现代生物技术概论

现代生物技术概论

任课教师：高文

一．绪论

1.人类社会发展的主要推动力是什么？科学技术

2.对人类社会发展起关键作用的科学技术有哪些？即四次技术革命

第1次技术革命（18世纪中叶）以牛顿的经典力学为背景，以纺织机械的革新为起点，以蒸汽机的广泛应用为标志，实现了社会主导技术与社会技术基础的变革。第2次技术革命（19世纪70年代）以钢铁技术、内燃机技术和电力技术发展和应用为主要标志，尤其是电机的研制和电能的应用。

第3次技术革命（20世纪40年代）以原子能技术、电子计算机技术和空间技术为代表的新兴技术的迅速发展掀起了第三次技术革命，而电子计算机技术的产生和发展是第三次技术革命的主要标志。

第4次技术革命（20世纪70年代）主要以信息技术、生物技术、材料与纳米技术、航天技术为标志。

3.生物技术：是以生命科学为基础，结合其它基础学科，采用先进的工程技术手段，按照人类的设想来改造生物体或加工生物原料，从而生产出满足人类需要的产品或达到某种目的。

4. 生物技术与农业

4.1. 植物基因工程育种①培育抗病虫作物②抗逆育种

③抗除草剂育种④品质改良

4.2植物细胞工程①植物次级代谢产物②快速无性繁殖③原生质体融合④花粉、花药和胚的培养⑤遗传转化中的应用⑥种质资源保存

4.3生物农药

4.4动物基因工程育种

4.5动物繁殖新技术①人工受精及精液的冷冻保存②胚胎移植及胚胎的冷冻保存③体外胚胎生产④胚胎分割技术⑤性别控制技术

4.6营养全面的动物饲料

4.7动物生物反应器

5.生物技术与人类健康

A 基因工程疫苗B疾病的诊断C生物制药

6 生物技术与安全性

生物技术，尤其是基因工程技术的出现也引起一场不小的轰动。主要的争论焦点是对人、动物、环境的潜在危害上。对人、动物的潜在危害: A 致病性，B 抗药性，C 食品安全性。对生态环境潜在危害：A 致病性和毒性，B 生存竞争力，C传播扩散能力，D 遗传变异能力，E 遗传转移能力。

转基因作物首个转基因作物------延熟保鲜番茄于1993年在美国批准上市。转基因食品早已悄然进入我们的餐桌。转基因动物的争论热点：A 将转基因动物的器官移植给人类受到伦理学上的异议。 B 将人类基因转入食用动物也是不合适的。 C 将某些宗团体禁止食用的动物转入他们通常食用的动物中，如把猪的基因转入羊，可能会触怒犹太人和穆斯林。 D 将动物基因转入食用植物也引起素食主义者的不满。 E 用含人类基因的生物体作为动物饲料。

生物武器

7.现代高新生物技术的诸要素：高效益、高智力、高投入;高竞争、高风险、高势能

二．现代生物技术概论之植物细胞工程

1.植物组织培养(plant tissue culture)的概念

是指在无菌条件下，把离体的植物器官、组织、细胞、原生质体等材料接种在人工培养基中，使其发育成完整植株的过程。其中，离体的植物器官、组织、细胞和原生质等材料一般称为外植体(explant)。

2.植物组织培养的理论基础

细胞学说(cell theory)一切生物都是由细胞构成的，细胞是生物体的基本结构和功能基本单位，细胞只能由细胞分裂而来。

1902年，德国著名植物生理学家G.Haberlandt提出了植物细胞完能性(cell totipotency)理论。即任何一个拥有完整细胞核的植物细胞都具有形成一个完整植株所必需的全部遗传信息，在特定条件下表达可产生独立的个体。

其实，细胞全能性只是一种可能，要实践它必须满足两个条件：A 必须把细胞从植物体的相应部位分离出来。

B 必须给予它们适当的刺激，尤其是激素的作用。一般情况下，一个已经停止分化的细胞要实现其全能性，需经历脱分化和再分化两个过程。

细胞分化(differentiation)是指使单个细胞形成具有不同功能的组织或者器官的过程。它是外植体经脱分化、再分化形成完整植株的基础。

脱分化(dedifferentiation)，也叫去分化，已经停止分化的细胞、组织、器官在离体培养条件下，逐渐失去其原来的结构和功能而恢复其分生状态，形成无组织结构的细胞团的过程。

再分化(redifferentiation)，由脱分化产生的无组织结构的细胞团在离体培养条件的剌激下重新分化成具有不同结构和功能的细胞、组织、器官的过程，即再分化。

3.培养基

培养基(culture medium)是植物组织培养的物质基础。其成分是植物生长发育所必需的各种物质的来源，主要包括营养元素、植物生长调节剂、碳源、维生素、有机添加物等。

3.1培养基的类型

培养基的种类很多，根据其培养基成分及其浓度特点，将其大致分为四类：

①含盐量较高的培养基：MS培养基、LS、BL、ER、

BM培养基等。目前应用最多的培养基。

②硝酸钾含量较高的培养基：B5、N6、SH培养基。其中B5适合葡萄、豆科、十字花科等培养，N6是单子叶植物花药培养的培养基。

③无机盐中等含量的培养基：包括H、Nitsch、Miller 培养基，适合于花药培养。

④无机盐含量低的培养基：主要有White、WS培养基等，多用于生长根培养。

常用培养基配方(单位：mg/L)

3.2培养基的成分

①大量元素，主要为培养物提供N, P, K, Ca, Mg, S, Cl等物质，它们参与植物的结构、功能、代谢以及生长发育调节等各个方面。其中的N主要有硝态氮NO-3和氨态氮NH+4的形式，并且以NO-3为主，一般使用KNO3、NH4NO3或者Ca(NO3)2。而高浓的NH+4会对培养物有毒害作用，适量的NH+4可以防止因NO-3过多所引起的培养基偏酸。培养基中的磷主要以PO3-4的形式添加，如KH2PO4或者NaH2PO4。钾与植物碳水化合物的合成、转移、运输及物质代谢有密切关系，要求浓度较高，以KCl或KNO3的形式添加。而Ca、Mg、S的浓度不宜过高。

②微量元素，主要有Fe、Mn、Zn、B、Cu、Co、Mo。微量元素大多是生物酶的辅酶，对调节物质代谢十分重要。需求小，但是必需添加。

其中的Fe是叶绿素形成必需的，常以FeSO4·7H2O与Na2-EDTA的螯合物形式添加，否则易出现沉淀。

③有机成分

糖类可作为培养基的碳源，尤其是蔗糖，其遇热易分解，有利于吸收利用，其浓度一般为2-5%。也可调节培养基的渗透压。

维生素对植物生长和分化有促进作用，其用一般为0.1—1.0mg/L。包括维生素B1(盐酸硫胺素)、维生素B6(盐酸吡哆醇)、维生素B5(烟酸)、维生素C(抗坏血酸)等。

肌醇，又叫环己六醇，其能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成，对组织和细胞的繁殖、分化和细胞壁的形成有作用。其使用浓度一般为50—100mg/L。

氨基酸，是蛋白质的成分，可直接被植物细胞吸收利用。主要有甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。其用一般在10—1000mg/L。

④植物生长调节剂

生长素(auxins)，主要用于诱导愈伤组织的形成、根的分化及细胞的分裂和伸长。常用培养基中的生长素类物质有IAA、IBA、NAA、2,4-D、ABT生根粉等。

细胞分裂素(cytokinins)，用于促进细胞分裂和分化，诱导胚状体和不定芽的形成。常用的细胞分裂素有6-BA、2-ip、ZT、KT等。

赤霉素(gibberellins, GA)，其可加速细胞的伸长和打破休眠。常用的赤霉素是GA3。

脱落酸(abscissic acid, ABA)，对体细胞胚的发生和发育有重要作用。由于ABA有促进休眠、抑制生长的作用，也常用二超低温保存中。

⑤培养基的其它成分

凝固剂，对培养材料起支撑固定作用。常见的凝固剂有琼脂、琼脂糖。琼脂从海藻中提取的高分子化合物，本身不提供任何营养。在95℃变为溶胶，在40 ℃左右开始凝固。其用量为6—10g/L。

活性炭，其有抑制褐变、减轻玻璃化、促进生根的作用。用量一般为0.5—3%。

抗生素，主要是防止外植体内生菌造成的污染。常用的抗生素有青霉素、链霉素、土霉素、四环素、氯霉素、利福平、卡那霉素、庆大霉素、头孢等。用量为5—20mg/L。

抗氧化物质，用于抑制外植体的褐变。常用的抗氧化剂有半胱氨酸、维生素C、谷胱甘肽、硫脲、柠檬酸和聚乙烯吡咯烷酮等。

硝酸银，其中的Ag+参与细胞膜上的乙烯受体蛋白对乙烯的竞争来抑制乙烯的活性。在培养基中加适量的AgNO3，能促进愈伤组织的发生或体细胞胚胎的发生。另外，其克服试管苗玻璃化、早衰及落叶等也有明显效果。

⑥PH值，培养基的PH值一般为5.5—6.0，常用5.8。PH超过6.5，培养基过硬；低于5.0又不易凝固。一般用1mol/L NaOH或HCl进行调节。

母液，一般是指培养液的浓缩液，也称贮备液。使用母液可以保证培养基各成分的准确性、配制及使用的方便性，而且便于低温保存，从而显著提高工作效率。

母液一般将培养基配方扩大10倍、20倍、100倍、200倍，甚至更高倍数的浓缩液。

配制母液和培养基时一般使用纯度较高的蒸馏水或去离子水。

母液通常配成大量元素、微量元素、铁盐、植物生长调节物质、有机物等母液。

母液一般于2--4 ℃的冰箱中保存。

配制母液时的注意事项：

A 大量元素和微量元素在配制母液时各物质应分别称量、分别溶解，在充分溶解后边搅拌边混合，混合时一定按先后顺序以避免Ca2+与SO2-4, PO3-4结合发生沉淀。

B 铁盐要单独配制，也是分别称取FeSO4?7H2O和Na2?EDTA?2H2O，分别充分溶解，边搅拌边混合。调整PH值至5.5，定容后转入棕色瓶。

C 有机物母液，主要是维生素和氨基酸，也是分别称量、分别溶解、混合定容。而糖和琼脂用量较大，可随用随取。

D 植物生长调节剂母液，一般母液浓度为1mg/mL或者

0.1mg/mL，因用量较小，可配成50mL或100mL。注意

各生长调节物质应单独配制成母液。

NAA、IBA、IAA等一般用少量的95%乙醇溶解，再用蒸馏水定容；2, 4-D不溶于水，可用少量的0.1mol/L的NaOH溶解，再用蒸馏水定容；KT、6-BA要先用少量1mol/L HCl，TDZ用0.1mol/L NaOH溶解，ZT用少量95%乙醇溶解，GA3用少量95%乙醇溶解，ABA用少量95%乙醇或甲醇溶解，多胺易溶于水，多效唑可用少量甲醇或丙酮溶解，油菜素内酯用少量甲醇或乙醇溶解。

E 每种母液配制完成，不要忘记贴上标签，注明配制日期及母液类型。

3.4培养基的配制及注意事项

①准备好称量用的器具，如量筒、烧杯、移液管、移液器、玻璃棒、搪瓷锅、电炉或电磁炉、分装器等。按培养基配方及所要配制的数量计算好各成分的分量，取出母液并按顺序摆好。

②在可加热容器内加所配培养基数量1/3体积的蒸馏水，按量加入琼脂或琼脂粉，按计算好的母液添加量分别依次加入大量元素、微量元素、铁盐、有机物、其它物质，最后加入适量蔗糖搅拌均匀。生长调节剂必须在高温高压灭菌后再加入。

③加蒸馏水定容，搅拌均匀。并做好标记，以防加热时水分蒸发，造成体积减少。

④调整PH值。用1mol/L的NaOH或HCl进行调节，一般为PH5.5—6.0，常用5.8。注意高温高压灭菌后，可使PH值降低0.3—0.5个单位。

⑤分装。一般占培养容器的1/4—1/3。注意不要让培养基粘到培养瓶的内壁和瓶口，容易引起污染。

注意：做好标记，配制日期及培养基种类。

⑥封口。培养基分装好后，一般用硫酸纸、耐高温塑料盖、封口膜等立刻封口，以防污染。

4.组织培养中的灭菌技术

4.1环境灭菌

主要包括准备室、无菌操作室（超净工作台，也称接种室）、培养室等。它们都可采用紫外杀菌、酒精擦拭的方式灭菌。如超净工作台，本身带有空气过滤系统（提前打开工作台吹风）---然后用70—75%的酒精擦拭—再打开紫外灯20—30min。注意紫外线对皮肤和眼睛有伤害。对于污染严重的封闭空间，可采用福尔马林配合高锰酸钾进行熏蒸（福尔马林2mL+高锰酸钾0.2g混合/m3）

4.2培养基灭菌

湿热灭菌，也称高温高压灭菌，即在密闭的高压锅内产生蒸汽，当锅内温度达到121℃，压力为0.105MPa时，保持此温此压15—20min，可很快杀死各种真菌、细菌及高度耐热的芽孢。

注意事项：

①灭菌锅应提前加入适量的水。②锅内待灭菌的培养基应摆放平而不能倾斜。③锅内不要装太满。④锅内的冷气必须排放出去。⑤对灭菌条件要严格控制。⑥灭菌完成后，应缓慢排气降压，等压力表指针回零，才能打开锅盖。

过滤灭菌，利用孔径在0.45um以下，耐高温的纤维素脂滤膜，当溶液通过滤膜时，细菌和真菌的孢子可被过滤去除，但其不能过滤病毒。一般用于不能进行高温高压灭菌的生长调节剂和抗生素类的灭菌。

4.3外植体灭菌

外植体一般都是有活性的，一般采用化学药剂进行表面消毒，特殊情况下使用抗生素。具体的外植体消毒方式如下：

①酒精，一般用70—75%的酒精浸泡外植体10—30s。注意幼嫩的外植体不适合用酒精消毒。②升汞，即0.1—1.0%的HgCl2溶液浸泡6—12min，再用无菌水冲洗5次左右。③次氯酸钠（NaClO），常用浓度为1%，灭菌时间为5—30min ，再用无菌水冲洗5次左右。市售商品名称为“安替福尼”可用其配成2—10%的NaClO 溶液。④漂白粉（Ca(ClO)2），一般使用浓度为5—10%，处理时间为20—30min ，再用无菌水冲洗5次左右。⑤双氧水（H2O2），常用浓度为6—12%，处理5—15min。

4.4用具灭菌

组织培养中常用的器皿或器具有解剖刀、手术剪、镊子、接种环、滤纸、试管、三角瓶、培养皿、培养盒、量筒、量杯、容量瓶、移液管或移液枪枪头、工作服、帽子、口罩等等。它们通常都使用高温高压灭菌。但是用于接种的解剖刀、剪子、镊子、接种环等常用蘸取酒精，然后在酒精灯上烧的方式灭菌，待冷却后使用。

5.外植体

在植物组织培养中，用来进行培养的植物材料常称外植体(explant)，包括植物器官、组织、细胞等。

5.1外植体的种类A 带芽外植体，如茎尖的顶芽、腋芽、根和根茎的萌芽等非常适合离体快速繁殖，尤其是茎尖是最好的以芽生芽的快繁途径。 B 胚，指精卵结合后的各个时期的胚，带有非常幼嫩的分生组织细胞，很适合组织培养。C 分化的器官、组织，包括嫩茎、嫩叶、鳞片、形成层、根、花瓣、花萼、珠心等二倍体组织。其中叶片、叶柄是常用的外植体。 D 花粉和雌配子体中的单倍体细胞，即常说的小孢子培养，因其细胞中只含有体细胞的一半染色体，因此常用于单倍体育种中。

5.2外植体的选择原则①再生能力强，常用幼嫩的组织；

②遗传稳定性好；③来源丰富；④灭菌容易；⑤外植体的大小，一般为0.5—1cm或更小，用于脱毒。

5.3接种，即无菌条件下，把经表面消毒的外植体转移至无菌培养基上的过程。

首先，应对接种室（超净工作台）、培养皿、滤纸、酒精灯、解剖刀、剪子、镊子等进行消毒处理。其次，具体操作。注意：茎尖、茎段接种应把其基部插入培

养基，但不宜过深，要把芽露在外面；接种叶片应把背面接触培养基，气孔较多，易吸收水分和养分。

6.培养条件

A 温度，为了满足不同培养材料需求，培养箱温度一般设为25℃。

B 光照，组培中常用的光照强度范围是1000—6000lx，一般设置为3000—4000lx。而光周期常设置为光照16h，黑暗8h。也是要根据具体材料要求而定。

C 气体，避免外植体陷入培养基中。

D 湿度，培养环境湿度应为70—80%。

E 培养基中的渗透压，适宜的渗透压是保证植物吸取营养的前提，只有当植物细胞与培养基之间的渗透压相等或略小于培养基的渗透压时，培养材料才能从培养基中吸收养分。其大小主要由培养基中的糖分来决定，多数植物适宜的糖浓度为2—3%，体细胞胚的发生要求较高的糖浓度，15%左右。

H 培养基的PH值，培养基常用PH值为5.6—5.8，基本能满足大部分植物要求。要根据具体的培养材料要求而定。

7.继代培养

将培养材料产生的愈伤组织或者不定芽转移到相同或不同的培养基中，以保持其旺盛的分化能力。主要用培养物的扩增繁殖。当培养过程中出现以下情况时，需要继代培养： A 培养基中养分被消耗后已不能满足植物生长发育需要。B 不定芽生长旺盛，已经长满瓶时。C 培养时间过长，培养材料分泌出的有害物质积累过多。

D 长期不转接，也易污染。

8.生根培养

即将不定芽移至生根培养基中。生根培养基一般加微量生长素、或不加生长素、低浓度的培养基1/2MS、1/3MS 有利于生根。

9.试管苗移栽驯化

由于试管苗的生长环境不同于自然外界环境，因此其具有高湿、弱光、恒温、低透气性等特点。所以需要驯化后才能移栽。10.植物组织培养的应用

A 离体快繁

B 脱毒苗生产

C 人工种子

D 次生代谢产物的生产

E 种质资源保存

F 单倍体培养（小孢子培养）

G 原生质体融合

H 植物遗传转化

应用实例人工种子

1.人工种子的概念

人工种子，是指利用细胞的全能性，将植物离体培养产生的体细胞胚或者具有发育成完整植株能力的分生组织（胚状体、芽和茎段等）包埋在含有营养物质并且具有保护功能的外壳内，形成在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体。

胚状体（体细胞胚），指在植物组织培养过程中，由非合子细胞经胚胎发生、发育过程形成的具有胚芽、胚轴、胚根的胚状结构，具有发育成完整植株的能力。

2.人工种子的结构：由胚状体（胚类似物）、人工胚乳和人工种皮三部分组成。

3.人工种子的意义：名贵植物快捷高效的繁殖方式B 固定杂种优势 C 控制植物的生长发育与抗逆性D 成本低、贮运方便、无玻璃化缺陷，减少了移栽驯化过程和生产周期短的优点。

4.然种子相比，人工种子还存在许多问题： A 很难获得同步化的、高质量的胚状体或不定芽；B 还不能象正常种子一样生长、运输、贮藏；C 生产成本相对于天然种子来讲，还是比较高；D 人工种子从播种到自养成株之前的管理缺乏经验。

三．现代生物技术概论之动物细胞工程

1. 细胞培养，是指离体细胞在无菌条件下进行分裂、生长，但是在整个培养过程中细胞不出现分化，不再形成组织。

2.动物细胞融合

细胞融合是研究细胞间遗传信息转移、基因在染色体上的定位和创造新细胞株的有效途径。

A 病毒诱导融合

B 化学诱导融合

C 电激诱导融合

3.细胞核移植与动物克隆

细胞核移植，就是将哺乳动物的体细胞核移植到新的卵细胞中重新发育成个体的过程。细胞核移植主要用于异种细胞核质关系研究和细胞核遗传全能性研究。

1997年2月27日，Milmut博士用乳腺细胞的细胞核成功克隆出绵羊“dolly”，说明体细胞核也具有遗传全能性。因此掀开了体细胞克隆哺乳动物的新篇章。

4.干细胞（stem cell），是动物的胚胎及某些器官中具有自我修复和多向分化潜能的原始细胞，是修复病损或衰老组织和器官的理想种子细胞。即可用干细胞培养出来器官替换病人的相应坏损器官。

干细胞具有以下特点：A 具有分裂成其它细胞的可能性；B 具有无限增殖的潜能；C 可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态；D 以对称或不对称两种方式进行生长。

四．现代生物技术概论之植物基因工程

基因（gene）：染色体上具有特定结构和功能的DNA片段。不同基因表达不同的蛋白质，所以不同生物体表现出不同的性状，即基因决定生物体的性状。

基因一般都包含：5'非转录区、起始密码子、转录区、终止密码子、3'非转录区。

基因工程，就是将目的基因插入到载体（质粒、病毒）中，再把携带目的基因的载体转入受体材料细胞中，使目的基因在受体细胞中表达。进而使受体生物表现出目的基因的性状。

基因工程操作的一般步骤：1.获得目的基因；2.目的基因克隆与验证；3.表达载体构建：将目的基因与载体组合成能在目的生物中表达的形式；4.转化：将重组DNA 引入某种受体或细胞；5.筛选：筛选出目的基因能够表

达的个体或细胞。

1.植物基因工程中常用的目的基因：

抗病基因、抗虫基因、、抗逆基因、改良作物品质的基因、改良植物其它性状的基因

2.目的基因的获得

2.1化学合成法

2.2基因组文库法基因组文库是将目标生物的全部基因组DNA切割成一定长度的DNA片段并克隆到某种载体上而形成的集合。

2.3 cDNA文库法cDNA文库是将目标生物某一发育时期或者是某一组织器官的全部mRNA反转录成cDNA 并克隆到某载体上而形成的集合。

2.4 PCR法

聚合酶链式反应(PCR)，在有DNA单链、引物、dNTPs、DNA聚合酶等条件下，DNA聚合酶即可从引物开始沿单链DNA的5'-3'合成其互补链，而PCR仪可以使这一反应不断进行下去，直到条件不复存在。

2.5RT-PCR(reverse transcription PCR)即反转录PCR，以mRNA为模板，在反转录酶的作用下合成cDNA 第一链的过程。在已知目的基因cDNA序列的情况下可用此法来分离目的基因。

2.6 mRNA差异显示技术法

2.7来自已知蛋白

3.载体即携带目的基因进入宿主细胞，并在宿主细胞中进行复制、整合或表达的工具。

表达载体即可携带目的基因进入宿主细胞进行复制、转录、翻译的载体。一般是在克隆载体的基础上增加了基因表达调控的元件构建而成。

克隆载体即携带目的基因进入宿主细胞进行复制或保存的载体，包括质粒载体、噬菌体载体、黏粒载体、人工染色体。

4.工具酶

4.1限制性内切核酸酶(RE)

在各种细菌中均存在一种或多种能够切割双链DNA分子中特异核苷酸序列的酶，即限制性内切核酸酶，以此来限制外源DNA在细菌细胞内的存在，但这种酶不会破坏自身的DNA。

因为细菌细胞中的限制性内切酶识别位点被甲基化酶(methyltransferase, MTase)保护起来了，限制性内切酶对已经甲基化的识别位点无效，从而使自身的DNA不被切割。因此，限制内切酶和能识别相同位点的甲基化酶一起构成了限制—修饰系统。

4.2 DNA连接酶(DNA ligase)

它是把不同双链DNA片段的3'羟基末端与5'磷酸末端通过磷酸二酯键连接起来的酶。

4.3 DNA聚合酶和反转录酶

DNA聚合酶(DNA polymerase)的作用是在模板和引物的存在下，把脱氧核糖单核苷酸连续地加到双连DNA 分子引物链的3'-OH端，催化核苷酸的聚合反应。

4.4 DNA修饰酶

①末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)，简称末端转移酶，②T4多核苷酸激酶③碱性磷酸酶，是将核酸分子脱掉5'端的磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5'-P转换为5'-OH。主要用于DNA分子5 '端的去磷酸化，防止自身连接；在5 '末端标记之前，去除DNA或RNA的5 '端磷酸基团。

4.5 RNA酶

5.植物转基因方法A)载体介导的转化方法B).DNA直接导入法C).种质系统法

其中的Ti质粒转化法是目前植物基因工程中使用最好的方法。

Ti质粒都含有以下四个区，即T-DNA区、Vir区、Con 区、Ori区。

①T-DNA区，它是农杆菌侵染植物时，从Ti质粒上切割下来并转移到植物细胞内的一段DNA，所以称为转移DNA。

②Vir区，该区域的基因能激活T-DNA的转移，使农杆菌表现出毒性，所以称为毒性区。

③Con区，该区域上存在着与细菌间接合转移有关的基因(tra)，冠瘿碱能激活tra表达并进一步调节Ti质粒在农杆菌之间的转移，所以称为接合转移区。

④Ori区，该区域的基因是调节Ti质粒自我复制的起始区域。

6.重组子的筛选与鉴定

6.1载体表型鉴定法

6.2 DNA直接鉴定法A)DNA序列分析(直接测序分析)B)重组子酶切图谱鉴定

6.3 PCR检测法

6.4外源基因整合的southern杂交鉴定法

Southern杂交法：用与外源基因同源的互补序列作为探针，通过碱基互补配对形成稳定的双链DNA分子,检测同源片段的杂交技术。southern杂交是当前鉴定外源基因整合的权威方法。

6.5外源基因转录的northern杂交检测

Northern杂交原理：外源基因如果正常表达，在转化植株的细胞内将有其转录产物------特异mRNA生成。提取其总RNA或mRNA并进行变性凝胶电泳，转膜并与标记好的探针杂交形成DNA-RNA的杂合体。通过探针上的标记可检出目的mRNA。

6.6外源基因转录的RT-PC R或RT-qPCR检测

6.7外源基因表达蛋白质的检测目的基因编码的蛋白在转基因植物中能够正常表达是转基因的最终目的。常用的检测目的基因表达蛋白的方法即western杂交。

Western杂交原理：若目的基因正常表达，则在转基因植物中含有一定量的目的蛋白。从转基因植物中提取

总蛋白，将蛋白质样品溶解于含去污剂和还原剂的溶液中，经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳使蛋白质按分子大小分离，将分离的各蛋白质条带原位转印到固相膜上，膜在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭非特异性位点。加入特异抗体(一抗)，印迹上的目的蛋白(抗原)与一抗结合后，再加入能与一抗专一结合的标记好的二抗，最后通过二抗上的标记化合物的性质进行检出。

6.8外源基因的功能鉴定

7.PCR的原理：双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。流程：模板DNA的变性、模板DNA与引物的退火（复性）、引物的延伸。

8.琼脂糖凝胶电泳制胶过程：A)称量准确称量琼脂糖和缓冲液；B)熔胶熔解充分，防止溢出；C)制槽倒胶用具清洁，水平放置，避免产生气泡；D）冷却充分冷却；E）去梳子要小心，防止弄裂胶板。

电泳注意事项：A)琼脂糖溶解要充分；B)稍冷却后再倒胶，防止胶从制胶槽中流出，且制胶槽要放置水平；

C)待胶充分凝固后，拔出梳子，拔梳子时要左右轮换均匀用力，缓慢拔出防止加样孔被破坏；D)上样时要混合充分且认真操作，防止加到加样孔外；E)注意区分正负极，电压不易过高；F)电泳时间不易过长，指示带至胶的2/3即可；G）EB溶液要小心使用，要戴手套操作。五．现代生物技术概论之动物基因工程

1. 基因诊断利用分子杂交或PCR方法，通过检测疾病相关表达特异基因来诊断疾病。

2. 基因治疗向靶细胞或组织中引入外源基因DNA或RNA片断，以纠正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗的目的。

六．现代生物技术概论之分子标记技术

1.生物多样性地球上的所有生物体及其所构成的综合体。包括遗传多样性、物种多样性、生态系统多样性、景观多样性。

2.遗传多样性的表示方法：遗传标记（种类：形态学标记、细胞学标记、生化标记、分子标记）

3.分子标记(molecular marker)：指能反应生物个体或种群间基因组上的某种差异特征的DNA片段，直接反映基因组DNA间的差异。

3.1 分子标记的种类：A) RFLP 限制性片段长度多态性标记技术

B) RAPD随机扩增多态性DNA标记技术

C) AFLP扩增片段长度多态性标记技术

D) SSR 简单序列重复标记技术原理：SSR标记即简单序列重复或者微卫星DNA(microsatellite DNA)，一般为2—6个碱基组成的基序(motif)串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，在100bp以内。微卫星主要以两个碱基为重复单元，也有些是三个碱基的，四个碱基的更少，如(GT)n、(AT)n、(GGC)n、(GACA)n 等重复序列，在植物基因组中以(AT)n最多。它们广泛分布于各类真核生物基因组的不同位置，平均每10kb 的DNA序列中就会出现一个微卫星序列。尽管微卫星DNA分布于整个基因组的不同位置，但其两端序列多是保守的单拷贝序列，因此可根据这两端的序列设计一对特异引物，通过PCR技术将其间的核心微卫星DNA 序列扩增出来，利用电泳分析技术就可获得其长度多态性。SSR标记高度多态性主要来源于串联数目的不同。

E) SNP 单核苷酸多态性标记技术原理：在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。通常所说的SNP都是2个等位多态性(一个SNP位点只有两种等位基因)，这种多态性只涉及单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(包括C与T互换，在其互补链上则是G与A互换)或颠换(包括C与A、G与T、C与G、A与T互换)所引起，也可以由碱基的插入或缺失所致。

3.2 DNA分子标记的应用：分子遗传图谱构建、遗传多样性分析与种质鉴定、重要农业农艺性状的基因定位与图位克隆、转基因植物鉴定、分子标记辅助选择