。反应条件为:16℃30min,42℃30min,75℃15min,4℃保存。利用SYBR-Green荧光染料法于定量PCR仪检测miR-21和U6的表达。RT-PCR引物序列为miR-21:5′-ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGA-3′(上游引物),5′-GTGTCGTGGACGTCGGCAATTC-3′(下游引物);U6:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′(上游引物),5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′(下游引物)。t△△法分析比较样品中miR-21的表达差异。将PCR 反应产物于2%琼脂糖凝胶电泳,观察扩增片段的特异性。

1.2.4Western blot法检测PTEN、PCNA、PDCD4、bcl-2、cyclin D1蛋白的表达收集3组细胞各2×107个/ml,加入100μl蛋白提取液并于冰上裂解30min,于4℃以15300r/min离心5min,收集上清液,蛋白变性,进行12%SDS-PAGE凝胶电泳,半干后转至PDVF膜上,封闭60min。小鼠抗人bcl-2、PDCD4单克隆抗体(工作液1∶800),兔抗人cyclin D1、PTEN、PCNA多克隆抗体(工作液1∶500)于4℃孵育过夜。山羊抗小鼠、山羊抗兔二抗(工作液1∶1000)室温放置2h。Pro-light HRP化学发光,通过ChemiDOCXRS成像系统进行采图,用Quality One软件半定量分析结果,分别计算PTEN、PCNA、PDCD4、bcl-2、cyclin D1/β-actin的灰度比。实验重复3次。

1.2.5免疫细胞化学法检测PTEN、PCNA、PDCD4、bcl-2、cyclin D1蛋白的表达分别将3组细胞以2×105个/ml的密度分别接种到预先铺有盖玻片的24孔板中,每孔300μl,待细胞达80%融合时弃去各孔培养液,PBS洗涤3次,4%多聚甲醛固定20min,PBS 洗涤3次,按照SP-9000免疫组化试剂盒说明书完成操作步骤。于显微镜下观察结果,每张切片任意选择10个视野,利用Image-Pro Plus6.0图像分析软件测量并分析胃癌细胞PTEN、PCNA、PDCD4、bcl-2、cyclin D1蛋白表达的平均光密度值(AOD),AOD=累积光密度值(IOD)/总面积(Area)。实验重复3次。1.2.6MTT法检测重组表达质粒对细胞增殖能力的影响将3组细胞按2×105个/ml的密度接种到96孔板中,每孔100μl,每组设6个复孔,分别接种4块96孔板,每天取一块板进行MTT反应。用酶标仪于490nm处测量各孔吸光值(OD),取均数,以时间为横轴,吸光值OD为纵轴检测各组细胞的体外增殖率。细胞增殖率(%)=(处理组吸光值-空白调零孔吸光值)/(对照组吸光值-空白调零孔吸光值)×100%。

1.2.7Hoechst33258染色法检测细胞凋亡将3组细胞以2×105个/ml的密度接种到24孔板中,按照凋亡检测试剂盒进行操作。收集各组细胞,每孔加入500μl Hoechst33258染色液,染色5min。PBS清洗3次,每次5min。以90%甘油封片,于荧光显微镜下观察荧光表达情况,随机计数10个视野,每个视野计数100个细胞,计数紫蓝色核固缩、浓染的凋亡细胞。按公式计算凋亡指数(AI),AI=凋亡细胞数/肿瘤细胞数×100%。

1.2.8流式细胞术检测细胞周期收集3组细胞各2×106个/ml,加入预冷的70%乙醇于4℃固定过夜,加入碘化丙啶染液1ml,流式细胞仪检测细胞周期的分布情况。

1.3统计学分析

应用SPSS13.0软件包进行统计学分析,计量资料以x±s表示,组间比较采用方差分析,两两均数的比较采用t检验。P﹤0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1重组表达质粒转染效率的观察

pPG-miR-EGFP载体中本身带有GFP(绿色荧光蛋白),荧光显微镜下可见转染成功载体绿色荧光的细胞(图1)。pPG-miR-21-EGFP质粒转染效率达75%。

2.2miR-21表达水平的检测

与空白对照组miR-21的表达(0.772±0.210)、空载体组miR-21的表达(0.765±0.098)比较,重组表达质粒组miR-21的表达(0.318±0.127)在胃癌SGC-7901细胞中的表达下调,差异具有统计学意义(t值分别为6.45、7.79,P均<0.05)。见图2。

2.3重组表达质粒pPG-miR-21-EGFP对PTEN、PC-NA、PDCD4、bcl-2、cyclin D1蛋白表达的影响

重组表达质粒组细胞cyclin D1、PCNA、bcl-2的

图1荧光显微镜下观察重组表达质粒转染的效果(×200)

注:A.空载体转染48h;B.重组表达质粒转染48h。

表2重组表达质粒转染后对胃癌SGC -7901细胞生长的影响

组别

24h

36h

48h

72h

空白对照组 2.032±0.187 3.746±0.144 4.629±0.211 6.345±0.165空载体组

2.027±0.129 4.006±0.209 4.876±0.317 6.174±0.181

重组表达质粒组1.674±0.173#▲

2.174±0.254

#▲

2.368±0.177

#▲

3.171±0.217

#▲

注:#分别与空白对照组比较,t 值分别为4.37(24h)、5.14(36h)、5.65(48h)、

4.97(72h),P 均<0.05。

分别与空载体组比较,t 值分别为3.98(24h)、4.34(36h)、5.12(48h)、

4.53(72h),P 均<0.05。

转染不同时间的OD 值

图3Western blot 法检测各组胃癌细胞中PTEN 、PCNA 、PDCD4、bcl -2、cyclin D1蛋白的表达

注:1.空白对照组;2.空载体组;3.重组表达质粒组。

图2RT -PCR 检测各组胃癌细胞miR -21的表达水平

注:M.Marker;1.空白对照组;2.空载体组;3.重组表达质粒组。

表1

各组胃癌SGC -7901细胞中PTEN 、PCNA 、bcl -2、cyclin D1、PDCD4蛋白的表达水平(x ±s )

组别PTEN/β-actin PCNA/β-actin cyclin D1/β-actin bcl -2/β-actin PDCD4/β-actin 空白对照组0.308±0.1400.934±0.1070.908±0.1220.916±0.2030.415±0.170空载体组0.312±0.0390.927±0.2330.899±0.0560.905±0.2160.423±0.216重组表达质粒组

0.912±0.12#▲

0.412±0.21#▲

0.317±0.08#▲

0.304±0.17#▲

0.876±0.20#▲

注:#

分别与空白对照组比较,t 值分别为(自左至右)19.34、6.72、8.66、7.92、20.47,P 均<0.01。▲

分别与空载体组比较,t 值分别为(自左至右)18.13、7.99、9.21、6.74、18.38,P 均<0.05。

图4免疫细胞化学法检测各组胃癌SGC -7901细胞中

PTEN 、PCNA 、PDCD4、bcl -2、cyclin D1蛋白的表达(×400)注:1.空白对照组;2.空载体组;3.重组表达质粒组。A.PTEN;B:bcl-2;C.cyclinD1;D.PCNA;E.PDCD4。

A1E1C1

B3

B2B1A3

A2C3

C2

D3

D1

D2

E3

E2

蛋白表达下调,与空白对照组和空载体组比较,差异有统计学意义(P <0.01),PDCD4、PTEN 的蛋白表达上调,与空白对照组和空载体组比较差异有统计学意义(P <0.05)。见图3、图4、表1。

2.4胃癌SGC -7901细胞增殖及凋亡能力的改变MTT 法检测结果显示,重组表达质粒组的细胞在

24h 时生长已明显减慢,增殖能力降低,细胞的增殖抑制率为17.8%,在36h 、48h 、72h 时的增殖抑制率分别为42.9%、

49.0%、51.0%,与空白对照组和空载体组比较差异具有统计学意义(P <0.05)。见表2。

图5重组表达质粒对胃癌SGC -7901细胞凋亡的影响(×200)

注:A.空白对照组;B.空载体组;C.重组表达质粒组。

表3

转染重组表达质粒后胃癌SGC -7901细胞细胞周期的变化

组别

G 1期

G 2期S 期空白对照组50.1±0.33119.75±0.23128.47±0.316空载体组55.47±0.4319.8±0.31024.73±0.212重组表达质粒组

69.71±0.314#▲

6.98±0.581#▲

14.68±0.448#▲

注:#

分别与空白对照组比较,t值分别为8.10(G1期),14.56(G2期),

9.73(S期),P 均<0.05;

分别与空载体组比较,t值分别为8.77(G1期),13.47(G2期),10.34(S期),P

均<0.05。

各组细胞周期所占的比例(%)

经Hoechst 33258染色后的细胞在荧光显微镜下观察,对照组的细胞形态正常,染色浅淡,而稳定转染重组表达质粒组的细胞可见凋亡细胞出泡现象,细胞核形态异常呈致密浓染,发出强烈蓝色荧光,与背景

形成鲜明的对比(图5)。空白对照组、空载体组和重组表达质粒组的肿瘤细胞凋亡指数分别为(2.37±1.33)%、(3.11±1.08)%和(30.47±3.69)%,差异有统计学意义(P <0.05)。

2.5SGC -7901细胞周期的改变

空白对照组细胞G 1期所占的比例为(50.1±0.33)%,

S 期为(28.47±0.32)%;重组表达质粒组细胞G 1期所占的比例为(69.71±0.31)%,S 期为(14.68±0.45)%。重组质粒pPG -miR -21-EGFP 可使细胞G 1期的百分比增加,S 期减少,使细胞阻滞在G 1期。重组表达质粒组各细胞周期分别与空白对照组、空载体组比较,差异均有统计学意义(P <0.05)。见表3。

3讨论

原发性胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,其死亡

率高达25.53/10万,

占恶性肿瘤全部死亡者的23.93%。由于内镜技术的发展极大提高了早期胃癌的检出率和治愈率,但对于进展期胃癌来说其预后仍然较差。肿瘤细胞的无限增殖和侵袭、转移是恶性肿瘤主要的生物学特征,研究细胞增殖活性的增加有利于发现癌

细胞的侵袭和转移[5]

PDCD4作为新近发现的一种肿瘤抑制剂,可抑

制肿瘤的发生、进展和转移,且可提高肿瘤细胞对化

疗、放疗的敏感性[6]

。PDCD4蛋白或mRNA 在肿瘤细

胞中表达降低,且这种低表达对肿瘤病理分级和预后判断均具有重要的指导意义。在正常状态下,PDCD4位于细胞核内,肿瘤发生时PDCD4蛋白由细胞核转移至细胞质并发挥抑制肿瘤的作用。有研究发现不同解剖部位的人类癌组织中均有PDCD4的表达,在所有癌组织中PDCD4在细胞核的表达减少,而在细胞质中呈阳性表达。在结肠癌组织中可发现PDCD4明显地由细胞核转移到细胞质的迹象,在小细胞肺癌的细胞核及细胞质中PDCD4的表达均丧失,而在浸润性乳腺癌的细胞核及细胞质中均出现阳性表达,这些均可以与正常组织互相区别。

PCNA 蛋白是一种仅在增殖细胞中表达的分子质量为36KD 的酸性蛋白,是DNA 复制必需的一种蛋白。PCNA 蛋白的表达在细胞周期G 1期逐渐增加,S 期达到高峰,而G/M 期减少,其含量预示肿瘤细胞的增殖活性,被认为是反映细胞增殖的可靠指标而用

于恶性肿瘤的研究[7]。细胞增殖活性的增加使癌细胞

容易脱离原发灶,有利于癌的侵袭、转移。

PTEN 是1997年发现的第一个具有双特异磷酸酶活性、与肿瘤的恶性增殖、侵袭和转移等生物学特性密切相关的抑癌基因。该基因主要通过使3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)去磷酸化达到阻止细胞生长和促进细胞凋亡的目的。在肿瘤发生的过程中,PTEN 基因的突变或丢失可导致PIP3通路不能正常激活,使本应死亡的变异细胞无节制地生长,这提示PTEN

具有抑制细胞增殖、促进细胞凋亡的作用[8]

cyclin D1基因是一种细胞周期相关的癌基因,为细胞周期G1期、S期的调控点,其过表达能缩短G1期,促使细胞提前进入S期,引起细胞生长失控、转化,进而导致肿瘤形成[9]。miRNA是真核生物中一种约22个核苷酸、参与转录后基因调控的非编码单链小分子RNA,可特异性地识别靶mRNA的3′非翻译区(3′UTR)并与之结合,引起靶mRNA的降解或翻译抑制,从而对基因进行转录后表达调控,调节许多重要的细胞活动[1]。生物信息学分析表明,人类三分之一的基因受其调控,每个miRNA可以调控多个基因的表达,每个基因同样受多个miRNA的调控。miRNA及其调控基因构成了一个非常严密的调控网络,该网络的精确运行确保了生物体各种生理过程的正常运行。有研究发现,miR-21在肺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、胃癌、胰腺癌、胰腺神经内分泌肿瘤、肝癌、胆管癌、结肠癌、前列腺癌中均呈过表达[10,11],尤其是在人高度恶性脑胶质母细胞瘤中,miR-21的水平可比非癌组织高5~10倍[12];Wang等[13]发现miR-21在人乳腺癌中的表达明显上调,并与肿瘤分期、血管浸润和肿瘤细胞的增殖指数相关,提示其在肿瘤的发生、发展中可能起癌基因的作用。Zhu等[14]研究发现用miR-21反义寡核苷酸治疗体内肿瘤,可使肿瘤体积明显缩小,Ki-67增殖指数降低。但是沉默miR-21是否对胃癌细胞也起到相同的作用,其机制又是如何至今还没有相关报道。鉴于miR-21的作用,我们在microRNA靶基因预测网站上寻找与肿瘤细胞增殖与凋亡相关的基因,观察miR-21对它们的影响。

本实验将构建成功的pPG-miR-21-EGFP重组表达质粒转染人胃癌SGC-7901细胞株后,RT-PCR检测结果显示重组表达质粒组胃癌细胞miR-21的表达水平与空白对照组、空载体组比较显著下降。同时Western blot法和免疫细胞化学法检测结果显示重组表达质粒组胃癌细胞的cyclin D1、PCNA、bcl-2蛋白表达水平比空白对照组和空载体组明显下降,而PD-CD4、PTEN蛋白表达上调。结合MTT、Hoechst33258、FCM的检测结果,发现肿瘤细胞增殖能力明显下降,凋亡数量增加,细胞G1期百分比增高,S期减少,说明重组表达质粒pPG-miR-21-EGFP能够抑制胃癌细胞的增殖,促进凋亡,其作用机制可能是通过调节与肿瘤增殖与凋亡相关的癌基因及抑癌基因而发挥作用,提示miR-21可以作为人胃癌基因治疗的候选靶点,因此,有关方面值得深入研究。

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[2013-02-04收稿][2013-02-16修回][编辑阮萃才]

细胞的增殖、分化、癌变、衰老和凋亡

细胞的增殖、分化、癌变、衰老和凋亡 一、单项选择题: 1.下图为人体细胞的分裂、分化、衰老和凋亡过程的示意图,图中①—⑥为各个时期的细 胞,a —c 表示细胞所进行的生理过程。据图分析,下列叙述正确的是 A .⑤与⑥的基因型相 同,蛋白质的种类也相同 B .细胞的衰老与凋亡就会引起人体衰老与死亡 C .若⑤⑥已失去分裂能力,则其细胞内遗传信息的流动方向为DNA →RNA →蛋白质 D .与①相比,②的表面积与体积的比值增大,与外界环境进行物质交换的能力增强 2.下列关于观察减数分裂实验的叙述中,错误.. 的是 A .可用蝗虫卵母细胞、蚕豆花粉母细胞的固定装片观察减数分裂 B .用桃花的雄蕊比用桃花的雌蕊制成的装片中,容易观察到减数分裂现象 C .能观察到减数分裂现象的装片中,可能观察到同源染色体联会现象 D .用洋葱根尖制成装片,能观察同源染色体联会现象 3.动物和人体内具有分裂和分化能力的细胞称为干细胞。对下图的相关叙述中,错误的是 A .a 过程表示干细胞能自我更新 B .b 、c 过程表示干细胞具有分化能力 C .a 、b 、c 过程中细胞的遗传信息表达情况不同 D .b 过程形成的细胞直接组成器官,可供器官移植使用 4.为了观察减数分裂各时期的特点,实验材料选择恰当的是 ①蚕豆的雄蕊 ②桃花的雌蕊 ③蝗虫的精巢 ④小鼠的卵巢 A .①② B .③④ C .①③ D .②④ 5.下列关于植物组织培养的叙述中,错误.. 的是 A .培养基中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压 B .培养基中的生长素和细胞分裂素影响愈伤组织的生长和分化 C .离体器官或组织的细胞都必须通过脱分化才能形成愈伤组织 D .同一株绿色开花植物不同部位的细胞经培养获得的愈伤组织基因相同 6.关于细胞生命历程的说法,错误.. 的是 A .细胞分化由遗传物质控制 B .细胞癌变过程中遗传物质发生改变 C .细胞衰老过程中部分酶活性改变 D .人在胚胎发育后期尾的消失是通过尾部细胞衰老死亡而实现的 二、多项选择题: 24.下列关于细胞衰老的说法正确的是 A .生物体内绝大多数细胞都要经过未分化、分化、衰老和死亡这几个阶段 衰老、凋亡 a b b c c ① ② ③ ④ ⑤上皮细胞 ⑥骨骼肌细胞

如何在组织中检测细胞增殖,分化和凋亡

在组织中检测细胞增殖、分化和凋亡的方法一、检测细胞增殖的方法 (1)直接方法:通过直接测定进行分裂的细胞来评价细胞的增殖能力 1、胸腺嘧啶核苷(3H-TdR )渗入法 胸腺嘧啶核苷(TdR )是DNA 特有的碱基,也是DNA 合成的必需物质。用同位素3H 标记TdR 即3H-TdR 作为DNA 合成的前体能掺入DAN 合成代谢过程,通过测定细胞的放射性强度,可以反映细胞DAN 的代谢及细胞增殖情况。但是具有放射性。 2、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE )检测法 羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE )是一种可穿透细胞膜的荧光染料,具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团,使CFSE 成为一种良好的细胞标记物。CFSE 进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。当细胞分裂时,CFsE 标记荧光可平均分配至两个子代细胞中,因此其荧光强度是亲代细胞的一半。这样,在一个增殖的细胞群中,各连续代细胞的荧光强度呈对递减,利用流式细胞仪在488nm 激发光和荧光检测通道可对其进行分析。 3、Brdu 检测法 Brdu 中文全名5- 溴脱氧尿嘧啶核苷,为胸腺嘧啶的衍生物,可代替胸腺嘧啶在DNA 合成期(S 期),活体注射或细胞培养加入,而后利用抗Brdu 单克隆抗体,ICC 染色,显示增殖细胞。同时结合其它细胞标记物,双重染色,可判断增殖细胞的种类,增殖速度,对研究细胞动力学有重要意义 4、增殖标志检测 有些抗原只存在于增殖细胞中,而非增值细胞缺乏这些抗原,您也可以通过特异性的

单抗来对细胞增殖进行检测。例如,在人体细胞中,Ki-67 抗体识别同名蛋白,在细胞周期 S 期、G2 期和M 期表达,而在G0 期和G1 期(非增殖期)不表达。用针对Ki-67 蛋白的单抗就可以检测细胞的增值情况。由于需要组织切片,这种方法无法进行高通量分析。不过这一方法颇受癌症研究者们的青睐,因为它能够用来检测体内肿瘤细胞的增殖。其他普遍使用的细胞增殖或细胞周期调控标志还包括,增殖细胞核抗原PCNA 、拓扑异构酶IIB 和磷酸化组蛋白H3 。 (2)间接方法:通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力 1、MTT 检测法 MTT 检测法主要反映细胞的能量代谢,是检测细胞增殖活力的一种简便准确的方法,其原理是在活细胞生长和增殖过程中,线粒体内的脱氢酶可将黄色的MTT 分解成兰紫色的甲 (Formazan ),生成的甲量的多少与细胞的数量和细胞的活力成正比。 2、ATP 检测 细胞内的ATP 含量受到了严格调控,检测ATP 也可以得到细胞增殖的信息。死亡细胞或即将死亡的细胞几乎不含ATP ,在细胞溶解物或提取物中测得的ATP 浓度与细胞数之间存在严格的线性关系。利用荧光素酶luciferase 及其底物荧光素luciferin 的ATP 检测以生物发光为基础,能够为您提供非常灵敏的结果。如果有ATP 存在荧光素酶就会发光,而且其发光强度与ATP 浓度成正比,用能读取发光信号的光度计和酶标仪都可以方便的进行检测。这种方法非常适用于高通量细胞增殖检测和筛选。 二、检测细胞分化的方法 1 、流式鉴定细胞表面标志,以判断细胞是否分化 2、观察细胞形态,与已分化的细胞进行对比 3、分化诱导评估其分化能力

四种甘草对人乳腺癌细胞增殖抑制和诱导凋亡作用的比较研究(精)

四种甘草对人乳腺癌细胞增殖抑制和诱导凋亡作用 的比较研究 [ 08-05-16 15:17:00 ] 作者:马淼编辑:studa20 【摘要】目的比较新疆四种野生甘草活性成分对人乳腺癌细胞的增殖 抑制作用,以期筛选出药效最佳的甘草种类。方法采用MTT法检测不同样品对BCAP37细胞的增殖抑制作用,Hoechst33258荧光染色法检测各样品诱导BCAP37细胞凋亡的作用。结果4种甘草的活性成分对人乳腺癌BCAP37 细胞具有显著的增殖抑制与诱导凋亡的作用,且存在显著的种间与产地间差 异。结论抗癌药效最佳的甘草种类为阿拉尔甘草。 【关键词】甘草活性成分人乳腺癌BCAP 37细胞 Comparative Study on the Anti-proliferation and Apoptosis- inducing Effects of Active Components from Four Glycyrrhiza Species on Human Breast Cancer BCAP-37 Cell Abstract:ObjectiveTo select the optimal glycyrrhiza species for medicinal utilization by comparing the anti-proliferation and apoptosis-inducing effects of active components from four wild glycyrrhiza species in Xinjiang on human breast cancer BCAP37 cell. MethodsThe anti-proliferation effects of different samples on BCAP 37 cell were measured by MTT assay. The cell apoptotic rate was detected by Hoechst 33258 stain.ResultsActive components of four Glycyrrhiza species inhibited the proliferation of BCAP37 cells and induced apoptosis significantly. What's more, there were significant interspecific and spatial variations in the anti-proliferation and apoptosis-inducing effects. ConclusionThe optimal Glycyrrhiza species for anticancer utilization is Glycyrrhiza alalensis L. Key words:Glycyrrhiza; Active Component; Human breast cancer BCAP37 Cell 甘草是我国十分重要的中药材,素有“十方九草”的美誉。近年来,随着对甘草开发利用的不断深入,甘草被广泛用于药品、食品、保健品、化妆品 等领域[1],甘草的市场需求量剧增。我国是世界上甘草出口大国,其中 80%为野生甘草,仅有20%为栽培甘草。我国甘草储量锐减,由建国初期 200~250万吨下降到50~70万吨[2]。现存的野生甘草资源已无法满足日益 增长的市场需求,因此,人工栽培甘草势在必行,野生优质甘草品种的筛选显

真核细胞常见表达载体

真核细胞常见表达载体 真核细胞, 表达载体 1、pCMVp-NEO-BAN载体 特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对,主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成,在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是,由于该真核细胞表达载体中抗neo 基因存在,转染细胞后,用G418筛选,可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。 2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白,在PCMV启动子驱动下,在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成,能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外,载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制,而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点,将外源基因扦入这些位点,将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。 3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因,在PCMV启动子驱动下,在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin 抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成,能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外,载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制,而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白,该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白,因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 4、pSV2表达载体 特点:该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的,克隆位点为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因,故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。 5、CMV4 表达载体 特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动,多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是,该表达载体不含有neo基因,转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。 其他常用克隆Vector: pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25 ug pUC19 DNA 25 ug 说明: pBluescript II kS、pUC18 &Puc19载体适合于DNA片段的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等。这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点,当外源DNA片段扦入,转化lacZ基因缺乏细胞,并在含有IPTG和X-gal的培养基上培养时,含有外源DNA载体的细胞将

第八章 细胞增殖和凋亡异常与疾病

第八章细胞增殖和细胞凋亡异常与疾病 一、A型题 1.细胞凋亡的概念是 A.由体内外因素引起的细胞渐进、缓慢的病变导致的细胞死亡过程 B.由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程 C.由体内外因素诱导的一种生理性、主动的细胞死亡方式 D.由体内外因素引起的细胞急性、严重的改变导致的细胞死亡过程 E.由体内外因素诱导的一种病理性、被动的细胞死亡方式 [答案] B [题解] 细胞凋亡是指由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程。 2.有关细胞凋亡的生理和病理意义下列哪一项是错误的? A.确保机体正常发育D.保证机体正常生长 B.维持内环境稳定E.发挥积极的防御功能 C.促进生物进化 [答案] C [题解] 细胞凋亡的生理和病理意义包括:①确保机体正常发育、生长;②维持内环境稳定;③发挥积极的防御功能;并不包括促进生物进化。 3.有关细胞凋亡的特征下列哪一项是错误的? A.由较弱刺激触发,可见于生理或病理情况 B.DNA片段化,电泳时呈“梯”状条带 C.溶酶体相对完整,局部无炎症反应 D.主动过程,耗能,无需新蛋白合成 E.胞膜皱缩内陷,分割胞浆成凋亡小体 [答案] D [题解] 细胞凋亡不仅是一个主动过程,需要耗能,而且还需要有新蛋白质合成。 5.促进细胞凋亡的基因是 A.Bcl-2 D.c-myc B.Fas E.Bcl-XL C.突变型p53 [答案] B [题解] Bcl-2、突变型p53和Bcl-XL都是抑制凋亡基因,而c-myc是双向调节基因,只有Fas基因是促进细胞凋亡的基因。 6.抑制细胞凋亡的基因是(0.377,0.392,03临床) A.Fas D.Bcl-2 B.野生型p53 E.Bcl-Xs C.c-myc [答案] D [题解] Fas、野生型p53和Bcl-Xs是抑制凋亡基因,而c-myc是双向调节基因,只有Bcl-2是抑制凋亡基因。 10.细胞凋亡时发生的变化下列哪一项出现最早? A.线粒体膜通透性增加D.核酸内切酶激活 B.线粒体跨膜电位下降E.核转录因子激活 C.凋亡蛋白酶激活 [答案] B [题解] 线粒体跨膜电位下降使线粒体膜通透性增加,随后才引起凋亡蛋白酶激活、核酸内切酶激活以及核转录因子激活。 11.细胞凋亡的双向调节基因是 A.野生型p53 D.Bcl-2 B.Fas E.Bax C.c-myc [答案] C [题解] 野生型p53、F as和Bax是促进凋亡基因,Bcl-2是抑制凋亡基因,而c-myc才是细胞凋亡的双向调节基因。 13.细胞凋亡的主要执行者是 A.核转录因子和核酸内切酶D.凋亡蛋白酶和谷氨酰胺转移酶

细胞增殖与分化的分子机制

第九章细胞增殖与分化的分子机制?细胞的增殖(proliferation)与分化(differentiation)是生物体整个生命活 动中的两个重要事件,与生物体的生长、发育、衰老以及疾病密切相关。 第一节细胞增殖的分子基础 ?(一)概念: ?细胞增殖(cellproliferation):指细胞通过生长和分裂使细胞数目增加,子细胞获得和母细胞相同遗传特性的过程,是细胞生命活动的重要体现。 ?生物体生长包括细胞数目增多、细胞体积增大和细胞外基质的合成。细胞的增多就是细胞增殖的过程。 ?(二)细胞增殖的意义: ?1、生命的延续、繁衍依靠细胞增殖。 ?低等的单细胞生物依靠细胞增殖分裂繁殖,高等生物依靠细胞减数分裂产生生殖细胞。 ?2、生物体生长发育依赖细胞增殖。 ?3、补充生命活动中衰老和死亡的细胞。 ?4、创伤的修复。 ?(三)细胞增殖的方式 ?无丝分裂:没有纺锤体形成,无核膜核仁的消失和重建。 ?减数分裂:有性生殖中生殖细胞形成过程中发生,连续两次分裂DNA只复制一次。?有丝分裂:有纺锤丝形成,细胞核先分裂再发生胞质分裂,是真核细胞的主要增殖方式。 二、细胞周期 ?细胞周期(cellcycle):是指细胞从上一次分裂结束开始到下一次分裂结束为止所经历的整个过程。 细胞周期的划分 ?一个细胞周期可以分为间期(interphase)和分裂期(metaphaseM期)两个大阶段。 ?间期可以分为G1期、S期和G2期。 ?细胞周期各期主要特征 ?G1期:从有丝分裂完成到DNA复制之前的一段时期。特点:大量RNA和蛋白质合成,蛋白质磷酸化,细胞膜转运功能加强。 ?G1期的后期细胞的自身监控机制可以根据内外环境是否适于细胞增殖而决定是否进入下一阶段S期。这一特定时期在酵母细胞中称为起始点,哺乳动物细胞中称为限制点(R点)。 ?如环境适于细胞增殖则进入S期,不适合细胞增殖则细胞可能延迟通过G1期或者进入休眠状态。进入休眠状态的细胞蛋白质合成急剧下降(仅有正常的20%),这期细胞。 种细胞称为G

如何在组织中检测细胞增殖,分化和凋亡

在组织中检测细胞增殖、分化与凋亡得方法 一、检测细胞增殖得方法 (1)直接方法:通过直接测定进行分裂得细胞来评价细胞得增殖能力 1、胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)渗入法 胸腺嘧啶核苷(TdR)就是DNA特有得碱基,也就是DNA合成得必需物质、用同位素3H 标记TdR即3H—TdR作为DNA合成得前体能掺入DAN合成代谢过程,通过测定细胞得放射性强度,可以反映细胞DAN得代谢及细胞增殖情况。但就是具有放射性、 2、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)检测法 羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)就是一种可穿透细胞膜得荧光染料,具有与细胞特异性结合得琥珀酰亚胺脂基团与具有非酶促水解作用得羟基荧光素二醋酸盐基团,使CFSE成为一种良好得细胞标记物。CFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内得氨基结合偶联到细胞蛋白质上。当细胞分裂时,CFsE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中,因此其荧光强度就是亲代细胞得一半。这样,在一个增殖得细胞群中,各连续代细胞得荧光强度呈对递减,利用流式细胞仪在488nm激发光与荧光检测通道可对其进行分析、 3、Brdu检测法 Brdu中文全名5—溴脱氧尿嘧啶核苷,为胸腺嘧啶得衍生物,可代替胸腺嘧啶在DNA合成期(S期),活体注射或细胞培养加入,而后利用抗Brdu单克隆抗体,ICC染色,显示增殖细胞。同时结合其它细胞标记物,双重染色,可判断增殖细胞得种类,增殖速度,对研究细胞动力学有重要意义 4、增殖标志检测 有些抗原只存在于增殖细胞中,而非增值细胞缺乏这些抗原,您也可以通过特异性得单抗来对细胞增殖进行检测、例如,在人体细胞中,Ki—67抗体识别同名蛋白,在细胞周期S期、G2期与M期表达,而在G0期与G1 期(非增殖期)不表达、用针对Ki-67蛋白得单抗就可以检测细胞得增值情况、由于需要组织切片,这种方法无法进行高通量分析。不过这一方法颇受癌症研究者们得青睐,因为它能够用来检测体内肿瘤细胞得增殖。其她普遍使用得细胞增殖或细胞周期调控标志还包括,增殖细胞核抗原PCNA、拓扑异构酶IIB与磷酸化组蛋白H3。 (2)间接方法:通过检测样品中健康细胞得数目来评价细胞得增殖能力 1、MTT检测法 MTT检测法主要反映细胞得能量代谢,就是检测细胞增殖活力得一种简便准确得方法,其原理就是在活细胞生长与增殖过程中,线粒体内得脱氢酶可将黄色得MTT分解成兰紫色得甲(Formazan),生成得甲量得多少与细胞得数量与细胞得活力成正比。 2、ATP检测 细胞内得ATP含量受到了严格调控,检测ATP也可以得到细胞增殖得信息。死亡细胞或即将死亡得细胞几乎不含ATP,在细胞溶解物或提取物中测得得ATP浓度与细胞数之间存在严格得线性关系。利用荧光素酶luciferase及其底物荧光素luciferin得ATP检测以生物发光为基础,能够为您提供非常灵敏得结果。如果有ATP存在荧光素酶就会发光,而且其发光强度与ATP浓度成正比,用能读取发光信号得光度计与酶标仪都可以方便得进行检测。这种方法非常适用于高通量细胞增殖检测与筛选。 二、检测细胞分化得方法 1、流式鉴定细胞表面标志,以判断细胞就是否分化 2、观察细胞形态,与已分化得细胞进行对比 3、分化诱导评估其分化能力 三、检测细胞凋亡得方法 (1)形态学检测

细胞增殖、衰老、分化和癌变知识点

第二章细胞的增殖和分化 1、(了解)细胞周期 定义:连续分裂的细胞从一次分裂结束到下次分裂结束所经历的整个过程。 不同生物或同一生物不同种类的细胞,细胞周期长短不一。 2、(理解)动、植物细胞有丝分裂的过程、各时期分裂图 3、(理解)动、植物细胞有丝分裂异同及意义

细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。细胞有丝分裂的重要意义(特征),是将亲代细胞的染色体经过复制以后,精确地平均分配到两个子细胞中去,因而在生物的亲代和子代间保持了遗传性状的稳定性,对生物的遗传具重要意义。 4、(理解)“观察细胞的有丝分裂:目的要求、材料用具、方法步骤、实验现象和结果、讨论 5、(理解)“制作并观察植物细胞有丝分裂的临时装片”:目的要求、材料用具、方法步骤、实验现象和结果、讨论(见课本) 6、(理解)细胞分化的概念和生物学意义 特点:分化是一种持久的、稳定的渐变过程。 细胞分化的意义:一般多细胞生物体的发育起点是一个细胞(受精卵),细胞的分裂只能繁殖出许多相同的细胞,只有经过细胞分化才能形成胚胎、幼体,并发育成成体,细胞分化是生物个体发育的基础。细胞分化使多细胞生物体中的细胞趋向专门化,有利于提高各种生理功能的效率。 细胞分化的实例:如根尖的分生区细胞不断分裂、分化,形成成熟区的输导组织细胞、薄壁组织细胞、根毛细胞等;胚珠发育成种子,子房发育成果实;受精卵发育成蝌蚪,再发育成青蛙;骨髓造血;皮肤再生等都包涵着细胞的分化。 细胞分化过程:细胞通过有丝分裂数量越来越多,这些细胞又逐渐向不同个方向变化 定义:在个体发育中,由一个或一种细胞增殖产生的后代,在形态,结构和生理功能上发生稳定性差异的过程。 实质:基因选择性表达的结果 7、(了解)癌细胞的主要特征 (1)能够无限增殖。(2)癌细胞的形态结构发生了变化。(3)癌细胞的表面也发生了变化。癌细胞表面的糖蛋白减少, 细胞彼此之间黏着性减小,导致在有机体内容易分散和转移。8、(理解)细胞发生癌变的原因 (1)内因:人体细胞内有原癌基因和抑癌基因 (2)外因:①物理致癌因子;②化学致癌因子;③病毒致癌因子。 恶性肿瘤的防治:远离致癌因子。做到早发现早治疗 9、(理解)细胞的全能性 (1)概念:已经分化的细胞仍然具有发育成完整个体的潜能 (2)体细胞具有全能性的原因 由于体细胞一般是通过有丝分裂增殖而来的,一般已分化的细胞都有一整套和受精卵相同的DNA分子,因此,分化的细胞具有发育成完整新个体的潜能。 (3)全能性大小:受精卵>生殖细胞>体细胞 (4)植物细胞全能性高度分化的植物细胞仍然具有全能性。

原核&真核表达载体构建

原核、真核表达载体构建 真核表达载体和原核表达载体的区别:主要是因为原核和真核表达系统所需的表达元件不同。 比如说启动子,终止子在两种表达系统中是不一样的。 带有真核表达元件的是真核载体,能在真核生物内表达; 带有原核表达元件的是原核载体,能在原核生物内表达。两者都具有的为穿梭载体。 ㈠原核表达载体指:能携带插入的外源核酸序列进入原核细胞中进行复制的载体。 原核表达载体调控原件 1.启动子 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列,它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子,基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子,因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成,对mRNA的合成极为重要。在转录起始点上游5~10 bp处,有一段由6~8个碱基组成,富含A和T的区域,称为Pribnow 盒,又名TATA 盒或-10区。来源不同的启动子,Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游35 bp 处,有一段由10 bp组成的区域,称为-35区。转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。-35区与RNA聚合酶s亚基结合,-10区与RNA聚合酶的核心酶结合,在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链,RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键,以后在RNA聚合酶作用下向前推进,形成新生的RNA 链。原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。 2. SD序列 1974年Shine和Dalgarno首先发现,在mRNA上有核糖体的结合位点,它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3~10 bp处的由3~9 bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸,刚好与16S rRNA 3¢末端的富含嘧啶的序列互补,是核糖体RNA的识别与结合位点。以后将此序列命名为Shine-Dalgarno序列,简称SD序列。它与起始密码子AUG之间的距离是影响mRNA转录、翻译成蛋白的重要因素之一,某些蛋白质与SD序列结合也会影响mRNA与核糖体的结合,从而影响蛋白质的翻译。另外,真核基因的第二个密码子必须紧接在ATG 之后,才能产生一个完整的蛋白质。 3.终止子 在一个基因的3¢末端或是一个操纵子的3'末端往往有特定的核苷酸序列,且具有终止转录功能,这一序列称之为转录终止子,简称终止子(terminator)。转录终止过程包括:RNA聚合酶停在DNA模板上不再前进,RNA的延伸也停止在终止信号上,完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来。对RNA聚合酶起

肿瘤细胞凋亡的关系

第10卷 第1期中 华 男 科 学 Vol.10 No.1 2004年1月 National Journal of Andrology Jan.2004 ?论著? survivin 蛋白在前列腺癌中的表达及其与 肿瘤细胞凋亡的关系 高吴阳1,胡传义1,易慕华2 (三峡大学仁和医院,1.泌尿外科,2.病理科,湖北宜昌443001) 摘要: 目的:探讨新的凋亡基因survivin 蛋白在前列腺癌(PCa )的表达及其与肿瘤细胞凋亡的关系。 方法:采用免疫组化SP 法和DNA 原位未端标记T UNE L 法分别测定42例PCa 组织及10正常前列腺(NP )组织中survivin 蛋白的表达和细胞凋亡。 结果:survivin 蛋白在PCa 中的阳性表达为80.59%,与病理分级、临床分期和淋巴结转移密切相关(P <0.05),而NP 中无阳性表达;PCa 组织及NP 组织中细胞凋亡指数(AI )分别为3.03±1.33、1.07±0.77,其差异有显著意义(P <0.05);survivin 蛋白的表达与细胞AI 呈负相关(r =-0.679,P <0.001)。 结论:survivin 蛋白的异常表达而引起的细胞凋亡抑制,在PCa 的发生、发展中起一定的作用;联合检测survivin 蛋白和AI ,有助于对肿瘤细胞的分化程度作出正确评价,以指导临床治疗及估计预后。关键词:survivin 蛋白;凋亡;前列腺癌;免疫组化 中图分类号:Q255;R737.25 文献标识码:A 文章编号:100923591(2004)0120012203 Expression of survivin Protein in Prostatic Carcinoma Tissues and Its Correlation with Apoptosis of Cancer Cells G ao Wuyang ,Hu Chuanyi ,Y i Muhua Department o f Urology (Gao WY ,Hu CY ),Department o f Pathology (Yi MH ),Rehe Hospital ,Three Gorges Univer sity ,Yichang ,Hubei 430031,China Correspondence to :Gao Wuyang Abstract : Objective :T o investigate the expression of survivin protein in the tissues of prostatic carcinoma and its correlation with apoptosis of cancer cells. Methods :Expression of survivin protein and apoptosis index (AI )were detected by immunohistochemical and terminal de 2oxynucleotidyl transterase 2mediated dUTP biotin nich end labeling (T UNE L )technique in the tissues of 42cases of prostatic carcinima (PCa )and 10cases of normal prostate (NP ). Results :Survivin prosteins were expressed in 34of the 42(80.59%)cases of PCa.The positive rate of survivin was strongly ass ociated with pathological grades ,clinical stages and lymphmetastasis in PCa (P <0.05).In contrast ,NP did not express survivin.Survivin protein expressioin was negatively correlated with AI in PCa (r =-0.679,P <0.001). Conclusions :Apop 2tosis inhibition by survivin may participate in the onset and progression of PCa ,and the detection of survivin protein and AI in PCa may help to evaluate the degree of cell diferentiation ,decide therapeutic strategies and estimate prognosis. Natl J Androl ,2004,10(1):12214K ey w ords :survivin protein ;apoptosis ;prostatic carcinoma ;immunohistochemistry 前列腺癌(prostatic carcinoma ,PCa )是男性泌尿生殖系肿瘤中最重要的一种,其病因和发病机制尚 ?21?收稿日期:2003207215;修回日期:2003210208 作者简介:高吴阳(19622),男,湖北宜昌市人,副主任医师,本科,从事泌尿男科学专业。通讯作者:高吴阳

细胞的增殖与分化

细胞的增殖与分化集团文件发布号:(9816-UATWW-MWUB-WUNN-INNUL-DQQTY-

细胞增殖与分化 1.什么是细胞周期 指连续分裂的细胞从上一次分裂结束到下一次分裂结束所经历的整个过程。由分裂间期和分裂期组成。间期历时长,在前,分为G1期(主要是蛋白质合成,核糖体增生)S期(主要发生DNA的复制)和G2期(主要发生有丝分裂所必需的一些蛋白质的合成);分裂期(M期)在后,历时较短,人为分为前中后末四个时期。 2.有丝分裂的过程、特征和意义分别是什么 有丝分裂的过程及特征:

有丝分裂的意义:亲代细胞内的染色体经过复制后,平均分配到两个子细胞中,从而使细胞的亲代与子代之间保持遗传性抓观念的稳定性3.动植物细胞有丝分裂的主要不同 4.核DNA、染色体、每条染色体上DNA含量变化曲线 5.什么是细胞分化本质特点意义 细胞分化:细胞的后代在形态结构、功能上发生差异的过程。 本质:基因在特定时间和空间条件下有选择的表达(同一个体的不同细胞遗传物质是相同的) 特点:持久性;稳定性;普遍性 意义:使多细胞生物体的细胞趋于专门化,有利于提高各种生理功能的功率,生物个体发育就是通过细胞分化来实现。 6.细胞的全能性含义动植物举例比较与分化程度的关系同一生物体内全能性的比较 细胞的全能性:已分化的细胞仍具有发育成完整个体的能力 植物细胞的全能性:eg:组织培养脱分化再分化

(外植体——愈伤组织——胚状体——完整植株) 动物细胞核的全能性:eg:核移植 与分化程度的关系:细胞全能性高低与分化程度负相关,分化程度越大,全能性越低 同一生物体内全能性比较:受精卵>生殖细胞>体细胞 7.细胞的凋亡与衰老 细胞凋亡:原因:细胞凋亡是一种编程性细胞死亡,是由某种基因引发的,属于正常生命现象。例如:蝌蚪的尾和鳃的消失,人神经细胞数量的调整。 细胞衰老特征:(1)细胞内多种酶的活性降低;(2)细胞呼吸变慢 (3)随细胞年龄增大,线粒体数量减少,体积增大 (4)细胞核体积增大、核膜不断向内折叠等 8.细胞的癌变 含义:由于受到致癌因素的作用,变成不受控制而无限增殖的恶性增殖细胞 特征:(1)有无限增殖的能力(2)能在体内转移,与正常细胞相比,癌细胞表面的粘连蛋白很少或缺失 致癌因素:各种射线,许多种无机或有机化合物,许多种病毒等9.对比细胞的凋亡、衰老与癌变

细胞凋亡与肿瘤

细胞凋亡与肿瘤 巴桑卓玛 (西藏大学医学院基础医学研究所) 摘 要 细胞凋亡是一种进化保守的细胞死亡形式,不仅在正常的生理状态具有重要作用,而且与多种疾病的发生发展密切相关。近年来研究认为,细胞凋亡异常可能与肿瘤发生有关。凋亡调控基因已被看作是一类新的肿瘤发生相关基因。肿瘤的发生,是由于细胞增殖与细胞凋亡之间的平衡失调的结果,细胞凋亡在肿瘤生长过程中起负调控作用,因此研究抑制多种肿瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡而对正常细胞影响不大是肿瘤治疗的新思路。 关键词 细胞凋亡 诱导 治疗 肿瘤 多细胞机体,包括人,均存在着细胞增殖与死亡的平衡,以维持机体的稳态,二者是一个矛盾的两个方面,此矛盾的运动发展推动着机体的生、老、病、死。传统的肿瘤研究者关注的首先是细胞的增殖。肿瘤细胞是永生性细胞,如何抑制肿瘤细胞的无限增殖能力,是他们首先考虑的问题。然而,机体还存在另一普遍现象,即死亡。细胞的死亡有两种形式,一种是病理性死亡,称为坏死(necrosis)。它是由于局部缺血、高热、理化因素及微生物的侵袭所致的细胞急速死亡。其重要的特点是细胞肿胀、溶解、释放出裂解产物,使周围组织产生炎症反应。另一种是生理性死亡———凋亡(apoptosis)。 1 细胞凋亡与一般的死亡有很大的不同,主要表现以下几个方面 形态学特征:细胞凋亡是细胞在生物体发育过程中,在一定诱导条件下接受指令而发生的程序化事件,是导致最终自我消亡的生命活动。发生时首先是染色质的凝集,嗜碱性染色增强,然后细胞核崩解,此时线粒体保持形态正常,最后细胞体积缩小,一部分细胞质和核碎片进入由膜包被的程序死亡小体,它们从细胞表面出芽脱落,并被组织专职巨噬细胞、上皮细胞吞噬。由于细胞内容物不泄漏,因而没有炎症反应。 生化特征:染色质降解,核小体间连接DNA部位被降解,产生寡聚核小体DNA 片段,即180-200bp整数倍的不同长度的DNA片断。 细胞凋亡的化学信号:在细胞程序死亡时出现快速持续的Ca2+浓度上升。如在胞质钙离子载体tributyrin和抗-CD3抗体诱导的胸腺细胞凋亡中就发现有钙离子浓度升高的现象。研究发现Ca2+增加与A TP一起作用于染色质,使原来折叠的很紧的染色质变松散,露出亲水部分,以便脱氧核糖核酸酶(Dnase)水解。Danson (1993)发现Ca2+可以参与Ca-calmokulin dependent phospatase作用,产生凋亡。Wornonicz提出Ca2+可以直接作用于核内转录因子引起凋亡。另外Ca2+还可活化

抗肿瘤药物对细胞增殖及凋亡的影响

抗肿瘤药物对细胞增殖及凋亡的影响 【摘要】 本实验室自主创新实验。本实验主要有药物对细胞对细胞增长速率的影响,药物对细胞周期时相分布及细胞凋亡的影响和细胞凋亡的形态学观察等三个内容。通过本次实验我们了解了细胞生物学研究的基本思路和理解设计实验的基本原则的同时通过实际操作,理解了细胞增值与凋亡在有机体正常生命活动中的作用及意义,掌握细胞增值与凋亡分析的基本方法。 一、药物对细胞对细胞增长速率的影响 【实验原理】 1.细胞生长曲线:一般细胞传代之后,经过短暂的悬浮然后贴壁,随后度过潜伏期进入指数生长期。在细胞到达包和密度后,停止生长,进入平顶期,然后退化衰亡。典型的生长曲线可分为潜伏期,指数增长期,稳定期和衰退期。以存活细胞数对培养时间作图,及得生长曲线,生长曲线常用与测定药物等外来因素对细胞生长的影响。 2.利用MTT比色法测定药物等外来因素对细胞生长的影响: 黄色的MTT能被活细胞线粒体脱氢酶还原成不溶鱼水的蓝紫色产物——formazan,后者被溶解所呈现的色度反映出活生活细胞的代谢水瓶,死亡细胞则没有脱氢酶活性。Formazan产生的量与活细胞数成正比。 【实验步骤】 1.溶液的配制: ①MTT母液 ②裂解液 ③药物与对照组:A(对照),B,C,D 实验步骤: 2.细胞制备: 取对数生长期的细胞,用胰酶消化计数,配制悬液浓度为2.5~3×10 个/ml。

3.细胞的接种(96孔板): 设定调零组,对照组,假药组(8个平衡孔),每孔加入200ul细胞悬液。 4.加药处理:细胞贴壁后,弃培养基,换等体积的药液。 5.对细胞生长情况进行测定: ①配制MTT使用液:无血清的5ml培养基中加入600ulMTT母液避光混匀。②待测细胞孔,弃去培养基,每孔加100ulMTT使用液。没有细胞的孔同样重复上述操作,作为调零孔,继续培养。 6.第二天,每孔加入100ul裂解液,调零孔中也加 7.下午取出孔板,用移液器充分混匀,每孔取出150ul样品,转移到检测板中。用考热的针头挑破孔中的气泡,用酶标仪读取OD值。 8.计算每种药物的生长抑制率(细胞生长抑制率=(1—药物组OD值/细胞对照组OD值)×100%) 二、药物对细胞周期时相分布及细胞凋亡的影响 【实验原理】 流式细胞仪(Flow Cytometer):是集激 光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术、细胞荧光化学技术以及单克隆抗体技术为一体的高科技细胞分析仪。流式细胞术(Flow Cytometry,FCM):利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的细胞或亚细胞结构进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。 2.PI荧光探针的特性: PI(碘化丙啶)为定量细胞化学的荧光染料,能插入双链DNA和RNA的碱基对之间,每隔5个碱基插入一个PI分子。如样品经RNA酶消化后,样品中的

真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体

真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体 标签:真核细胞酵母表达系统细胞表达载体真核表达系统昆虫表达系统动物表达系统 摘要: 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统,由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷,人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统,由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷,人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 自上世纪70年代基因工程技术诞生以来,基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。并随着人类基因组计划实施的进行,在技术方法上得到了很大发展,时至今日已取得令人瞩目的成就。随着人类基因组计划的完成,越来越多的基因被发现,其中多数基因功能不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。 在各种表达系统中,最早被采用进行研究的是原核表达系统,这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌),通过iptg诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物,而且所需的成本相对比较低廉。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点:如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控,有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用,过量表达可能导致非生理反应,目的蛋白常以包涵体形式表达,导致产物纯化困难;而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善,表达产物的生物活性较低。 为克服上述不足,许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域,其优点是: ①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计,而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性,故不存在基因的非特异性激活或抑制; ②能诱导基因高效表达,可达105倍,为其他系统所不及; ③能严格调控基因表达,即不仅可控制基因表达的“开关”,还可人为地调控基因表达量。 因此,利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前,基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。 1.酵母表达系统 最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母,后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等,其中,甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha,Candida Bodini,Pichia Pastris3种。以Pichia Pastoris应用最多。

真核表达载体

真核细胞常见表达载体 1、pCMVp-NEO-BAN载体 特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对,主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成,在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是,由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在,转染细胞后,用G418筛选,可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。 2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白,在PCMV启动子驱动下,在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成,能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外,载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制,而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点,将外源基因扦入这些位点,将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。 3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因,在PCMV启动子驱动下,在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成,能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外,载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制,而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白,该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白,因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 4、pSV2表达载体 特点:该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的,克隆位点为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因,故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。5、CMV4 表达载体 特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动,多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是,该表达载体不含有neo基因,转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。 其他常用克隆Vector: pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25 ug pUC19 DNA 25 ug

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