布鲁菌外膜蛋白OMP25的原核表达

布鲁菌外膜蛋白OMP25的原核表达
布鲁菌外膜蛋白OMP25的原核表达

收稿日期:2010-07-06;修回日期:2011-02-23

基金项目: 十一五 国家重大科技攻关项目(2006BAD 4A 16-4)

作者简介:刘艳琴(1985-),女,硕士研究生,i m au li uyanqin @163.co m.通信作者:吴树清(1957-),男(蒙古族),教授,本科.

布鲁菌外膜蛋白O M P25的原核表达

刘艳琴,吴树清,吴 杰

(内蒙古农业大学兽医学院,内蒙古呼和浩特010018)

中图分类号:S813.1

文献标识码:A

文章编号:1004-7034(2011)04-0020-03

关键词:布鲁菌;分离株;外膜蛋白OMP25;重组质粒;蛋白纯化

摘 要:为了克隆布鲁菌外膜蛋白OMP25基因并构建基因的原核表达系统,试验采用聚合酶链反应(PCR)扩增得到布鲁菌基因组OM P25基因片段,T-A 克隆后测定核苷酸序列,将目的基因定向插入原核表达载体pET -32a ,经双酶切和DNA 测序,再将构建的重组质粒转化到E.coil DH 5 、Rosetta ,经I PTG 诱导后用SDS-PAGE 检测重组蛋白pET32a-OM P25的表达情况。结果表明:经DNA 测序显示OMP25基因序列和插入位点正确,成功构建了重组质粒pET 32a-OMP25,经IPTG 诱导表达出以包涵体形式存在的长为43ku 的OMP25融合蛋白;经W estern-b l o t 检测,OM P25融合蛋白与布鲁菌阳性血清发生特异性反应,说明重组蛋白具有良好的反应原性。

Prokaryocyotic Expression of Outer M embrane P rotein 25of Brucella

LI U Yan-qi n ,WU Shu-q i n g ,WU Jie

(C oll ege of veteri n ary M ed i ci n e ,InnerM ongo li a Agricultura lU n i vers it y ,H ohhot 010018)

K ey words :B rucell a ;is olates ;outerm e m brane protei n25(O M P25);reco m b i nan t p l as m i d ;protei n purification

Abstract :To cl on e and con struct t he reco mb i n ant exp ressi on p l as m i d f or 25ku Outer me m b rane protei n (O M P25)of B rucell a i n E.col,i The gene segm ents of Bru cell a OM P25w ere a m p lified and ob t a i ned by pol ym erase chai n reaction (PCR ),then s equ enced after TA cl on i ng .Subse quen tly t he t arget gene w as cl on ed i n t o p rokaryoti c expression vector PET -32a and i den tified by restri ction enzy m e d i gesti on and DNA sequen ci ng .The reco m binant plas m i d w as tran sf or m ed i n to E.coli Rosett a .A fter i ndu ced by I TPG,t h e reco mb i n ant protei n express ed byOM P25gene in E.co liDH5 and Rosett a w as i d enti fi ed by SDS -P AGE an al ysis .The res u lts of DNA sequen ci ng s ho w ed t h at t he sequence and cl on i ng site of the insert forOM P25gen ew ere exact .The reco m binant express i on p las m i d PET-32a -O M P25w as cons truct ed ,and t h e protei n i ncl u d i ng bod i es of O M P2543ku f u si on w as s u ccessf u lly exp ressed i ndu ced by I PTG.The O M P25gene ofB rucell a w as cl oned i nto PET-32a,and then recomb i nan t p las m i d pET32a-O M P25was constructed and the reco m binantOM P25protei n w as successfu ll y exp ress ed i n E.coliRosetta .The w estern-b l otti ng analysis sho w ed that t he reco mb i nant O M P25react ed s pecificall y w it h bru cell a pos i ti ve serum.It i nd i cated the reco m b i nant protei n process ed favorab le i m m unogen i cit y .

布鲁菌是革兰阴性、兼性细胞内寄生菌,主要通

过黏膜上皮侵入机体,在脾脏、肝脏、乳腺、生殖器官

等部位增殖和扩散[1]

。随着分子生物学技术的快速发展,大量研究表明布鲁菌的外膜蛋白具有很强的免

疫原性[2-4]

。OM P25是B .suis(布鲁菌的一类)入侵巨噬细胞的初期在酸性介质环境中释放的一种蛋白,是布鲁菌主要的毒力特征。试验首次用pET -32a 与Rosetta 结合进行表达,为进一步研究布鲁菌OM P25基因的功能,探索该蛋白的功能条件并开发、利用该蛋白奠定了基础。

1 材料

布鲁菌菌株544,购自中国兽药监察所;p MD19-T 、Rosetta ,购自宝生物工程(大连)有限公司;E.coil DH 5 ,购自天根公司;H is G rav i T rap 、H is G rav i T rap K i,t 购自GE 公司;pET -32a 表达载体、牛布鲁菌阳性血清和标准阴性血清,由内蒙古农业大学微生物实验室保存;辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗牛I gG,购自Sig m a 公司;其他常规试剂均为国产试剂。2 方法2.1 目的片段的扩增

根据GenBank 上发表的布鲁菌外膜蛋白OMP25的基因序列(登录号为AM 712381),利用Pri m er Pre m ier 5.0设计引物,引物为P15 -GCGAATTC AT GCGC ACTC TTAAGTC -3 ,P25 -GCCTCGAGAGAA CTTGTAGCCGATG -3 (划线处分别为E co R 和Xho 酶切位点)。PCR 反应条件:95 预变性

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实验研究

H e ilong jiang A ni m a l Sc i ence

and V e teri nary M edicine

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实验研究2011年4月(上) 5m i n;94 变性30s,55 复性50s,72 延伸

1m i n,共35个循环;最后72 延伸10m i n。同时设

去离子水为阴性对照。反应结束后用1%的琼脂糖

凝胶电泳检测并观察结果。

2.2 T-A克隆和核苷酸序列测定

对PCR扩增产物电泳后切胶回收,操作按Axy Agarose Gel DNA Purification K it试剂盒说明书进行;将回收产物与p MD19-T载体于16 连接过夜,转化E.coli DH5 ,涂LB平板(Amp抗性),37 培养过夜;挑取白色克隆菌落于37 摇菌过夜;以碱变性法提取质粒,进行PCR和E coR 、Xho 双酶切鉴定;委托宝生物工程(大连)有限公司测序,并与Gen Bank报道的OM P25基因序列进行同源性比较。

2.3 表达载体的构建

经Axyprep T M DNA Gel Extraction K it纯化及Eco R 、Xho 双酶切后得到p MD19-T O M P25和pET-32 。胶回收产物在T4DNA连接酶的作用下于16 连接过夜,转化至E.coli DH5 ,涂LB平板(Am p抗性),37 培养过夜;挑取单克隆菌落于37 过夜摇菌;以碱变性法提取质粒,进行PCR和Eco R 、Xho 双酶切鉴定;阳性质粒转化至E.co li DH5 ,涂LB平板(Amp抗性),37 培养过夜;挑取单克隆菌落37 摇菌过夜;碱裂解法提取质粒,再次进行PCR和E co R 、Xho 双酶切鉴定;将鉴定为阳性的克隆株送至宝生物工程(大连)有限公司测序,进一步鉴别正向插入pET-32a基因和读码框正确的重组子,并将其命名为pET32a-OMP25;将阳性质粒转化Rosetta感受态细胞,在含50 g/mL Am p、34 g/mL氯霉素的LB培养基上培养。

2.4 pET32a-OM P25-R重组蛋白不同时间的诱导表达

将含重组质粒的菌液按1%的量接种在含50 g/mL Am p、34 g/mL氯霉素的LB培养基中, 37 振荡培养至OD600值为0.6~1.0;再加入I PTG 使其终浓度达到0.5mm o l/L,37 继续培养;分别于2,3,4,5,6,7,8,9小时时收菌,经12%的分离胶检测表达情况。

2.5 表达产物的鉴定

2.5.1 表达产物的SDS-PAGE和W estern-b l o t分析 将上述的诱导表达样品以12000r/m i n离心,收集菌体,沉淀物用原收集菌液量1/5体积的Lysis Buffer悬浮,置冰浴中超声波处理10m i n;4 、11000r/m i n离心10m i n,分别收集上清液和沉淀;将上清液和沉淀悬浮液分别进行SDS-P AGE和W est er n-b l o t分析,检测表达产物的分子质量和免疫反应活性。

2.5.2 表达产物的纯化 表达产物经超声波处理

后,4 、11000r/m i n离心收集上清液;按照H is G rav i T rap和H is G rav i T rap K it说明书对融合蛋白进行重力流纯化,对纯化产物进行SDS-PAGE分析。

3 结果

3.1 目的基因的PCR扩增(见图1)

M.DL-2000M arker;1,2.重组质粒PCR产物;3.阴性对照。

图1 阳性质粒PCR产物

F i g1 PCR p rodu cts of positive p l as m id OMP25gen e

由图1可知,通过PCR扩增,在1%琼脂糖凝胶电泳图谱上显示出1条带,此扩增产物大小与预期结果(642bp)相符。

3.2 pET32a-OM P25重组质粒的双酶切鉴定

pET32a-OMP25重组质粒经E co R 与Xho 双酶切鉴定显示,p M D19-T-O M P25蛋白基因已插入载体中,与预期结果相同(642bp),获得了含有OM P25基因的重组表达片段的阳性克隆。测序发现p M D19-OM P25基因正向插入pET-32a载体,将重组质粒命名为pET32a-OMP25,具体见图2。

M.DL-5000M arker;1,3.重组表达载体经E co R 和Xho 酶切;

2.pET32a-O M P25重组质粒。

图2 表达载体重组质粒的酶切鉴定结果

Fig2 R estriction enzy m e digestion anal ysis of

the exp re ssi on ve tctor reco mb i n ant p l as m i d

3.3 表达产物的SDS-PAGE分析

SDS-P AGE分析结果表明,经I PTG诱导的基因工程菌获得表达,产生分子质量约为43ku的特异性蛋白条带。诱导表达4h的表达量与5,6,7h的差不多,因此取4h为诱导时间,结果见图3。

3.4 表达产物的W estern-b lot分析

将细菌裂解物经SDS-PAGE分析后再转到

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黑龙江畜牧兽医 科技版

M.低分子质量蛋白标准;1~8.诱导时间为2~9h 。图3 表达产物的SDS-PAGE 分析

Fig 3 SDS -PAGE of the expression p roduc ts

P VDF 膜上,用5%的脱脂奶粉于4 封闭过夜;PBST 缓冲液洗3次,加入牛布鲁菌阳性血清(1 200倍稀释),37 作用1h ;PBST 缓冲液洗3次,再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗牛Ig G (1 2000倍稀释)37 作用1h;PBST 缓冲液洗3次,在DAB 缓冲液中避光显色3~10m i n 。W ester n -b l o t 分析结果表明,表达的目的蛋白能与牛布鲁菌阳性血清发生特异性反应,43ku 处出现特异免疫反应条带,结果见图4

M.低分子质量蛋白标准;1,2;表达产物;3;载体蛋白。

图4 表达产物W estern-blot 检测结果

F i g 4 W estern -b l ot of the exp re ssed products

3.5 表达产物的纯化

按H is Grav i T rap 和H is G rav i T rap K it 的说明书对融合蛋白进行重力流纯化,纯化蛋白分步收集,产物经SDS-P AGE 电泳分析,结果表明获得了高纯度的目的蛋白,结果见图5。4 讨论

布鲁菌的抗原组成复杂,在1980年发现外膜蛋

白是具有免疫原性和保护性的抗原[5]

,试验采用PC R 技术扩增得到布鲁菌OMP25全序列基因片段,将目的基因定向插入原核表达载体pET -32a ,经双酶切和DNA 测序证明,布鲁菌OMP25原核表达载体构建成功。将构建的重组质粒转化E.co il Rosetta ,经I PTG 诱导后,表达出布鲁菌外膜蛋白OM P25融合蛋白。原核表达系统具有表达量高、操作简便的特点

,

1.样品过柱收集制样;

2.B i nd i ng B uffer 过柱制样;

3.W as h Bu ffer 洗脱样品制样;

4.W as h Bu ffer 二次洗脱样品制样。

图5 表达产物纯化的S D S-PAGE 电泳分析

F i g 5 SDS -PAGE of pu rifican ti on expressed p roduc ts

因而被广泛应用并获得各种蛋白,但表达产物大多以

无生物学活性、不溶性的包涵体形式存在。本试验用原核表达载体pET -32a 表达了以包涵体形式存在的OM P25蛋白,pET-32a 与Rosetta 宿主菌相匹配,这样的组合可以获得大量的正确折叠蛋白。而且pET-32a 原核表达载体所带的融合标签小,重组蛋白折叠时不易掩盖被研究蛋白的表位,能够保持蛋白原本的反应性。另外,在重组蛋白分子结构上接了6 H is 标签,通过与金属N i 发生螯合作用,据此可进一步利用H is Gravi T rap K it 大规模纯化获取该蛋白。

本研究表达的目的蛋白能与牛布鲁菌阳性血清发生免疫反应,而载体蛋白与阳性血清不产生反应,证明该蛋白具有良好的抗原性。该蛋白的表达为进一步作为抗原或制备抗体建立了免疫学检测方法,也为开发快速检测试纸条奠定了基础。参考文献:

[1] 柳建新,陈创夫,王远志.布鲁氏菌致病及免疫机制研究进展

[J].动物医学进展,2004,25(3):62-65.

[2] BRICKER B J ,TABATABAI L B ,DEYOE B L .Conservation of an-ti gen ici ty i n a 31-kDa Brucella protei n [J].V etM i crob i o,l 1998,18(3/4):313-325.

[3] BO W DEN R A,CLOECKAERT A ,ZYG M UNT M S,et a.l Eval ua

ti on of i m m unogen i cit y and protecti ve acti v i ty i n Bal b /c m ice of t he 25ku m aj or outer -m e m brane protei n of Bru cella m elit en sis (O M P25)exp res sed in E scherich i a coli[J ].J M ed M icrob i o,l

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实验研究

H e ilong jiang A ni m a l Sc i ence

and V e teri nary M edicine

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原核蛋白表达常见问题解析

原核蛋白表达常见问题解析 1、为什么目的蛋白总是以包涵体的形式出现? 在原核蛋白表达纯化中目的蛋白经常发生错误的折叠,并聚集成为 包涵体。经过诱导,目的蛋白通常可达细胞总蛋白的50%以上。虽然有一定比例的蛋白以可溶的单体形式存在,而多达95%(甚至更多)的蛋白则在包涵体中。实验过程中,可以采取降低诱导温度,例如25–30°C,或降低IPTG浓度(0.01–0.1mM)并延长诱导时间,还有采用特别的 培养基等方法获得更多的可溶蛋白。 2、跨膜蛋白为什么很难表达? 跨膜蛋白的表达成功率相对较低是一个实验结果,究其原理,目前 众说纷纭很多种理论。以我们浅薄的理解层面来看,主要有以下几个 原因: 跨膜蛋白一般都是强疏水性的氨基酸分子和亲水性的分子跳跃式 的连接,形成的亲水疏水的一个最简单的跨膜化学结构,这种结构与 信号肽结构相似,对于原核细胞来说,简单的细胞器很难像真核细胞 一样完成信号肽识别及切除、引导内质网、高尔基体重新包装及分泌 这一复杂过程,有些蛋白是多次跨膜,对于原核细胞来说几乎是不可 能完成的任务。 另外,对于疏水性的片段,在原核细胞中极易形成包涵体,疏水 性多肽会抑制翻译过程,甚至与原核膜结构融合形成毒性,出于生物 自我保护的本能,所有的细胞器都会停止合成蛋白的过程。 3、如何选择蛋白表达宿主菌?

4、我们有哪些原核蛋白纯化方式?如何选择不同的纯化方式? 答:我们公司的蛋白纯化方法大致分为亲和纯化、离子交换、切胶 回收三类。 1、常规情况下,一般携带融合标签(His标签,GST标签,sumo标签,Fc标签),我们可以通过Ni柱、GST柱、Protein A等进行亲和纯化 获得融合蛋白,用亲和纯化的方法一般可以获得85%以上纯度的蛋白, 亲和纯化的方便快捷。 2、如果需要目的蛋白不含有任何标签,怎么选择纯化方式?。 (1)可表达融合蛋白,用蛋白工具酶切割融合蛋白,再进行纯化除去 工具酶。此方法能快速得到蛋白。 (2)可表达不含标签的蛋白,进行离子、分子筛、疏水等纯化,通过AKATA纯化设备获得蛋白。 3、如果需要获得蛋白作为抗原,可以直接通过切胶回收的方式,此方 法获得蛋白纯度较高,进行免疫动物后得到的抗体进行WB反应,灵敏 度较高。 5、表达得到的蛋白是有活性的么? 答:需要让蛋白有活性的条件很复杂,合适的缓冲液体系、盐浓度、蛋白的折叠状态甚至检测活性的方法的细微差别都可能导致活性 的强弱有无,一般情况下,上清表达的蛋白要比包涵体经过变复性纯 化后得到的蛋白活性要好,我们尽量从上清中获得蛋白,期许蛋白形 成的折叠最接近活性状态,这也是我们擅长的。但是在实际实验条件下,我们无法承诺表达纯化的蛋白一定具有客户期望的生理活性。

His_FemA融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

【收稿日期】2012-04-27【基金项目】湖南省自然科学基金资助课题(10JJ5027);中南大 学自由探索研究创新基金(2010112001166)【作者简介】(1971-),男,副主任技师,医学博士,硕士生导师, 从事细菌耐药性及耐药机制研究,Email :zoumingx-iang@126.com ;范学工,通讯作者,教授,博士生导 师, Email :xgfan@hotmail.com 文章编号:1005- 376X (2012)10-0878-05【论著】 His-FemA 融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达 邹明祥1,李军1,邬国军2,武文君3,张宁洁1,刘文恩1,范学工4 (1.中南大学湘雅医院检验科,湖南长沙410008;2.中南大学基础医学院微生物学系,湖南长沙410078;3.河南中医学院第一附属医院检验科,河南郑州450000;4.中南大学湘雅医院感染病科,湖南长沙 410008) 【摘要】目的构建His 标签的金黄色葡萄球菌甲氧西林耐药相关蛋白FemA 的融合蛋白表达载体,并在大肠 埃希菌中表达, 为进一步研究femA 基因的生物学功能和临床应用奠定基础。方法根据GenBank 中金黄色葡萄球菌femA 基因序列,利用Primer Premier 5.0设计PCR 引物,并在引物的5'加入BamH I 及Sal I 酶切位点;以金黄色葡萄球菌 基因组DNA 为模版,PCR 扩增出femA 基因片段。将目的DNA 片段及质粒pQE30分别进行双酶切、连接并转化大肠 埃希菌DH5α;阳性克隆以PCR 、双酶切及测序进行鉴定。将鉴定正确的pQE30-femA 重组质粒转化大肠埃希菌JM109,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG )诱导表达His-femA 融合蛋白;采用SDS-PAGE 及Western blot 分析对表达蛋白进行验证。结果经PCR 、双酶切鉴定及序列测定,证实重组质粒pQE30-femA 构建成功;重组质粒pQE30-femA 转化大肠埃希菌JM109经IPTG 诱导后, SDS-PAGE 和Western blot 分析显示表达出53kD 目的蛋白;经Bandscan 软件分析,目的蛋白质在4h 的表达量占细胞总蛋白的27.5%。结论成功构建了His-FemA 原核表达载体(pQE30-femA ),并在大肠埃希菌中高效表达。 【关键词】金黄色葡萄球菌;femA 基因;原核表达;融合蛋白 【中图分类号】R378.1+1 【文献标识码】A Construction of His-FemA fusion protein expression vectors and the expressions in pro-karyotic cells ZOU Ming-xiang 1, LI Jun 1,WU Guo-jun 2,WU Wen-jun 3,ZHANG Ning-jie 1,LIU Wen-en 1,FAN Xue-gong 4 (1.Department of Clinical Laboratory ,Xiangya Hospital of Central South University ,Changsha 410008,China ;2.Department of Microbiology ,School of Basic Medicine ,Central South University ,Changsha 410078,China ;3.Department of Clinical Laboratory ,the First Affiliated Hospital of Henan University of Traditional Chinese Medicine ,Zhengzhou 450000,China ;4.Department of Infectious Diseases ,Xiangya Hospital of Central South University ,Changsha 410008,China ) 【Abstract 】Objective To construct His-tagged FemA fusion protein expression vectors ,and express it in E.coli and establish foundation for further studies.Methods PCR primers were designed using Primer Premier 5.0software according to the sequence of femA gene in GenBank.Two restriction endonuclease recognition sites BamH I and Sal I were added to the 5'end of the primer.Genomic DNA from S.aureus was used as the templete for PCR amplification of femA gene.The obtained femA gene and plasmid pQE30were double-enzyme digested respectively ,ligated and transferred into DH5α.The positive clones were selected and the recombinant plasmid pQE30-femA was identified by PCR ,restriction endonuclease analysis and DNA sequencing.Then the identified pQE30-femA was transformed into E.coli JM109and the target protein expression was in-duced by IPTG.The expressed product was identified by SDS-PAGE and Western blot.Results Verified by PCR ,double-en-zyme digested assessment and sequencing ,recombinant plamid pQE30-femA was successfully constructed.SDS-PAGE and Western blot analysis revealed that the recombinant plasmid pQE30-femA expressed a 53kD target protein in E.coli JM109. Bandscan software analysis showed that the expressed target protein at 4h accounted for about 27.5%of the total bacterial pro-tein.Conclusion The His-tagged femA fusion protein expression vectors (pQE30-femA )was successfully constructed and high-effectively expressed in E.coli . 【Key words 】Staphylococcus aureus ;FemA gene ;Prokaryotic expression ;Fusion protein 金黄色葡萄球菌是威胁人类健康的重要致病菌, 可引起化脓性感染、食物中毒、表皮剥脱综合征以及血流感染等多种疾病。随着抗菌药物的广泛使用, 金黄色葡萄球菌的耐药现象日趋严重[1,2] 。其中,耐 甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA )不仅具有严重的多重耐药性,同时具有广泛的流行性,极大地增加了患者和社会的医疗负担,已成为全球严重的公共卫生

红色荧光蛋白的原核表达

红色荧光蛋白(RFP )的原核表达 生物学实验教学中心 报告题目 红色荧光蛋白(RFP )的原核表达 作者姓名 饶慧 班级学号 0802班/2008114010214 指导教师 王友如 完成时间 2011年02月

目录 引言 (1) 1实验材料及实验仪器 (4) 1.1实验材料 (4) 1.2实验仪器 (5) 2实验方法 (7) 2.1 重组质粒的构建 (7) 2.2工程菌株的活化 (7) 2.3诱导表达 (8) 2.4 SDS-PAGE检测表达蛋白 (8) 3 结果与分析 (9) 总结 (10) 参考文献 (11) 致谢 (13)

红色荧光蛋白的原核表达 饶慧 (指导老师:王友如) (湖北师范学院生命科学学院生物科学0802班湖北黄石435002) 摘要实验目的:研究红色荧光蛋白(Red Fluorescent Protein,RFP)基因在大肠杆菌中原核表达。实验方法:通过分别将DH-5ɑ(pDsRed-N1)和DH-5ɑ(pET-28ɑ)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-RFP,将重组质粒通过转化的方法把含红色荧光蛋白(RFP)外源基因转入大肠杆菌体内进行表达,再用IPTG诱导RFP基因表达,可以看到显现红色,最后根据SDS-PAGE电泳结果,判断RFP基因在大肠杆菌中是否成功表达。实验结果:结果显示构建的重组质粒pET-28ɑ-RFP在E.coli中成功表达。 关键词红色荧光蛋白;质粒重组;原核表达;诱导表达

分子生物学综合实验 Prokaryote Expression of Red Fluorescent Protein (RFP) Rao Hui (Class 0802, College of Biology Science ,Hubei Normal University, Huangshi, Hubei,435002 ) Abstract Objective: To study the expression of the RFP gene in the E.coli. Methods: Extract the plasmid of the DH-5ɑ (pDsRed-N1) and DH-5ɑ (pET-28ɑ). Then the two plasmids are cut by enzyme and are connected to form pET-28a-RFP recombined plasmid. Guiding the recombined plasmid, which contains exogenous genes of RFP, into E.coli for expression, through transformative method. The expression of RFP gene can be induced by the IPTG and then we can see red. Finally, judging whether the RFP gene has expressed successfully in E.coli according to the results of SDS-PAGE electrophoresis. Results: The results suggest that pET-28ɑ-RFP recombined plasmid has successfully expressed in E.coli. Keywords Red Fluorescent Protein; Recombined Plasmid; Prokaryote Expression; Induced Expression

GST_talin1融合蛋白的原核表达及纯化

收稿日期:2007-12-22;修回日期:2008-01-11 作者简介:吴 爽(1979-),女,硕士,助教,教学和研究方向,细胞生物学,E 2mail:wushuang 21977@https://www.360docs.net/doc/de5434580.html,;通迅作者:耿建国(1955-),男,博士,研究员,研究方向,细胞粘连与迁移。 GST 2talin1融合蛋白的原核表达及纯化 吴 爽 1,2 ,耿建国 2 (1广东药学院基础学院组织胚胎教研室,广州 510006;2中科院生化细胞研究所分子细胞生物学实验室,上海 200031) 摘 要:应用PCR 方法扩增talin1的cDNA,并将其重组入谷胱甘肽转硫酶融合基因表达载体pGEX 24T 21中,获取人源的GST 2talin1融合蛋白,为下阶段深入的研究talin1的结构、功能、及其与之相互作用的蛋白打下基础。经酶 切、序列鉴定,选择正确重组子,将其质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),I PTG 诱导表达,用Glutathi one Sephar ose 4B 柱纯化,western bl ot 鉴定。克隆得到了一个2400bp 的talin1的c DNA 片断,重组质粒目的DNA 测序正确,纯化出分子量约为12116k D 的融合蛋白。用基因工程方法使GST 2talin1重组质粒在原核细胞表达并成功纯化出GST 2talin1融合蛋白。 关键词:talin;P 2选凝素;GST 2融合蛋白;亲和层析中图分类号:Q51 文献标识码:A 文章编号:1008-9632(2008)03-0033-03 P -选凝素(P -selectin )是一种由细胞产生的粘附分子(adhesion molecules ),存在于细胞表面,能够介导细胞与细胞间或细胞与基质间相互接触和结合。其在炎症反应、凝血机制、甚至在某些肿瘤转移等方面发 挥重要作用[1] 。一直以来P 2selectin 受到许多研究者的青睐。P 2selectin 分子的特性到目前为止,人们已有较丰富的研究。本实验室以P 2selectin 的cyt op las m ic domain 为饵从人白细胞cDNA 文库中筛选到几个基因,经测序可知其中之一为talin1(从第1672个氨基酸残基到蛋白末端)。因此本试验利用重组DNA 技术,获得talin1的cDNA,构建了GST 2talin1融合蛋白表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化该融合蛋白,为进一研究talin1与P 2selectin 是否存在相互作用及相互作用机制,奠定了基础。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 菌株、质粒 人源talin1的cDNA 及融合表达 载体pGEX 24T 21为实验室保存。DH5 α及BL21大肠杆菌感受态购自上海申能博采生物公司。1.1.2 生化试剂和分子生物学试剂 引物由上海生工生物有限公司合成,限制性内切酶、T 4DNA 连接酶购自Pr omega 公司,1kb DNA Marker 、DNA 片断快速纯化及回收试剂盒购自北京鼎国生物技术公司,PCR 试剂购自日本T AK ARA 公司,氨苄青霉素为上海华舜生 物公司产品。1.2 方法1.2.1 目的基因的扩增及纯化 根据已公布的人源talin1的cDNA 序列设计talin1的引物,上游引物T1的序列为5′23′at cag tag gaa ttc atg cg gga cct aga cca gg;下游引物T2的序列为5′23′ga agt cat ctc gag gtg ctc atc tcg aag ctc tg,在上下游引物中分别加入EcoR I 和XhoI 酶切位点。PCR 反应总体积为50 μL,包括ddH 2O 4015μL 、10×buffer 5μL 、4dNTP 1μL 、上下游引物各1μL 、模板1μL 、La Taq 酶015μL 。反应条件为:94℃2m in,94℃50s 、56℃50s,72℃2m in,72℃5m in,共35个循环。所获得的PCR 产物以1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。将目的条带切下,用DNA 片断快速纯化回收试剂盒回收。1.2.2 pGEX 24T 212talin1重组质粒的构建 将纯化的PCR 产物和pGEX 24T 21载体用EcoR I 和XhoI 双酶切后,分别回收酶切产物。取回收后的talin1片断815 μL,载体片断015μL,10×T 4DNA 连接酶buffer 1μL,T 4DNA 连接酶013μL,16℃连接过夜。1.2.3 重组质粒的筛选和鉴定 将连接产物全量转 化入DH5 α感受态细菌,在含有氨苄青霉素(Amp )的LB 上37℃筛选培养过夜。次日挑取单个菌落,培养12h 后小量抽取质粒,用EcoR I 和XhoI 双酶切,筛选阳性重组质粒并送上海英骏生物技术有限公司测序。 3 3

浅谈原核表达

浅谈原核表达的技巧 摘要:原核表达是表达外源基因常用的方法,具有操作简单、快捷,需时较短,表达产量高,适合工业化等优点。本文作者根据自己的实践经验,总结了原核表达的一些技巧。 关键词:原核表达表达载体限制性内切酶 将植物、动物、微生物等的目的基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下优点:易于生长和控制;易于培养,实验耗费少;可选择多种大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒。原核表达是近年来表达外源蛋白常用的方法,本文根据自己的实践经验,着重谈谈对原核表达中的技巧问题。 一、原核表达一般程序 表达前准备-获得目的基因-构建含目的片段的表达载体(测序验证)-转化表达宿主菌-诱导靶蛋白的表达-表达蛋白的分析。 二、原核表达中各操作步骤的关键因素及技巧 1.表达前的准备要素:原核表达注重表达前对目的片段、表达载体及表达菌株的分析、选择。正所谓“磨刀不误砍柴功”,经过细致、周全的分析、准备、设计可带来较为顺当的实验,可免去许多不必要的麻烦。 (1)对表达载体的分析 载体的选择:同样的载体,同样的系统,很可能表达这个蛋白表达量起高,但另外一个就是做不出来,所以表达载体的选择非常重要,没有万能的载体。选择载体通常我们关心质粒上的几个功能组件及所带来的问题:是否为诱导表达型载体,启动子的强弱、多克隆位点、限制性内切酶的位置、终止密码子的有无及位置,融合Tag的有无,筛选报告基因的位置等。所选载体一定要保持原来的遗传背景(有些载体经过多次交换已变异)。选择表达载体时,要根据所表达蛋白的最终应用考虑,如果为了方便纯化,可选择融合表达;如果为了获得天然蛋白,可选择非融合表达。融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时,对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。 翻译的起始位点:要表达目的蛋白,在该基因的5’端必须有一起始位点,现在大部分的表达载体都提供起始位点,起始密码子与核糖体结合位点的距离都已被优化,一般情况下不需要自己再加,实际操作时要留意载体图谱上是否注明有起始密码子和终止密码子,如无,还得根据自己的实际情况加上。 在起始密码子附近的mRNA二级结构:外源基因其始转录后,保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键,尤其是在起始密码子附近的mRNA二级结构可能会抑制翻译的起始或者造成翻译暂停从而产生不完全的蛋白。如果利用Primer Premier软件分析DNA或RNA结构上有柄(stem)结构,并且结合长度超过8个碱基,这种结构会因为位点专一突变等因素而变得不稳定,影响正常的翻译。 (2)对目的片段的分析 基因(或蛋白)的大小:原核表达的成功与否与所要表达的蛋白(或基因)大小有关,一般说来小于5kD或者大于100kD的蛋白都是难以表达的。蛋白越小,越容易被内源蛋白水解酶所降解。在这种情况下可以采取串联表达,在每个表达单位(即单体蛋白)间设计蛋白水解或者是化学断裂位点。如果蛋白较小,那么加入融合标签GST、Trx、MBP或者其它较大的促进融合的蛋白标签就较有可能使蛋白正确折叠,并以融合形式表达。如果蛋白较大,大于60kD的蛋白建议使用较小的标签(如6×组氨酸标签)。对于结构研究较清楚的蛋白可以采取截取表达。当然表达时要根据目的进行截取,如果是要进行抗体制备而截取,那么一定要保证截取的部位抗原性较强。对于抗原性也可以利用软件分析,比如Vector NIT Suite或者一些在线软件,不过在分析之余也要认识到这是一种资料统计的结论,

蛋白体外表达与纯化

蛋白体外表达与纯化 随着后基因组时代的到来,蛋白质组成为科学研究的热点。蛋白质作为生命机体的主要活动的承担者,其体外表达与纯化在研究相应基因的功能上有重要意义。 蛋白体外表达系统按其表达宿主可分为原核表达系统,真核表达系统和哺乳动物细胞表达系统。 一:原核表达系统 原核表达系统的宿主菌主要以大肠杆菌为代表,大肠杆菌表达体系是目前应用最广泛的外源基因表达体系,这也是外源基因表达的首选体系。该表达体系的优点:遗传学和生理学背景清楚;容易培养;外源基因经常可以高效表达及操作简单、周期短、成本低等。其不足之处是不能进行典型真核细胞所具有的复杂的翻译后修饰;广泛的二硫键的形成及外源蛋白组装成蛋白复合体的能力也受到限制;另外外源基因产物在大肠杆菌中易形成不溶的包涵体;有时由于真核mRNA的结构特性及密码子使用频率与大肠杆菌的差异,而的不到足够的产物。二:真核表达系统 真核表达系统的宿主菌主要以酵母表达系统为代表,酵母基因表达系统的载体通常既能在酵母中进行复制也能在大肠杆菌中进行复制,形成所谓酵母菌――大肠杆菌穿梭载体。因以大肠制备质粒DNA较方便,通常利用大肠杆菌系统构建酵母载体以简化手续,缩短时间。作为基因表达系统的宿主应该具备以下条件:安全无毒,不致病;遗传背景较清楚,容易进行遗传操作;容易进行载体DNA的导入;培养条件简单;有良好的蛋白分泌能力;有类似高等真核生物的蛋白翻译后修饰功能。 三:哺乳动物细胞表达系统 由于本专业不涉及哺乳动物细胞表达系统的应用,故此不赘述。 表达载体的种类及相应的分离纯化方法 作为表达载体必须具备以下特征:稳定的遗传复制、传代能力,无选择压力下能存在于宿主细胞内;具有显性的筛选标记;启动子的转录是可调控的;启动子的转录的mRNA能够在适当的位置终止;具有外源基因插入的多克隆位点。 在原核表达系统中常用的表达载体有:PET-载体系列,用这类载体表达出的外源蛋白在N端或C端或两端均具有his tag。用该载体表达出的外源蛋白通过其末端组氨酸与Ni2+的结合以亲和层析的方法而纯化。PGEX-载体系列,用这类载体表达出的外源蛋白以GST融合蛋白的形式存在,以Glutathione Sepharose 4B 柱亲和层析得以纯化。 本实验将以PGEX4T—3为载体,在大肠杆菌BL21DE3菌株中表达外源蛋白OsWAK2为例介绍蛋白的表达与纯化。 实验方法与步骤: 一:目的蛋白的粗提 1.构建载体,转化BL21DE3宿主菌感受态细胞 2.挑单菌落于10ml 含有60ug/ ml的液体LB培养基中37℃200rpm摇培16—18小时3.取5 ml摇好的菌液加到250 ml备好的含有60ug/ ml的液体LB培养基中37℃200rpm 摇培,至对数生长中后期

原核表达融合蛋白

原核表达融合蛋白 广义的原核表达,是指发生在原核生物内的基因表达。狭义的原核表达,常出现于生物工程中。是指通过基因克隆技术,将外源目的基因,通过构建表达载体并导入表达菌株的方法,使其在特定原核生物或细胞内表达。 表达载体:为了获得高水平的基因表达产物,人们通过综合考虑控制转录、翻译、蛋白质稳定性及向胞外分泌等诸多方面的因素,设计出了许多具有不同特点的表达载体,以满足表达不同性质、不同要求的目的基因的需要。通常关心的表达载体质粒上的元件包括:启动子、多克隆位点、终止密码、融合Tag(如果有的话)、复制子、筛选标记或报告基因等。现在常用的pET表达系统以及GST-融合蛋白表达系统。 复制子:通常表达载体都会选用高拷贝的复制子。pSC101类质粒是严谨方式复制,拷贝数低,pCoE1,pMBI(pUC)类的复制子的拷贝数高达500以上,是表达载体常用的。通常情况下质粒拷贝数和表达量是非线性的正相关,当然也不是越多越好,超过细胞的承受范围反而会损害细胞的生长。如果碰巧需要2个质粒共转化,就要考虑复制元是否相容的问题。 筛选标记和报告基因:氨苄青霉素抗性是最常见的筛选标记,卡那霉素或者是新霉素次之,通常是另一个载体的筛选标记用。四环素,红霉素和氯霉素等已经日渐式微。抗性基因的选择要注意是否会对研究对象产生干扰,比如代谢研究中要留意抗性基因编码的酶是否和代谢物相互作用。在表达筛选中要注意的问题应该就是LB倒板前加抗生素的温度,温度过高容易导致抗生素失效。对于做表达来说,如果不是要研究启动子的强弱,通常比较少关心或者用到报告基因吧。绿色荧光蛋白是最常用的报告基因了。其他还有半乳糖苷酶、荧光素酶等。一些融合表达Tag也有报告基因的功能。 启动子:启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一。从转录模式上看有组成型表达和诱导调控型表达。lac和Tac,PL和PR,T7是最常用的启动子。 终止子:转录终止子对外源基因在大肠杆菌中的高效表达有重要作用,即控制转录的RNA长度提高稳定性,避免质粒上异常表达导致质粒稳定性下降。放在启动子上游的转录终止子还可以防止其他启动子的通读,降低本底。转录终止子有两类,Rho因子作用下使转录终止mRNA和根据模版上的对称序列形成发夹结构而终止mRNA。常见的是rrnB rRNA操纵子的T1T2串连转录终止子。 核糖体结合位点:启动子下游从转录起始位点开始延伸的一段碱基序列,其中能与rRNA16S亚基3'端互补的SD序列对形成翻译起始复合物是必需的,多数载体启动子下游都有SD序列,也有些载体没有。 表达菌株:表达菌株是我们往往最容易忽视的一点。目前绝大多数重要的目的基因都是在大肠杆菌中表达的。不同的表达载体对应有不同的表达菌株,一些特别设计的菌株更有助于解决一些表达难题。将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点: 易于生长和控制;用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵;有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是,在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工,常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用,原核表达载体通常为质粒,典型的表达载体应具有以下几种元件: (1)选择标志的编码序列; (2)可控转录的启动子; (3)转录调控序列(转录终止子,核糖体结合位点);

原核表达步骤

Chi l 原核表达基本试验步骤 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点:易于生长和控制;用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵;有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是,在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工,常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用,原核表达载体通常为质粒,典型的表达载体应具有以下几种元件: (1)选择标志的编码序列; (2)可控转录的启动子; (3)转录调控序列(转录终止子,核糖体结合位点); (4)一个多限制酶切位点接头; (5)宿主体内自主复制的序列。 原核表达一般程序如下:获得目的基因-准备表达载体-将目的基因插入表达载体中(测序验证)-转化表达宿主菌-诱导靶蛋白的表达-表达蛋白的分析-扩增、纯化、进一步检测,其中包括: 一、试剂准备 (1)LB培养基。 (2)1M IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷):2.38g IPTG溶于10ml ddH2O

中,0.22μm滤膜抽滤,-20℃保存。 CCY的IPTG是1M的,用时进行1000倍稀释。 二、操作步骤 (一)获得目的基因 1、通过PCR方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法:用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA,以mRNA 为模板,逆转录形成cDNA第一链,以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 (二)构建重组表达载体 1、载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收,在T4DNA连接酶作用下连接入载体。我们用Soultion I连接。 (三)获得含重组表达质粒的表达菌种 1、将连接产物转化大肠杆菌BL21,根据重组载体的标志(抗Amp或蓝白斑)作筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定。 2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆,重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。

大规模可溶性蛋白原核表达与纯化步骤

大规模可溶性蛋白纯化实验操作 Hao Lab in SII 1. 取20 μL E.coli BL21目的菌种加入装有10 ml LB培养基的50 ml离心管中,加入氨苄青霉素(Biobasic inc, #AB0028) 至终浓度为100 μg/ml或硫酸卡那霉素(生工,#0408) 至终浓度为50 μg/ml,37°C, 250 rpm, 摇菌过夜。 2. 取过夜培养的菌液8 ml加入400 ml (1:50) 含有相同浓度抗生素的LB中培养,间断检测菌液OD600值,37°C, 250 rpm, 摇菌大约60~120 min,待其OD600值达到0.6~0.8之间,加入0.4 mM IPTG (碧云天,#ST098), 30°C, 220 rpm, 诱导表达3 h。 3. 收集菌液至50 ml离心管中,7,000 × g, 4°C离心3 min, 弃上清收集沉淀,进行下步实验或置于-80°C冰箱保存。 摇菌用的锥形瓶用84消毒液浸泡或高压灭菌。 4. 将收集到的菌体重悬于20 ml 冰冷的Lysis buffer中,震荡混匀。以下步骤均置于冰上。 5. 向菌体重悬液加入甘油至终浓度为10%,加入EDTA 至终浓度为0.5 mM,充分混匀。 6. 冰上超声:功率为仪器最大功率的60%,脉冲时间为1 s,间隔时间为1 s,总时间7~15 min。 7. 超声后的蛋白溶液于8,000 × g,4°C离心30 min。 15,000 × g, 4°C离心15 min可省略步骤10。 8. 在步骤7离心的同时。取下20 ml新层析柱(Qiagen, #34964)的帽子并剪掉底部尖端再盖上帽子,加入混匀的50% NI-NTA beads (Qiagen, #S13-26-36-46; GST beads, GE, #17-0756-01) 悬液2 ml。 9. 取下层析柱的帽子使NI-NTA beads重悬液体流净再盖上帽子,加入PBS至总体积约20 ml,用5 ml 移液器轻柔吹打混匀(避免气泡产生),静置5 min之后取下层析柱的帽子将液体放空并盖上帽子,重复二次。 10. 取步骤7,离心后的上清用0.45 μm滤器(Millipore, #SLGP033RS) 过滤,滤液置于50 ml离心管中。 11. 取适量蛋白溶液将NI-NTA beads重悬并转移到装有蛋白溶液的50 ml离心管中。4°C摇荡过夜。空的层析柱加入约10 ml PBS,4°C保存。 12. 将摇荡过夜的beads和蛋白混合液以50 × g, 4°C离心1 min使beads沉淀。 保留上清于4°C冰箱,可以考虑用旧的beads做二次结合。 13. 用10 ml PBS重悬beads, 50 × g, 4°C离心1 min, 弃上清,重复一次。再以20 ml wash buffer 重悬,装入层析柱中,静置5 min, 取下层析柱的帽子,收集0.5 ml流出的液体并保存于2ml离心管中待检测,标记为20W-1,剩余液体流空再盖上帽子。 14. 用20 ml wash buffer重悬NI-NTA beads,静置5 min,取下层析柱的帽子,流空液体,盖上帽子。 15. 用20 ml wash buffer重悬NI-NTA beads,静置5 min,取下层析柱的帽子收集0.5ml流出的液体并保存于2ml离心管中待检测,标记为20W-3,剩余液体液体流空,盖上帽子。 16. 加入5 ml Elution buffer重悬NI-NTA beads,静置5 min,取下层析柱的帽子,收集液体,于15 ml新离心管中并留样品20 μl, 标记为E-1。为盖上帽子。用Nanodrop2000粗测蛋白浓度。再以3 ml Elution buffer 重复三次上述步骤,收集至另一新15 ml离心管中。 17. 回收beads: 洗脱后的NI-NTA beads以20 ml PBS重悬,静置5 min,取下层析柱的帽子,流空液体,盖上帽子。再以20 ml PBS重复两次上述步骤。再用20 ml 0.5 M NaOH重复一次,加入约10 ml 30%乙醇置于4°C保存。 19. 将16步得到的蛋白溶液加入3 KDa的15 ml超滤管(Millpore, #UFC900396)中, 4,000 × g, 4°C离心45 min进行超滤。倒掉超滤管底的废液,将约为15 ml PBS加入超滤管中,轻轻颠倒混匀,4,000 ×g, 4°C离心45 min,倒掉超滤管底的废液。重复超滤四次,最后一次离心1 h。 如果16步第一次收集的蛋白溶液粗测浓度大于0.5 mg/ml,可以先超滤第一次洗脱得到的5ml蛋白溶液,其它的再用同一个超滤管进行第二次超滤。 纯化后的蛋白溶液留样20 μl标为EC,加入终浓度为40%的甘油,每管100 μl分装,-80°C保存。 SDS-PAGE检测各样品的蛋白浓度及纯度。

原核表达步骤

原核表达步骤

Chi l 原核表达基本试验步骤 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点:易于生长和控制;用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵;有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是,在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工,常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用,原核表达载体通常为质粒,典型的表达载体应具有以下几种元件: (1)选择标志的编码序列; (2)可控转录的启动子; (3)转录调控序列(转录终止子,核糖体结合位点); (4)一个多限制酶切位点接头; (5)宿主体内自主复制的序列。 原核表达一般程序如下:获得目的基因-准备表达载体-将目的基因插入表达载体中(测序验证)-转化表达宿主菌-诱导靶蛋白的表达-表达蛋白的分析-扩增、纯化、进一步检测,其中包括: 一、试剂准备 (1)LB培养基。 (2)1M IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷):2.38g IPTG溶于10ml ddH2O

中,0.22μm滤膜抽滤,-20℃保存。 CCY的IPTG是1M的,用时进行1000倍稀释。 二、操作步骤 (一)获得目的基因 1、通过PCR方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法:用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA,以mRNA 为模板,逆转录形成cDNA第一链,以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 (二)构建重组表达载体 1、载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收,在T4DNA连接酶作用下连接入载体。我们用Soultion I连接。 (三)获得含重组表达质粒的表达菌种 1、将连接产物转化大肠杆菌BL21,根据重组载体的标志(抗Amp或蓝白斑)作筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定。 2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆,重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。

原核表达及纯化总结教学提纲

原核表达及纯化总结

His标签重组蛋白大量表达及纯化 一筛选及鉴定 1 将构建好的连接产物进行转化DH5α鉴定 表达载体和目的片段的连接一般为10μL连接体系,此步转化方法如下:取100μL DH5α感受态细胞,加入到10μL连接产物体系中 ↓ 冰上放置30min ↓ 42℃准确热激90秒 ↓ 冰上放置3min ↓ 加入300μL无Amp+ 的LB培养基,37℃ 100rpm/min振荡培养1h ↓ 将400μL菌液全部涂LB平板(含Amp+)水平放置30 min待菌液完全 吸收后, 在37℃温箱中倒置培养过夜(12~16 h),直至出现单菌落。 2 阳性克隆的PCR鉴定方法如下 挑取单菌落于200μL含Amp+LB培养基中(用2.0的离心管),摇床200rpm/min,37℃培养4h,待菌液浑浊后,取1μL做菌液PCR鉴定。 PCR扩增体系如下: 取1 μL菌液作为模板 反应体系如下: 模板 1 μL 10×PCR反应缓冲液(含Mg2+) 2 μL

dNTP(2.5 mmol/L/each) 1.6 μL 上游引物(10 μmol/L) 1 μL 下游引物(10 μmol/L) 1 μL Taq酶(5 U/μL)0.3 μL ddH2O 13.1μL Total 20 μL 条件: 94℃预变性 10min 94℃变性 45s 50℃退火 45s 72℃延伸 1min,30个循环的扩增反应 72℃延伸 10 min 4℃∞ 1%琼脂糖凝胶电泳检测: 电泳上样时:Marker DL2000上样3μL 样品(1μL loadingbuffer +6μL PCR产物混匀上样) 100V,20min;紫外透射仪检测,出现目的带的对应菌落为阳性克隆。 (注意:记得保存菌种) 3 阳性克隆质粒抽提 取阳性克隆菌液200μL,加3ml含Amp+ LB液体培养基,37℃ 200rpm/min 培养3-4h,待菌液浑浊后,进行质粒抽提。 质粒抽提方法如下: 取1.5mL菌液于1.5mL离心管中 ↓ 12000rpm离心30s,弃上清 ↓

原核表达步骤总结

原核表达步骤 原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上,然后通过转化到 JM109或BL21等菌株中,诱导表达蛋白,然后进行蛋白纯化。本实验方案的前提是,目的基因已克隆到载体,并已转进入JM109菌株中。 1.鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌JM109或BL21中大量表达 (1)制样 1 . 挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于700ul LB培养基,加入0.7ul Amp(100mg/mL),37o C200r/min摇床培养,过夜活化。 2. 以1:50比例(200ul),将活化的过夜培养物加入10mL LB液体培养基中,加入10uLAmp(100mg/ml),37o C200r/min摇床扩大培养2h-3h,期间取样监控菌液的OD值,控制菌液OD600在0.6-1.0之间,以使大肠杆菌处于最适合表达外源蛋白的生长状态。(一般3h时,菌液浓度及达到标准,但是不同的基因对菌的影响不同,所以第一次实验时需要确定这个最佳时间) 3. 从10ml扩大培养物中取3ml菌液作为不加IPTG的空白对照(CK),其余7ml菌液加入7ul IPTG(储存浓度为0.5mol/l),使IPTG 终浓度达到0.5mmol/l。以200r/min的转速,37o C摇床培养3h。 4. 以5000r/min离心2min收集菌体,倾倒上清,每个离心管收集3ml培养物。 5. 加入1ml dH2O,将管底沉淀用振荡器打散以充分洗涤,8000r/min 离心2min,倾倒上清。 6. 重复步骤5。将离心管中的水倒干净。 (二)菌落SDS-PAGE 1. 在收集的菌体中加入200ul 1×SDS PAGE loading buffer(可根据沉淀的量增加或减少loading buffer的量,一般200ul比较合适)。用漩涡器剧烈震荡,确保将管底沉淀震散。 2. 将样品于100℃恒温加热器上开盖加热10min(Marker也要加热)。样品凉后,12000r/min离心3min,取每管的上清点样。上样量一般30ul—40ul,marker 20ul。 (3)SDS-PAGE分析 1. 根据目的片段的大小,制作不同浓度的分离胶 蛋白分子量 (kDa)凝胶浓度 (%) 4-4020

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