Western电泳中样品定量的上样技巧

W estern电泳中样品定量的上样技巧

如何保持上样量一致且所加体积一致？

首先，按以往计算出蛋白浓度标准曲线，各样品在A578的平均值，浓度，终浓度例如：

上面各值的计算方法：

标准曲线：选择插入-图表-散点图，作出图表后右击图中的散点，选择添加趋势线，

在第三选项卡选择“显示公式”和“显示R平方值”

计算平均值，输入“=average（”再用鼠标点你所需计算的数值。

计算浓度，将平均值代入求出的标准曲线的x，y即是浓度

终浓度：由于本实验是将样品蛋白稀释20倍（即共80ul的体系里面加入2ul样品，78ul超纯水，蛋白是用酶标仪测的，样品重复3次，每孔20ul加入96孔板，然后每孔再加入100ul Sigma BCA蛋白浓度测试试剂盒按A液：B液49:1加入混匀，5%CO2培养箱，37度孵育30min，然后设置578nm波长，单孔空白A12加超纯水做对照，进行测量）

按照上述步骤：终浓度计算为“=浓度*稀释倍数*1.2”，其中1.2是加入6Xloading buffer扣除的体积。

下面重点介绍如何保持所有上样量相等且上演体积相等

1、将终浓度*样品细胞所加裂解液的体积，得出各样品的总的物质的量n，本实验是用100ul

的裂解液来消化细胞的

2、选择n最小的作为标准浓度，用来计算其他样品所需取的体积，目的是保持各样品总的

物质的量一直，因为木桶效应，一批样品中能用的是取决于最少样品的量，其他样品量多也不一定能用上。

计算“最小的n/ 需计算样品的终浓度”

3、计算还需加入裂解液的体积，因为最小n的样品的体积是100ul，所以其他样品的体积

也需要加入裂解液步加到100ul，则计算“=最小n的样品的总体积-该样品所需取的体积”

4、具体操作过程：从非最小n的样品管里按“样品所需体积”吸到另一个新的500ul的EP

管里，按“还需加裂解液的体积”加入裂解液（只加RIPA），黄枪头吹打均匀。

5、按照“总体积例如100ul/(6-1)”加入6x loading buffer，吹打均匀，放入沸水中煮5min，

再用离心机低速3000rpm离心5min。用于上样或放于-20度冰箱保存。

例如：

生物样品定量分析方法验证指导原则

9012 生物样品定量分析方法验证指导原则
1. 范围
准确测定生物基质（如全血、血清、血浆、尿）中的药物浓度，对于药物和制剂研发非常重要。这些数据可被用于支持药品的安全性和有效性，或根据毒动学、药动学和生物等效性试验的结果做出关键性决定。因此，必须完整地验证和记录应用的生物分析方法，以获得可靠的结果。
本指导原则提供生物分析方法验证的要求，也涉及非临床或临床试验样品实际分析的基本要求，以及何时可以使用部分验证或交叉验证，来替代完整验证。
生物样品定量分析方法验证和试验样品分析应符合本指导原则的技术要求。应该在相应的生物样品分析中遵守 GLP 原则或 GCP 原则。
2. 生物分析方法验证
2.1 分析方法的完整验证
分析方法验证的主要目的是，证明特定方法对于测定在某种生物基质中分析物浓度的可靠性。此外，方法验证应采用与试验样品相同的抗凝剂。一般应对每个物种和每种基质进行完整验证。当难于获得相同的基质时，可以采用适当基质替代，但要说明理由。
一个生物分析方法的主要特征包括：选择性、定量下限、响应函数和校正范围（标准曲线性能）、准确度、精密度、基质效应、分析物在生物基质以及溶液中储存和处理全过程中的稳定性。
有时可能需要测定多个分析物。这可能涉及两种不同的药物，也可能涉及一个母体药物及其代谢物，或一个药物的对映体或异构体。在这些情况下，验证和分析的原则适用于所有涉及的分析物。
对照标准物质在方法验证中，含有分析物对照标准物质的溶液将被加入到空白生物基质中。此外，色谱方法通常使用适当的内标。应该从可追溯的来源获得对照标准物质。应该科学论证对照标准物质的适用性。分析证书应该确认对照标准物质的纯度，并提供储存条件、失效日期和批号。对于内标，只要能证明其适用性即可，例如显示该物质本身或其相关的任何杂质不产生干扰。当在生物分析方法中使用质谱检测时，推荐尽可能使用稳定同位素标记的内标。它们必须具有足够高的同位素纯度，并且不发生同位素交换反应，以避免结果的偏差。
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细胞总蛋白的制备, SDS-PAGE,Western Blot

医学生物学研究技术与实验实验报告实验名称：细胞总蛋白的制备,SDS-PAGE，Western Blot 一、实验目的 1.掌握SDS直接裂解细胞法提取蛋白质 2. 掌握Lowry法测定蛋白质浓度的原理 3. 掌握SDS-PAGE分离蛋白质的原理和技术 4. 掌握半干转移的操作和Western Blot 的原理和技术二、实验原理 1.蛋白质提取常见裂解方法极其原理。蛋白质的抽提是指破碎过程中，将生物材料在水，缓冲液或稀盐溶液等适当溶剂中浸泡，使胞内的蛋白质等内容物释放到溶剂中。血浆，消化液和分泌液等体液中可溶性蛋白质，可不经抽提，直接进行分离。细胞内一般蛋白质的抽提，应先将细胞膜或细胞壁破碎，然后用适当溶剂将蛋白质溶出，再用离心法除去不溶物，得到出抽提液。膜蛋白的抽提比较复杂。膜蛋白按其所在位置分为外周蛋白和固有蛋白。外周蛋白通过次级键和膜外侧脂质的性头部鳌和在一起，应选则适当离子强度及PH的缓冲液，其中要好友EDTA，将其抽出。固有蛋白嵌和在膜脂质双层中，通过疏水键于膜内侧脂质层的疏

水性尾部结合。在抽提固有蛋白时，要减弱器与膜脂的疏水性结合，又要使其保持部分疏水基暴露在外的天然状态，这一过程叫增溶作用。较为理想的增溶剂是去垢剂。目前用的去垢剂分为阴离子型，阳离子型，两性离子型，非离子型。增溶后的膜蛋白抽提剂有较好的均一性，便于进一步纯化。纯化后的膜蛋白，可通过透析法去除去垢剂，进行膜蛋白重组。抽提蛋白质的理想条件是尽可能促进蛋白质在溶剂中溶解，而减弱蛋白水解酶活力，以减少细胞的自溶过程。主要是通过选择适当PH，温度，或溶剂，以及加适当蛋白水解酶抑制剂。常见裂解方法有：1 低渗裂解，2 冻融法，3 Triton100或者NP-40等非离子去污剂（比较温柔），4 脱氧胆酸钠、SDS、Triton100 （强烈），5 上样缓冲液（含SDS）＋细胞沸水浴5 min，6 匀浆器。 2.Lowry法测定蛋白质浓度 1. 蛋白质与碱性铜试剂产生双缩脲反应，形成紫红色蛋白质-铜复合物； 2. 紫红色复合物中的酪氨酸和色氨酸残基还原磷钼酸和磷钨酸，产生深蓝色，呈色强度与蛋白质浓度呈正相关，分光光度计测A750吸光度，做标准曲线 3.SDS-PAGE分离蛋白质 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白分析中最经常使用的一种方法.它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS）及巯基乙醇一起加热，使蛋白变性，多肽链内部及肽键之间的二硫键被还原，肽键被打开，打开的肽键靠疏水作用与SDS结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。不同大小的肽链由于在迁移时受到的阻力不同，在迁移过程中逐渐分开，其相对迁移率与分子量的对数间成线形关系。 4. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入SDS 疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于同工酶的鉴定和提纯。未

汽车抛光技术工艺流程

汽车抛光技术工艺流程抛光操作方法及流程：如果说洗车是车体护理的基础，研磨时漆面翻新的关键，那么抛光应是漆面护理的艺术创作。汽车漆面抛光有三个步骤即研磨、抛光、还原。抛光之所以能产生无比光亮的效果主要是靠研磨，即靠摩擦材料把细微划痕去除，其次是靠车蜡，抛光剂里大多含有增亮成分，可以依靠抛光剂的光泽来弥补漆面的缺陷。抛光原理： 1、表面粗糙，不平：任何一点光线的射入角和折射角不一样，造成表面亮度降低。 2、表面平滑：镜面反射，射入角和反射角一致，可得到最高反射亮度。所以，美容施工一定首先要将漆面整平，才有最佳的表面亮度和保护层。操作方法：用于研磨作业的研磨剂是在随着抛光机和研磨剂摩擦作业进行，由于磨擦起热,使研磨剂中所含的"水"，"溶剂"成分减少，最后研磨剂变成干燥的粉状。研磨的初期阶段，研磨剂起着润滑剂的作用，几乎没有研磨力，研磨剂薄薄地随这着抛光机的转动向外涂抹；研磨溶剂中所含的水分和溶剂为了保护研磨粒子会慢慢的干燥，研磨粒子因为有了水和溶剂保护研磨粒子就会使研磨的时间比较长；水，溶剂由于磨擦发热而被蒸发，含量也减

少，变的不能保护研磨粒子，不能受到保护的研磨粒子渐渐开始破碎，研磨力下降，但是光泽呈现出来了。为了有效的使用这种时间带，为了不让发热而进行作业，如果用过大的力进行研磨就容易起热，研磨剂很就快会完全干燥，不仅研磨剂变的失去作用，而且还会因研磨剂颗粒留下出现伤痕。抛光研磨作业不是用力和快速进行的，而是为了有效的使用研磨剂的切削性来进行。抛光的基础使用方法 1、盘面带有角度的情况抛光机倾斜度比较的大的情况下会使漆面起热快，而且抛光盘的边的部位摩擦力加大，容易研磨坏车漆，也会使抛光盘面的接触漆面面积会变狭窄。 2、移动抛光机的基本方法研磨作业是为了把漆面均匀地进行研磨做为基础，为此，需要想办法"在一定程度上控制抛光所承受的压力"。（1）按动的压力--以抛光机自身的重量为基础，把在平面上的抛光机的自身重量作为基础，不要不需要使用太大的压力，即使在侧面进行抛光作业，也是需要使用与平面同等压力。不要增加或减少压力，这样就不容易因为压力不均匀产生有的部分抛的严重有的部位较轻而产生的光圈或是划痕没有清除。（2）盘面与抛光的角度--避免在局部增加压力抛光是根据盘面的形状使用压力。如果过度地抛光会形成"研磨面不均匀"，"抛光分界线"，"抛光伤痕"等原因，由于局部发热，会

生物等效性实验生物样品处理注意事项(严)知识讲解

生物等效性实验生物样品处理注意事项(严)

生物等效性实验生物样品处理注意事项一、样品采集后的的处理和贮存鉴于生物样本的特点，为了避免样品中被测药物发生分解或产生其他化学变化，取样后最好立即进行分析测定，但实际工作中几乎无法做到，常需将收集到的样品冷藏、冰冻，临用前再融化并放至室温后使用。在样本冷冻贮藏前，需及时进行处理。 1.1血液样本处理注意事项 1.1.1. 在肌肉注射或静脉输含有葡萄糖或电解质(含钾、钠、氯离子)的液体时，建议3小时以后采集静脉血样本进行这些项目的检验，以防止上述检验项目因输液引起的假性升高。 1.1.2保定非麻醉状态的动物时应尽量避免用力挤压动物头颈和胸腹，以免引起血液淤滞，局部组织缺氧，造成血液某些成分的改变，特别是测定乳酸，血液含氧量等指标时。 1.1.3血液中红细胞内外成分有很大差异，溶血可造成红细胞内的物质向细胞外转移，如K+、Mg2＋和某些酶类(LD、AST、ALT、ACP)；另外，溶血还可干扰某些化学项目(TBil、DBil、TC等)的测定，严重影响结果的准确性，血样本应防止溶血。引起溶血的原因有：注射器采血时抽吸力太大；血液与抗凝剂比例失调；混匀样本时过度振荡；注射器或采血容器带水或容器污染；全血放置时间长或突然受冷或受热；注射器中的血沫注入采血容器；真空采血时如未

采满至相应刻度，残存负压造成红细胞破裂；不拔针头直接注入采血容器；样本离心时离心力过大等。为避免溶血，取血时应注意： ①、抽拉注射器时应尽量避免注射器内产生大量真空； ②、添加抗凝剂后的容器在除必要干燥流程后应及时密封； ③、混匀样本时避免用力过度，切勿产生泡沫； ④、避免重复使用注射器、针头、采血管、毛细玻璃管等一次性用品，手术刀片和剪刀等器材取材时尽量洗去残留血液； ⑤、采血时的室温应控制在22℃至25℃，采取的血液容器在需要放入冰盒时，切勿紧贴冰袋，冰水； ⑥、当注射器内因吸入空气产生血沫时，注意弃掉血沫，在将血液注入采血容器时勿将血沫一并注入； ⑦、使用真空采血管需抽取负压时切勿过量； ⑧、将血液注入采血容器时要除去针头，轻柔推入； ⑨、离心带有血细胞的血样时，按照规格设定离心参数； 1.1.4. 正确选择采集管。通常情况下多采用血清为样本(不抗凝)，部分检测项目需注意样本属性为血清或血浆，两者不可替代。一些特殊检验项目需要使用抗凝剂时，应注意选择合适的抗凝剂并注意抗凝剂与血液的比例，以防止样本凝血或红细胞形态的改变；抗凝血样本采集后立即轻轻摇匀至少上下颠倒8次，以防凝血发生。 1.1.5. 多项化验采血顺序：血培养瓶(厌氧瓶优先)→蓝帽管→黑帽管→红/黄帽管→绿帽管→紫帽管→灰帽管→其他。

模具抛光的工艺流程及技巧

模具抛光的工艺流程及技巧抛光在模具制作过程中是很重要的一道工序，也是收官之作，随着塑料制品的日溢广泛应用，对塑料制品的外观品质要求也越来越高，所以塑料模具型腔的表面抛光质量也要相应提高，特别是镜面和高光高亮表面的模具对模具表面粗糙度要求更高，因而对抛光的要求也更高。抛光不仅增加工件的美观，而且能够改善材料表面的耐腐蚀性、耐磨性，还可以方便于后续的注塑加工，如使塑料制品易于脱模，减少生产注塑周期等。目前常用的抛光方法有以下几种：㈠机械抛光机械抛光是靠切削、材料表面塑性变形去掉被抛光后的凸部而得到平滑面的抛光方法，一般使用油石条、羊毛轮、砂纸等，以手工操作为主，特殊零件如回转体表面，可使用转台等辅助工具，表面质量要求高的可采用超精研抛的方法。超精研抛是采用特制的磨具，在含有磨料的研抛液中，紧压在工件被加工表面上，作高速旋转运动。利用该技术可以达到Ra0.008μm的表面粗糙度，是各种抛光方法中最高的。光学镜片模具常采用这种方法。 ⑴机械抛光基本程序要想获得高质量的抛光效果，最重要的是要具备有高质量的油石、砂纸和钻石研磨膏等抛光工具和辅助品。而抛光程序的选择取决于前期加工后的表面状况，如机械加工、电火花加工，磨加工等等。机械抛光的一般过程如下：①粗抛经铣、电火花、磨等工艺后的表面可以选择转速在35 000—40 000 rpm 的旋转表面抛光机或超声波研磨机进行抛光。常用的方法有利用直径Φ3mm、WA # 400的轮子去除白色电火花层。然后是手工油石研磨，条状油石加煤油作为润滑剂或冷却剂。一般的使用顺序为#180 ~ #240 ~ #320 ~ #400 ~ #600 ~ #800 ~ #1000。许多模具制造商为了节约时间而选择从#400开始。 ②半精抛半精抛主要使用砂纸和煤油。砂纸的号数依次为：#400 ~ #600 ~ #800 ~ #1000 ~ #1200 ~ #1500。实际上#1500砂纸只用适于淬硬的模具钢(52HRC以上)，而不适用于预硬钢，因为这样可能会导致预硬钢件表面烧伤。 ③精抛精抛主要使用钻石研磨膏。若用抛光布轮混合钻石研磨粉或研磨膏进行研磨的话，则通常的研磨顺序是9μm(#1800)~ 6μm(#3000)~3μm(#8000)。9μm的钻石研磨膏和抛光布轮可用来去除#1200和#1500号砂纸留下的发状磨痕。接着用粘毡和钻石研磨膏进行抛光，顺序为1μm(#14000)~ 1/2μm(#60000)~1/4μm(#100000)。精度要求在1μm以上(包括1μm)的抛光工艺在模具加工车间中一个清洁的抛光室内即可进行。若进行更加精密的抛光则必需一个绝对洁净的空间。灰尘、烟雾，头皮屑和口水沫都有可能报废数个小时工作后得到的高精密抛光表面。 ⑵机械抛光中的技巧 Ⅰ用砂纸抛光应注意以下几点： ①用砂纸抛光需要利用软的木棒或竹棒。在抛光圆面或球面时，使用软木棒可更好的配合圆面和球面的弧度。而较硬的木条像樱桃木，则更适用于平整表面的抛光。修整木条的末端使其能与钢件表面形状保持吻合，这样可以避免木条(或竹条)的锐角接触钢件表面而造成较深的划痕。 ②当换用不同型号的砂纸时，抛光方向应变换45°~ 90°，这样前一种型号砂纸抛光后留下的条纹阴影即可分辨出来。在换不同型号砂纸之前，必须用100%纯棉花沾取酒精之类的清洁液对抛光表面进行仔细的擦拭，因为一颗很小的沙砾留在表面都会毁坏接下去的整个抛光工作。从砂纸抛光换成钻石研磨膏抛光时，这个清洁过程同样重要。在抛光继续进行之前，所有颗粒和煤油都必须被完全清洁干净。 ③为了避免擦伤和烧伤工件表面，在用#1200和#1500砂纸进行抛光时必须特别小心。因而有必要加载一个轻载荷以及采用两步抛光法对表面进行抛光。用每一种型号的砂纸进行抛光时都应沿两个不同方向进行两次抛光，两个方向之间每次转动45°~ 90°。

9012生物样品定量分析方法验证指导原则

中国药典2015年版 9012生物样品定置分析方法验证指导原则一、范围准确测定生物基质（如全血、血清、血浆、尿）中的药物浓度，对于药物和制剂研发非常重要。这些数据可被用于支持药品的安全性和有效性，或根据毒动学、药动学和生物等效性试验的结果做出关键性决定。因此，必须完整地验证和记录应用的生物分析方法，以获得可靠的结果。本指导原则提供生物分析方法验证的要求，也涉及非临床或临床试验样品实际分析的基本要求，以及何时可以使用部分验证或交叉验证，来替代完整验证。本指导原则二和三主要针对色谱分析方法，四针对配体结合分析方法。生物样品定量分析方法验证和试验样品分析应符合本指导原则的技术要求。应该在相应的生物样品分析中遵守 G L P原则或GC P原则。二、生物分析方法验证 (一）分析方法的完整验证分析方法验证的主要目的是，证明特定方法对于测定在某种生物基质中分析物浓度的可靠性。此外，方法验证应采用与试验样品相同的抗凝剂。一般应对每个新分析方法和新分析物进行完整验证。当难于获得相同的基质时，可以采用适当基质替代，但要说明理由。一个生物分析方法的主要特征包括：选择性、定量下限、响应函数和校正范围（标准曲线性能）、准确度、精密度、基质效应、分析物在生物基质以及溶液中储存和处理全过程中的稳定性。有时可能需要测定多个分析物。这可能涉及两种不同的药物，也可能涉及一个母体药物及其代谢物，或一个药物的对映体或异构体。在这些情况下，验证和分析的原则适用于所有涉及的分析物。对照标准物质在方法验证中，含有分析物对照标准物质的溶液将被加人到空白生物基质中。此外，色谱方法通常使用适当的内标。应该从可追溯的来源获得对照标准物质。应该科学论证对照标准物质的适用性。分析证书应该确认对照标准物质的纯度，并提供储存条件、失效日期和批号。对于内标，只要能证明其适用性即可，例如显示该物质本身或其相关的任何杂质不产生干扰。当在生物分析方法中使用质谱检测时，推荐尽可能使用稳定同位素标记的内标。它们必须具有足够高的同位素纯度，并且不发生同位素交换反应，以避免结果的偏差。 1.选择性该分析方法应该能够区分目标分析物和内标与基质的内源性组分或样品中其他组分。应该使用至少6个受试者的适宜的空白基质来证明选择性（动物空白基质可以不同批次混 9012生物样品定量分析方法验证指导原则合），它们被分别分析并评价干扰。当干扰组分的响应低于分析物定量下限响应的20%,并低于内标响应的5%时，通常即可以接受0 应该考察药物代谢物、经样品预处理生成的分解产物以及可能的同服药物引起干扰的程度。在适当情况下，也应该评价代谢物在分析过程中回复转化为母体分析物的可能性。 2.残留应该在方法建立中考察残留并使之最小。残留可能不影响准确度和精密度。应通过在注射高浓度样品或校正标样后，注射空白样品来估计残留。高浓度样品之后在空白样品中的残留应不超过定量下限的20%，并且不超过内标的5%。如果残留不可避免，应考虑特殊措施，在方法验证时检验并在试验样品分析时应用这些措施，以确保不影响准确度和精密度。这可能包括在高浓度样品后注射空白样品，然后分析下一个试验样品。 3.定量下限定量下限是能够被可靠定量的样品中分析物的最低浓度，具有可接受的准确度和精密度。定量下限是标准曲线的最低点，应适用于预期的浓度和试验目的。 4.标准曲线应该在指定的浓度范围内评价仪器对分析物的响应，获得标准曲线。通过加人已知浓度的分析物（和内标）到空白基质中，制备各浓度的校正标样，其基质应该与目标试验样品基质相同。方法验证中研究的每种分析物和每一分析批，都应该有一条标准曲线。在进行分析方法验证之前，最好应该了解预期的浓度范围。标准曲线范围应该尽量覆盖预期浓度范围，由定量下限和定量上限(校正标样的最髙浓度）来决定。该范围应该足够描述分析物的药动学。应该使用至少6个校正浓度水平，不包括空白样品（不含分析物和内标的处理过的基质样品）和零浓度样品（含内标的处理过的基质〉。每个校正标样可以被多次处理和分析。应该使用简单且足够描述仪器对分析物浓度响应的关系式。空白和零浓度样品结果不应参与计算标准曲线参数。应该提交标准曲线参数，测定校正标样后回算得出的浓度应一并提交。在方法验证中，至少应该评价3条标准曲线。校正标样回算的浓度一般应该在标示值的:t l5%以内，定量下限处应该在±20%内。至少75%校正标样，含最少6个有效浓度，应满足上述标准。如果某个校正标样结果不符合这些标准，应该拒绝这一标样，不含这一标样的标准曲线应被重新评价，包括回归分析^ 最好使用新鲜配制的样品建立标准曲线，但如果有稳定性数据支持，也可以使用预先配制并储存的校正标样。 5.准确度分析方法的准确度描述该方法测得值与分析物标示浓度的接近程度，表示为：（测得值/真实值)x l00?^应采用加人已知 ? 363

省模抛光步骤

随着塑料制品日溢广泛的应用，如日化用品和饮料包装容器等，外观的需要往往要求塑料模具型腔的表面达到镜面抛光的程度。而生产光学镜片、镭射唱片等模具对表面粗糙度要求极高，因而对抛光性的要求也极高。抛光不仅增加工件的美观，而且能够改善材料表面的耐腐蚀性、耐磨性，还可以使模具拥有其它优点，如使塑料制品易于脱模，减少生产注塑周期等。因而抛光在塑料模具制作过程中很重要的一道工序。 1 抛光方法目前常用的抛光方法有以下几种： 1.1 机械抛光机械抛光是靠切削、材料表面塑性变形去掉被抛光后的凸部而得到平滑面的抛光方法，一般使用油石条、羊毛轮、砂纸等，以手工操作为主，特殊零件如回转体表面，可使用转台等辅助工具，表面质量要求高的可采用超精研抛的方法。超精研抛是采用特制的磨具，在含有磨料的研抛液中，紧压在工件被加工表面上，作高速旋转运动。利用该技术可以达到Ra0.008μm的表面粗糙度，是各种抛光方法中最高的。光学镜片模具常采用种方法。 1.2 化学抛光化学抛光是让材料在化学介质中表面微观凸出的部分较凹部分优先溶解，从而得到平滑面。这种方法的主要优点是不需复杂设备，可以抛光形状复杂的工件，可以同时抛光很多工件，效率高。化学抛光的核心问题是抛光液的配制。化学抛光得到的表面粗糙度一般为数10μm。 1.3 电解抛光电解抛光基本原理与化学抛光相同，即靠选择性的溶解材料表面微小凸出部分，使表面光滑。与化学抛光相比，可以消除阴极反应的影响，效果较好。电化学抛光过程分为两步：（1）宏观整平溶解产物向电解液中扩散，材料表面几何粗糙下降，Ra＞1μm。（2）微光平整阳极极化，表面光亮度提高，Ra＜1μm。 1.4 超声波抛光

2015版药典生物样品定量分析方法验证指导原则(草案)

1 生物样品定量分析方法验证指导原则（草案） 1 1. 范围 2 准确测定生物基质（如全血、血清、血浆、尿）中的药物浓度，对于药物和3 制剂研发非常重要。这些数据可被用于支持药品的安全性和有效性，或根据毒动4 学、药动学和生物等效性试验的结果做出关键性决定。因此，必须完整地验证和5 记录应用的生物分析方法，以获得可靠的结果。6 本指导原则提供生物分析方法验证的要求，也涉及非临床或临床试验样品实7 际分析的基本要求，以及何时可以使用部分验证或交叉验证，来替代完整验证。8 生物样品定量分析方法验证和试验样品分析应符合本指导原则的技术要求。9 应该在相应的生物样品分析中遵守GLP原则或GCP原则。10 2. 生物分析方法验证11 2.1 分析方法的完整验证12 分析方法验证的主要目的是，证明特定方法对于测定在某种生物基质中分析13 物浓度的可靠性。此外，方法验证应采用与试验样品相同的抗凝剂。一般应对每14 个物种和每种基质进行完整验证。当难于获得相同的基质时，可以采用适当基质15 替代，但要说明理由。16 一个生物分析方法的主要特征包括：选择性、定量下限、响应函数和校正范17 围（标准曲线性能）、准确度、精密度、基质效应、分析物在生物基质以及溶液18 中储存和处理全过程中的稳定性。19 有时可能需要测定多个分析物。这可能涉及两种不同的药物，也可能涉及一20 个母体药物及其代谢物，或一个药物的对映体或异构体。在这些情况下，验证和21 分析的原则适用于所有涉及的分析物。22 对照标准物质23 在方法验证中，含有分析物对照标准物质的溶液将被加入到空白生物基质24 中。此外，色谱方法通常使用适当的内标。25 应该从可追溯的来源获得对照标准物质。应该科学论证对照标准物质的适用26 性。分析证书应该确认对照标准物质的纯度，并提供储存条件、失效日期和批号。27 对于内标，只要能证明其适用性即可，例如显示该物质本身或其相关的任何杂质28 不产生干扰。 29 当在生物分析方法中使用质谱检测时，推荐尽可能使用稳定同位素标记的内30 标。它们必须具有足够高的同位素纯度，并且不发生同位素交换反应，以避免结31 果的偏差。322

模具抛光的工艺流程及技巧

模具抛光的工艺流程及技巧模具抛光的工艺流程及技巧抛光在模具制作过程中是很重要的一道工序，也是收官之作，随着塑料制品的日溢广泛应用，对塑料制品的外观品质要求也越来越高，所以塑料模具型腔的表面抛光质量也要相应提高，特别是镜面和高光高亮表面的模具对模具表面粗糙度要求更高，因而对抛光的要求也更高。抛光不仅增加工件的美观，而且能够改善材料表面的耐腐蚀性、耐磨性，还可以方便于后续的注塑加工，如使塑料制品易于脱模，减少生产注塑周期等。目前常用的抛光方法有以下几种：㈠机械抛光机械抛光是靠切削、材料表面塑性变形去掉被抛光后的凸部而得到平滑面的抛光方法，一般使用油石条、羊毛轮、砂纸等，以手工操作为主，特殊零件如回转体表面，可使用转台等辅助工具，表面质量要求高的可采用超精研抛的方法。超精研抛是采用特制的磨具，在含有磨料的研抛液中，紧压在工件被加工表面上，作高速旋转运动。利用该技术可以达到Ra0.008μm的表面粗糙度，是各种抛光方法中最高的。光学镜片模具常采用这种方法。 ⑴机械抛光基本程序要想获得高质量的抛光效果，最重要的是要具备有高质量的油石、砂纸和钻石研磨膏等抛光工具和辅助品。而抛光程序的选择取决于前期加工后的表面状况，如机械加工、电火花加工，磨加工等等。机械抛光的一般过程如下： ①粗抛经铣、电火花、磨等工艺后的表面可以选择转速在35 000—40 000 rpm的旋转表面抛光机或超声波研磨机进行抛光。常用的方法有利用直径Φ3mm、WA # 400的轮子去除白色电火花层。然后是手工油石研磨，条状油石加煤油作为润滑剂或冷却剂。一般的使用顺序为#180 ~ #240 ~ #320 ~ #400 ~ #600 ~ #800 ~ #1000。许多模具制造商为了节约时间而选择从#400开始。 ②半精抛半精抛主要使用砂纸和煤油。砂纸的号数依次为：#400 ~ #600 ~ #800 ~ #1000 ~ #1200 ~ #1500。实际上#1500砂纸只用适于淬硬的模具钢(52HRC以上)，而不适用于预硬钢，因为这样可能会导致预硬钢件表面烧伤。 ③精抛精抛主要使用钻石研磨膏。若用抛光布轮混合钻石研磨粉或研磨膏进行研磨的话，则通常的研磨顺序是9μm(#1800)~ 6μ m(#3000)~3μm(#8000)。9μm的钻石研磨膏和抛光布轮可用来去除#1200和#1500号砂纸留下的发状磨痕。接着用粘毡和钻石研磨膏进行抛光，顺序为1μm(#14000)~ 1/2μm(#60000)~1/4μm(#100000)。精度要求在1μm以上(包括1μm)的抛光工艺在模具加工车间中一个清洁的抛光室内即可进行。若进行更加精密的抛光则必需一个绝对洁净的空间。灰尘、烟雾，头皮屑和口水沫都有可能报废数个小时工作后得到的高精密抛光表面。 ⑵机械抛光中的技巧 Ⅰ用砂纸抛光应注意以下几点： ①用砂纸抛光需要利用软的木棒或竹棒。在抛光圆面或球面时，使用软木棒可更好的配合圆面和球面的弧度。而较硬的木条像樱桃木，则更适用于平整表面的抛光。修整木条的末端使其能与钢件表面形状保持吻合，这样可以避免木条(或竹条)的锐角接触钢件表面而造成较深的划痕。 ②当换用不同型号的砂纸时，抛光方向应变换45°~ 90°，这样前一种型号砂纸抛光后留下的条纹阴影即可分辨出来。在换不同型号砂纸之前，必须用100%纯棉花沾取酒精之类的清洁液对抛光表面进行仔细的擦拭，因为一颗很小的沙砾留在表面都会毁坏接下去的整个抛光工作。从砂纸抛光换成钻石研磨膏抛光时，这个清洁过程同样重要。在抛光继续进行之前，所有颗粒和煤油都必须被完全清洁干净。 ③为了避免擦伤和烧伤工件表面，在用#1200和#1500砂纸进行抛光时必须特别小心。因而有必要加载一个轻载荷以及采用两步抛光法对表面进行抛光。用每一种型号的砂纸进行抛光时都应沿两个不同方向进行两次抛光，两个方向之间每次转动45°~ 90°。 Ⅱ钻石研磨抛光应注意以下几点： ①这种抛光必须尽量在较轻的压力下进行特别是抛光预硬钢件和用细研磨膏抛光时。在用#8000研磨膏抛光时，常用载荷为100~200g/cm2，但要保持此载荷的精准度很难做到。为了更容易做到这一点，可以在木条上做一个薄且窄的手柄，比如加一铜片；或者在竹条上切去一部分而使其更加柔软。这样可以帮助控制抛光压力，以确保模具表面压力不会过高。 ②当使用钻石研磨抛光时，不仅是工作表面要求洁净，工作者的双手也必须仔细清洁。 ③每次抛光时间不应过长，时间越短，效果越好。如果抛光过程进行得过长将会造成“橘皮”和“点蚀”。 ④为获得高质量的抛光效果，容易发热的抛光方法和工具都应避免。比如：抛光轮抛光，抛光轮产生的热量会很容易造成“橘皮”。 ⑤当抛光过程停止时，保证工件表面洁净和仔细去除所有研磨剂和润滑剂非常重要，随后应在表面喷淋一层模具防锈涂层。由于机械抛光主要还是靠人工完成，所以抛光技术目前还是影响抛光质量的主要原因。除此之外，还与模具材料、抛光前的表面状况、

蛋白样品制备

双向电泳之样品的制备 2008-04-02 21:58:37| 分类：默认分类|举报|字号订阅一般性原则：样品制备是双向电泳中最为关键的一步，这一步处理的好坏将直接影响2-DE 结果。目前并没有一个通用的制备方法，尽管处理方法是多种多样，但都遵循几个基本的原则： 1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；2）减少对蛋白质的人为修饰； 3）破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。根据这一原则，样品制备需要四种主要的试剂：离液剂(chaotropes),主要包括尿素（Urea）和硫脲（thiourea）；表面活性剂（sufactants），也称去垢剂，早期常使用NP-40、TritonX -100 等非离子去垢剂，近几年较多的改用如CHAPS 与Zwittergent 系列等双性离子去垢剂；还原剂（reducing agents ），最常用的是二硫苏糖醇（DTT），也有用二硫赤藓糖醇（DTE）以及磷酸三丁酯（TBP）等。当然，也可以选择性的加入Tris-base,蛋白酶抑制剂（如EDTA 、PMSF or Protease inhibitor c℃ktails ）以及核酸酶。样品的来源不同，其裂解的缓冲液也各不相同。通过不同试剂的合理组合，以达到对样品蛋白的最大抽提。在对样品蛋白质提取的过程中，必须考虑到去除影响蛋白质可溶性和2DE 重复性的物质，比如核酸、脂、多糖等大分子以及盐类小分子。大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过高会降低等电聚焦的电压，甚至会损坏IPG 胶条；这样都会造成2-DE 的失败。样品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。核酸的去除可采用超声或核酸酶处理，超声处理应控制好条件，并防止产生泡沫；而加入的外源核酸酶则会出现在最终的2D 胶上。脂类和多糖都可以通过超速离心除去。透析可以降低盐浓度，但时间太长；也可以采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。因此，处理方法必须根据不同的样品、所处的状态以及实验目的和要求来进行选择。样品制备程序：

生物样品分析方法验证指导原则- 欧洲

European Medicines Agency 7 Westferry Circus, Canary Wharf, London, E14 4HB, UK 1 2 3 London, 19 November 2009 Doc. Ref: EMEA/CHMP/EWP/192217/2009 COMMITTEE FOR MEDICINAL PRODUCTS FOR HUMAN USE 4 (CHMP) 5 6 DRAFT GUIDELINE ON VALIDATION OF BIOANALYTICAL METHODS 7 8 DRAFT AGREED BY THE EFFICACY WORKING PARTY September 2009 ADOPTION BY CHMP FOR RELEASE FOR CONSULTATION 19 November 2009 END OF CONSULTATION (DEADLINE FOR COMMENTS) 31 May 2010 9 Comments should be provided using this template to EWPSecretariat@emea.europa.eu 10 KEYWORDS CHMP, EMEA, Guideline, validation, bioanalytical method, analyses

GUIDELINE ON VALIDATION OF BIOANALYTICAL METHODS 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 TABLE OF CONTENTS 1.INTRODUCTION (BACKGROUND) (3) 2.SCOPE (3) 3.LEGAL BASIS (3) 4.METHOD VALIDATION (4) 4.1C OMPLETE VALIDATION OF AN ANALYTICAL METHOD (4) 4.1.1Selectivity (4) 4.1.2Carry-over (5) 4.1.3Lower limit of quantitation (5) 4.1.4Calibration curve (5) 4.1.5Accuracy (6) 4.1.6Precision (7) 4.1.7Dilution integrity (7) 4.1.8Matrix effect (7) 4.1.9Stability (8) 4.2P ARTIAL VALIDATION (9) 4.3C ROSS VALIDATION (9) 4.4L IGAND-BINDING ASSAYS (9) 5.ANALYSIS OF STUDY SAMPLES (10) 5.1A NALYTICAL RUN (11) 5.2A CCEPTANCE CRITERIA OF AN ANALYTICAL RUN (11) 5.3C ALIBRATION RANGE (12) 5.4R EANALYSIS OF STUDY SAMPLES (12) 5.5I NTEGRATION (13) 6.INCURRED SAMPLES REANALYSIS (13) 7.STUDY REPORT (13) DEFINITIONS (16)

蛋白质组学样品制备注意事项

蛋白组学样品制备常规流程及注意事项一、细胞, 组织裂解 ●Lysis buffer (SDT, RIPA…)： ThermoFisher提供了针对于各种样品的解缓冲液 ●Detergent: SDS, CHAPS, NP40… (破坏细胞膜，蛋白质变性） ●Reducing agent: DTT… (打开二硫键，使得蛋白质结构更为开放，更易酶解) ●Urea: 增加蛋白质的可溶性，适用于提取全蛋白二、蛋白质抽提三、样品蛋白质含量测定、还原烷基化还原烷基化原理: 蛋白质不能从PAGE胶里被抽提出，而肽段则可以被抽提出，打断蛋白质的二硫键，破坏蛋白质二级结构，是蛋白质结构松散，增加蛋白质酶切效率。四、蛋白水平的预分级或蛋白质免疫沉淀五、蛋白质酶解 i.胶内酶解 (In-gel digestion) ●将考染后的SDS-PAGE切成小块 ●用100mM NH4HCO3/30%ACN 脱色 ●在胶内进行 DTT, IAA ●在NH4HCO3溶液体系中加入酶，在胶内进行酶解 ●用60% ACN/0.1% TFA 从胶中抽提生成的肽段 ii.FASP: Filter aided sample preparation

●采用滤膜装置进行溶液置换（10K, 20K, 30K） ●使用尿素可以更有效的除去溶液体系中的去垢剂（如SDS） ●最后置换至NH4HCO3 or TEAB 溶液体系进行蛋白质酶切（pH 在8.0左右） ●酶解完成后收集滤膜的流穿组分得到肽段原理: 蛋白质不能通过滤膜，而酶解生成的肽段则可以通过。丙酮沉淀是另一种去除去垢剂的方法，从而可进行溶液内酶解。 iii.蛋白酶的选择：最为常用的蛋白酶: Trypsin（保持胰酶处于低温，并且保存在酸性环境中，以防止胰酶自身酶解） ●特异的切断C端为Arg, Lys的肽键（若Arg, Lys后紧跟Proline, 酶切效率降低） ●生成的肽段平均长度为9个氨基酸 ●胰酶酶解生成的肽段至少为2+价，易于离子化其他一些蛋白酶，酶切位点的特异性可在搜库软件中查找。六、肽段水平的预分级或翻译后修饰的富集七、肽段除盐 (非常重要) 蛋白质谱分析对样品的要求： ?无盐：少量挥发性盐不影响（如100mM以下碳酸氢铵）（充分脱盐） ?无聚合物：如PEG（避免使用国产耗材、避免手套等接触样品） ?无表面活性剂：如SDS（前处理过程中避免使用） ?无沉淀或颗粒：（充分离心、过滤）

抛光工艺流程及技巧

抛光工艺流程及技巧 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT

蛋白质制备及含量测定(凯氏定氮法)

实验六蛋白质制备及含量测定—— 微量凯氏（Mirco-Kjeldahl）定氮法一、实验目的要求 1、了解蛋白质提取的一般方法和原理 2、了解蛋白质含量测定的常用方法 3、学习微量凯氏定氮法的原理 4、掌握微量凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化、蒸馏、滴定、含氮量的计算及蛋白质含量的换算等。二、实验原理 1、蛋白质的提取与制备蛋白质的提取与制备方法与生物材料的类型及蛋白质的存在部位有关。如果是胞内蛋白，首先必须要进行细胞破碎。细胞破碎的方法与细胞的类型有关，包括物理破碎（研磨、超声波等）、化学破碎（化学溶剂处理）、酶法破碎等。如果是胞外蛋白，可以根据相应蛋白质的性质进行提取分离纯化。如果待提取的蛋白质是具有生物活性的蛋白质如酶，则在样品处理、提取及分离纯化过程中需注意防止蛋白质的变形失活，如在低温下操作、选择适当的缓冲体系等。 2、蛋白质含量测定蛋白质含量测定的方法很多，如：紫外吸收法、双缩脲法、考马斯亮蓝染色法（Bradford法）、Folin酚法、微量凯氏定氮法等。 3、凯氏定氮生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。其原理如下：（1）消化：有机物与浓硫酸共热，使有机氮全部转化为无机氮——硫酸铵。为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。这一步约需2～3h，视样品的性质而定。天然的含氮有机物（如蛋白质，核酸及氨基酸等）与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水；蛋白质分解，而有机氮则变成氨（无机氮），并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此时程称之为“消化”。但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。甘氨酸的消化过程可表示如下： NH2-CH2 -COOH + 3H2SO4→NH3 + 2CO2↑+ 3SO2↑+ 4H2O 2 NH 3 + H2SO4→(NH4)2 SO4 或2 NH2-CH2 -COOH + 7H2SO4→(NH4)2 SO4 + 4CO2↑+ 6 SO2↑+ 8H2O （2）加碱蒸馏：浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一

抛光工艺流程及技巧

的工艺流程及技巧在制作过程中是很重要的一道工序，随着塑料制品的日溢广泛应用，对塑料制品的外观品质要求也越来越高，所以塑料型腔的表面质量也要相应提高，特别是镜面和高光高亮表面的对表面粗糙度要求更高，因而对的要求也更高。不仅增加工件的美观，而且能够改善表面的耐腐蚀性、耐磨性，还可以方便于后续的注塑加工，如使塑料制品易于脱模，减少生产注塑周期等。目前常用的方法有以下几种：㈠机械机械是靠切削、表面塑性变形去掉被后的凸部而得到平滑面的方法，一般使用油石条、羊毛轮、砂纸等，以手工操作为主，特殊零件如回转体表面，可使用转台等辅助工具，表面质量要求高的可采用超精研抛的方法。超精研抛是采用特制的磨具，在含有磨料的研抛液中，紧压在工件被加工表面上，作高速旋转运动。利用该技术可以达到μm的表面粗糙度，是各种方法中最高的。光学镜片常采用这种方法。 ⑴机械基本程序要想获得高质量的效果，最重要的是要具备有高质量的油石、砂纸和钻石研磨膏等工具和辅助品。而程序的选择取决于前期加工后的表面状况，如机械加工、电火花加工，磨加工等等。机械的一般过程如下： ①粗抛经铣、电火花、磨等工艺后的表面可以选择转速在35 000—40 000 rpm的旋转表面机或超声波研磨机进行。常用的方法有利用直径Φ3mm、WA # 400的轮子去除白色电火花层。然后是手工油石研磨，条状油石加煤油作为润滑剂或冷却剂。一般的使用顺序为#180 ~ #240 ~ #320 ~ #400 ~ #600 ~ #800 ~ #1000。油石抛光方法，这个作业是最重要的高难度作业，根据加工品的不同规格，分别约70度的角位均衡的进行交叉研磨。最理想的往返范围约为40毫米～70毫米。油石作业也会根据加工品的材质而变化。许多制造商为了节约时间而选择从#400开始。 ②半精抛半精抛主要使用砂纸和煤油。油石作业结束后是砂纸作业，砂纸作业时，要注意模仁的圆边、圆角和桔皮的产生。所以油石流程尽量做到最细加工。砂纸抛光的重点。砂纸配合较硬的木棒像油石作业一样约70度角交叉地进行研磨，一面砂纸研磨次数约10次～15次。如果研磨时间过长，砂纸的研磨力会减低，这样就会导致加工面出现不均匀现象（这也是产生橘皮的原因之一）。砂纸作业时一般都采用竹片进行研磨，实际使用材质弹力小的木棒或硬度低的铝棒约45度角进行研磨是最为理想的。研磨面不能使用或者弹性高的材料，不能用45度角研磨的形状可以用锐角。砂纸的号数依次为：#220 ~ #320 ~ #400 ~ #600 ~ #800 ~ #1000 ~ #1200 ~ #1500。实际上#1500砂纸只用适于淬硬的(52HRC 以上)，而不适用于预硬钢，因为这样可能会导致预硬钢件表面烧伤。 ③精抛精抛主要使用钻石研磨膏。若用布轮混合钻石研磨粉或研磨膏进行研磨的话，则通常的研磨顺序是9μm(#1800)~ 6μm(#3000)~3μm(#8000)。9μm的钻石研磨膏和布轮可用来去除#1200和#1500号砂纸留下的发状磨痕。接着用粘毡和钻石研磨膏进行，顺序为1μm(#14000)~ 1/2μm(#60000)~1/4μm(#100000)。精度要求在1μm以上(包括1μm)的工艺在加工车间中一个清洁的室内即可进行。若进行更加精密的则必需一个绝对洁净的空间。灰尘、烟雾，头皮屑和口水沫都有可能报废数个小时工作后得到的高精密表面。 ⑵机械中的技巧 Ⅰ用砂纸应注意以下几点： ①用砂纸需要利用软的木棒或竹棒。在圆面或球面时，使用软木棒可更好的配合圆面和球面的弧度。而较硬的木条像樱桃木，则更适用于平整表面的。修整木条的末端使其能与钢件表面形状保持吻合，这样可以避免木条(或竹条)的锐角接触钢件表面而造成较深的划痕。 ②当换用不同型号的砂纸时，方向应变换45°~ 90°，这样前一种型号砂纸后留下的条纹阴影即可分辨出来。在换不同型号砂纸之前，必须用100%纯棉花沾取酒精之类的清洁液对表面进行仔细的擦拭，因为一颗很小的砾留在表面都会毁坏接下去的整个工作。从砂纸换成钻石研磨膏时，这个清洁过程同样重要。在继续进行之前，所有颗粒和煤油都必须被完全清洁干净。