myostatin基因打靶的成肌细胞制备
中国生物工程杂志 China B i otechnol ogy,2009,29(7):22～26
m yosta tin 基因打靶的成肌细胞制备
3
张 蕾
133
杨兴元2 安晓荣2 陈永福
2
(1辽宁医学院 锦州 121000 2中国农业大学生物学院农业生物技术国家重点实验室 北京 100094)
摘要 Myostatin (MST N ),β2转化生长因子超家族的一员,是肌肉生长的负调控因子,该基因自然突变的比利时蓝牛和皮尔蒙特牛出现双肌性状。基因敲除该基因,是实现家畜产肉量的提高的有效方法。通过建立无启动子打靶载体MST N 2GFP,MST N 2neo,转染新生和胎儿绵羊骨骼肌细胞,经过表达绿色荧光蛋白报告基因和G418筛选获得骨骼肌细胞克隆,PCR,Southern bl ot,DNA 序列检测获得阳性细胞克隆,为制备m yostatin 基因敲除的体细胞克隆绵羊提供核移植供体。关键词 基因打靶 myostatin 成肌细胞
中图分类号 Q813
收稿日期:2008212215 修回日期:2009201213
3国家“863”计划资助项目(2002AA206311)33电子信箱:zhbud@hot m ail .com
在过去的二十年里,利用同源重组和胚胎干细胞技术,使在小鼠体内进行任何必要的基因突变成为可能
[1]
。然而,成功用在小鼠身上的基因打靶方法技术
却不适用在家畜类,原因有二,一是家畜类动物的胚胎干细胞至今还没有被分离并确认,另外,由于家畜类动物的生殖、生长周期相对较长,获得基因打靶成功的同源基因位点需要相对更长的时间。McCreath 等
[1]
利用
体外培养的绵羊胎儿成纤维细胞进行基因打靶,并利用打靶成功的细胞作为体细胞克隆的核移核供体,已经成功获得基因位点修饰的活的小羊。这项“壮举”立即为大家畜的基因组修饰开辟了一个新的途径。 M yostatin (MST N )是肌肉抑制素基因,主要功能是控制动物肌肉的生长。M yostatin 基因突变的比利时兰牛和皮尔蒙特牛过度发育的肌肉已经为大家熟知
[2]
。
这对于家畜增加产肉量具有非常大的意义。小尾寒羊自身产子率高,但产肉率低,选择小尾寒羊作为MST N 打靶的研究对象,生产出产子率高,产肉量也高的超级绵羊,是对培育优良家畜品种的有效手段。
1 材料与方法
1.1 材 料
脂质体L ipofecT AM I N T M 、G418和胎牛血清
(F BS )、培养基为Gibco 公司产品,96孔板、24孔板均
为Nunc 公司产品,培养皿及细胞冻存管均为Com ing 或Nunc 公司产品,PBS 、胰蛋白酶、EDT A 、DMS O 均为
Sig ma 公司产品,蛋白酶K 为Merck 公司产品,dNTP 购
于上海生物工程公司,TaqDNA 酶购于TaKaRa 公司。其它无机盐均为Sig ma 公司产品。
小尾寒羊由中国农业大学农业生物技术国家重点实验室提供。
1.2 方 法
1.2.1 无启动子基因打靶载体的构建 构建好的无启
动子打靶载体MST N 2neo 、MST N 2GFP 的构建如图1所示。用Aat II 酶切载体MST N 2Neo (GFP ),使之线性化,纯化后以脂质体转染体外培养的原代绵羊成肌细胞。
1.2.2 原代绵羊成肌细胞的培养、选择性纯化及鉴定
取妊娠50天的雄性羊胎儿及新生3～5天的雄性小尾寒羊后腿伸肌组织块,剪碎,用0.25%胰蛋白酶液于37℃消化15m in,过尼龙筛网,滤液离心沉淀细胞,用培养液重悬细胞沉淀,将细胞悬液转移至胶原包被的培养皿中,置于37℃,5%CO 2,用包括Ham ’s 2F10培养基,15%的FBS 和bFGF 的培养液培养箱中培养。上述步骤重复3～5次以富集细胞。同时应用含有20%胎牛血清DME M 培养基,作为阴性对照以富集原代培养的成肌细胞。骨骼肌细胞的贴壁速度较非肌源性细胞慢,差速贴壁处理获得高纯度的肌源性细胞。体外培养成肌细胞经过数次传代后,检测成肌细胞特异性表达蛋白Des m in,以鉴定成肌细胞的纯度。
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1.2.3 脂质体转染原代绵羊成肌细胞 4μg线性MST N2neo分别转染4×105胎儿绵羊成肌细胞和等量的新生羊成肌细胞,经G418筛选6～10天,筛选过程中两种受体细胞均分出一半细胞培养液加入10%FCS,为了比较血清含量对药物筛选对细胞伤害的保护作用,筛选过程中分别加入15%、20%、25%的胎牛血清进行比较(表1)。分离细胞克隆至35mm培养皿扩大培养。
4μg线性MST N2GFP转染4×106新生绵羊成肌细胞,相同条件下对照组转染pEGFP2N1载体,转染后24h开始观察细胞发光情况,观察细胞形态。
1.2.4 阳性细胞克隆的分子检测 PCR检测阳性细胞克隆:引物位置如图1,检测MST N2Neo转染后阳性克隆引物序列1:5′2CTCCTTTCTTCAGGTG CATTTTT AC23′;2: 5′2G ATTGTCTGTTGTG CCCAGTCAT AG23′。反应条件:第一步:95℃5m in,第二步:94℃30s,第三步:56℃40s,第四步:72℃2m in,第五步:72℃10m in,:第六步:4℃10m in,第二步至第四部共重复35次。检测MST N2GFP 转染后阳性克隆引物序列3同序列1,引物4:5′2 TG AAG CACTGCACG CCGT AGGT CAG23′,反应条件除了退火温度为58℃40s外,其他步骤均同MST N2Neo。
Southern bl otting分析[3]:探针设计为32P标记的m yostatin基因3′同源序列下游的一段900bp的非编码区DNA。
1.2.5 打靶阳性细胞克隆重组部分基因序列分析 获得的阳性克隆进行重组序列基因分析,MST N基因外显子3的123bp核苷酸被标记基因GFP(或neo)替代(图4)。
2 结 果
2.1 观察M STN2GFP载体转染后细胞发光情况及
PCR检测
无启动子打靶载体MST N2GFP转染后,阳性细胞中载体上的GFP基因从起始密码子至终止密码子序列置换MST N外显子3的一段。转染后24小时开始观察细胞发光情况,对照组转染pEGFP2N1载体的细胞发光率大概在30%,实验组转染MST N2GFP载体每2×105新生羊骨骼肌受体细胞中平均有3～4个发出绿色荧光,细胞形态基本正常,连续传5代之内仍继续发光(图2a,图2b),冻存细胞,以待用流式细胞仪分离出发光细胞,克隆后取足够的DNA进行PCR分子鉴定。引物位置见图1,上游引物(F1)与GFP中段的序列同源,下游引物(F2)与同源短臂下游的一段DNA序列互补,阳性克隆应扩增出1.5kb
的片段。
图1 打靶载体的构建及打靶位点
F i g.1 Targeti n g vector con structi on s
and t argeti n g locus
The diagra m s of MST N2l ocus(the t op line)and the targeting vect or constructi on(second line).Grey boxes rep resent neo(GFP)sequence. The white boxes mean5′and3′untranslated sequence.Locati on of PCR p ri m ers(F1,F2),the external p r obes for Southern bl ot analysis are shown.Restricti on enzy me site:S,SphⅠ;X,X baⅠ
2.2 打靶载体M STN2neo定点整和的PCR检测
MST N2neo转染后经G418筛选,筛选过程中分别加入15%、20%、25%的胎牛血清进行比较,获得克隆数见表1,结果显示在筛选过程中过程中加入20%的胎牛血清获得更多的细胞克隆。最终共获得127个细胞克隆。
表1 M STN2neo转染后经药物筛选时不同
血清浓度培养条件获得的细胞克隆数
及转染效率比较
Table1 Colony growth of Ch i n a2Han ov i n e m yobl a st w ith seru m concen tra ti on follow i n g tran sfecti on w ith
t argeti n g vectorsM STN2neo and then drug selecti on
Seru m
concentrati on
NO.cl ones picked up
f oll o win
g selecti on
NO.gene targeting
successfully
Targeting
efficiency(%) 15%2428.33
20%65712.31
25%3837.89
获得单克隆细胞,扩大培养,快速提取基因组DNA,用引物P1、P2进行扩增,引物位置见图1,大致与F1、F2相同(二者下游引物位置相同,上游引物P1与Neo中段序列同源)。阳性克隆应得到大约1.6kb的特意性扩增条带(图3a)。
2.3 PCR阳性克隆的Southern blotti n g分析
取PCR检测阳性的细胞的经Southern bl otting分
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析,用X ba Ⅰ、Sph Ⅰ双酶切正常小尾寒羊基因组DNA 作为对照和PCR 阳性细胞基因组DNA ,进行Southern 杂交时,未转染打靶载体的对照基因组DNA 应杂出
5.2kb 的一条带,而定点整合的打靶阳性克隆由于用Neo 的DNA 序列代替了m yostatin 基因第三外显子的部
分片段,而引进了一个Sph Ⅰ酶切位点,这样杂交时就可以杂出1.2kb 的阳性条带,结果所有克隆均检测出
5.2kb 的片段(图3b ),该片段来自正常MST N 位点,另
外显示的1.2kb 一个阳性条带是打靶阳性位点,说明
MST N 的一条等位基因已经成功同源重组。
2.4 打靶阳性细胞克隆5′重组部分基因序列分析
分离以上检测阳性的克隆,PCR 检测5′端重组部分基因序列,MST N 外显子3的123b P 核苷酸被标志基因GFP (或neo )取代,测序结果显示阳性克隆的
MST N 基因外显子3的5’
端部分核苷酸下游为标记基
因GFP (或neo ),证明阳性克隆基因重组成功(图4)
。
图4 打靶阳性细胞克隆5′重组部分基因序列分析
F i g .4 Nucleoti de sequence aross the 5′end of
reco m b i n a ti on zone i n t arget cell clones
The t w o up stream p ri m er of t w o vect or used f or PCR.Uppercase letters and downward arr owhead indicates the boundary bet w een exon3and marker gene .The translati on start code ATG were boxed .
(a )DNA sequence fr om cl one tranfected with MST N -GFP vect or (b )DNA sequence fr om cl one tranfected with MST N -neo vect or
3 讨 论
3.1 小尾寒羊骨骼肌细胞m yosta tin 基因打靶的优势
绵羊m yostatin 基因适合在骨骼肌细胞中打靶有以下个原因。第一,m yosta tin 基因在骨骼肌中特异性表达,这样就允许我们利用无启动子富集基因打靶事件。
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2
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第二,m yostatin基因的突变主要造成肌肉组织发育的紊乱,对于其他组织的影响不大,在大动物建立基因打靶模型比在小鼠中打靶对于畜牧业发展更有价值。本研究采用的是小尾寒羊,其特点是产子率高,在正常情况下母羊每次能产3～5个羔羊,这一特点是其受农民欢迎的主要有价值的优点。但它的产肉率低,虽然与肉羊品种杂交可以提高产肉率,但杂交后产子率高的优点在杂交后两代中将完全丧失。利用m yosta tin基因在体细胞打靶使其活性下降,从而使原有的品种获得新的优势成为可能。新品种将兼备产子率高和产肉率高的特性。因此为探讨m yostatin基因是否可以通过骨骼肌细胞打靶来获得调控的研究是有价值的。
3.2 绵羊m yosta tin基因打靶极其鉴定
图1展示了对绵羊m yostatin基因打靶的全过程。实验中首先是建立两个无启动子打靶载体,其报告基因和筛选基因分别是GFP和Neo,报告基因本身不含有启动子序列,其两侧分别装上基因打靶用的同源臂。通过同源重组的原理用同源臂之间的报告基因序列准确地代替m yosta tin基因的高度保守的第三外显子的部分序列,这样打靶成功的细胞将利用m yostatin基因的启动子启动报告基因的表达,从而使打靶成功的细胞能够发出荧光或在含有G418的培养液中成功的活下来。无论使用置换型载体还是插入型载体,无启动子打靶载体策略的选择可以使阳性细胞克隆的富集率提高100倍[5]。
对控制筛选过程的生物学参数的系统性评价表明,一个成功的策略必须使筛选基因与靶基因的表达水平、标记基因的效率及筛选严谨性相匹配[6]。打靶载体中,不同的标记基因,不同的受体细胞以及不同的打靶位点都影响标记基因的表达水平。本实验观察到用MST N2GFP无启动子打靶载体转染小尾寒羊胎儿骨骼肌细胞,每105个受体细胞可获得3～4个细胞发出绿色荧光,打靶效率为8/34。GFP阳性细胞已被扩增、保存并用来做核移植。由于这些细胞没有经过G418的筛选,复制、增殖情况比经G418筛选的细胞要好得多,而且用它们进行核移植可在获得动物胚胎时利用足够的细胞进行分子检测。
在打靶过程中许多细胞克隆在经历了G418筛选[7]后将会老化,DNA转染及药物的筛选会影响细胞的增殖和传代能力。除此之外,骨骼肌原代细胞对培养过程中的外界刺激比成纤维细胞敏感得多,对弱的干扰因素,诸如在显微镜观察时受到的光照刺激、更换培养液或多加入一些细胞等,都可能产生剧烈的收缩反应,从而导致整个单细胞层从生长的培养皿壁上不可逆剥离,使有些克隆不能获得足够的基因组DNA进行分子检测而损失,这也是造成骨骼肌细胞与成纤维细胞及其他细胞相比打靶效率不高的一个因素。有报道说药物筛选过程中提高血清浓度可以解决由于药物筛选对胎儿成纤维细胞繁殖的不利影响[8]。本研究中比较了在G418筛选过程中,加入15%和20%FCS的效果,结果显示在同等条件下,用含有20%FCS培养液获得的细胞克隆比用15%FCS培养液获得的细胞克隆多,状态也较好。同时,比较了利用胎儿骨骼肌细胞和新生羊骨骼肌细胞作为受体细胞进行打靶,在同等条件下G418筛选后,所获得的细胞克隆中来自胎儿骨骼肌细胞的细胞克隆数占大概2/3,而且打靶阳性细胞克隆也是来自胎儿骨骼肌细胞。因此不能肯定是否是基因型或组织年龄是造成这一差别的直接原因。
由以上的结果可以看出,在绵羊骨骼肌细胞中进行m yosatin基因的打靶技术路线是可行的。但是,要想取得最后的成功,还要解决许多技术难题,其中最主要的还是细胞寿命问题。虽然目前有很多方法可以延长体外培养细胞的寿命,例如:用L2肌肽(β2丙氨酰基2L2组氨酸)处理细胞或用编码人端粒酶(hTERT)基因转染细胞等[9～12],但是,要彻底解决此问题还需要科学家不懈的努力和探索。
参考文献
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The Con struct of M yosta tin Gene Targeted Rec i p i en t M yobl a st Cell
Z HANG Lei1 Y ANG Xing2yuan2 AN Xiao2r ong2 CHE N Yong2fu2
(1L iaoningMedical University,J inzhou 121000,China)
(2State Key Laborat ory f or Agr obi otechnol ogy,College of B i ol ogy,China Agricultural University,Beijing 100094,China)
Abstract Myostatin(MST N),a me mber of the transf or m ing gr owth fact or2β(TGF2β)superfa m ily,has been shown t o be a negative regulat or of myogenesis.Natural mutati on in beef cattle causes double2muscling phenotypes.An investigati on designed t o knock out the myostatin gene by gene targeting in ovine myoblast cells were reported.T wo p r omoter2trap targeting vect ors MST N2GFP and MST N2Neo were constructed and used t o transfect fetal and neonatal ovine p ri m ary myoblast cells.Both GFP exp ressing cells and drug resistant cells were obtained.Targeted cells exp ressing GFP were confir med by PCR assay and drug resistant cells were characterized by PCR,Southern bl ot and DNA sequnce detecti on after gr owing int o cell cl ones.That would supp ly nuleus trans p lantati on donat or for my ostatin gene targetted s omatic cl oning sheep.
Key words Gene targeting Myostatin Myoblast cell
致谢
近期为本刊审稿的专家(按姓氏笔画顺序排列):
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刘纯杰 刘佳佳 刘晓兰 孙宗修 江 宁 何金生 张兆山 张博润 李元广 李 玲
杜 杰 邱德有 陈忠斌 欧阳静萍 金宁一 侯丙凯 赵建龙 唐克轩 徐 虹 秦卓明
顾 军 曹泽虹 梁前进 阎锡蕴 黄秉仁 储 炬 强 胜 温博海 董关木 路福平
潘 杰 潘武宾 颜 山
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破骨细胞与成骨细胞
破骨细胞 (osteoclast，亦称bone-resorbing cells)是骨组织成分的一种，行使骨吸收（bone resorption）的功能。破骨细胞与成骨细胞（osteoblast，亦称bone-forming cells）在功能上相对应。二者协同，在骨骼的发育和形成过程中发挥重要作用。高表达的抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase）和组织蛋白酶K（cathepsin K）是破骨细胞主要标志。 破骨细胞由多核巨细胞(multinuclear giant cell, MNGC)组成，直径100μm，含有2～50个紧密堆积的核，主要分布在骨质表面、骨内血管通道周围。由多个单核细胞融合而成的，胞浆嗜碱性但随着细胞的老化，渐变为嗜酸性。 作用 破骨细胞具有特殊的吸收功能，某些局部炎症病灶吸收中，巨噬细胞也参与骨吸收过程。 在破骨细胞吸收骨基质的有机物和矿质的过程中，造成基质表面不规则，形成近似细胞形状的陷窝，称为Howship 陷窝。在陷窝内对着骨质的
一面，细胞伸出许多毛样突起，很象上皮细胞表面的纵纹缘和刷毛缘。电镜下，贴近骨质的一侧有许多不规则的微绒毛，即细胞突起，称为皱褶缘(ruffled border)。在皱褶缘区的周缘有一环形的胞质区，含多量微丝，但缺乏其它细胞器，称为亮区(clear zone)，此处的细胞膜平整并紧贴在骨质的表面。亮区犹如一道以胞质构成的围墙，将所包围的区域形成一个微环境。破骨细胞向局部释放乳酸及柠檬酸等，在酸性条件下，骨内无机矿物质自皱褶缘吞饮，于皱褶缘基质内形成一些吞饮泡或吞噬泡。于破骨细胞内，无机质被降解，以钙离子的形式排入血流中。无机质的丢失使骨基质内的胶原纤维裸露，破骨细胞分泌多种溶酶体酶，特别是组织蛋白酶K和胶原溶解组织蛋白酶。破骨细胞离开骨表面后，其皱褶缘消失，细胞内发生变化，进入静止期。 成骨细胞 成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。骨不断地进行着重建，骨重建过程包括破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌
成骨细胞分化调控概览
The Regulatory Landscape of Osteogenic Differentiation Abstract 间质干细胞（MSCs）向成骨细胞的分化是骨发育和动态平衡的一个完整的部分，当它被不恰当地调控时，可能产生疾病，比如骨癌或骨质疏松。利用无偏倚的高通量方法，我们描述了在人类MSCs向骨谱系分化的过程中，基因表达，组蛋白修饰，以及DNA甲基化方面整体改变的图景。此外，我们第一次提供了一份基因组范围上的，关于骨主要调控转录因子Runt相关转录因子2（RUNX2）在人类成骨细胞中DNA结合位点的描述，显示出目标基因与增殖，迁移及凋亡调控有关，并与p53调控的基因有明显的重叠。这些发现扩展了正在出现的证据，这些证据是关于RUNX2在癌症，包括骨代谢，以及p53调控网络中有作用的。 我们进一步揭示了RUNX2结合在远端的调控元件，启动子上，还有很高的频率结合在基因的3’末尾上。最后，我们识别出了TEAD2和GTF2I是一种新的成骨调控因子。 Introduction 间质干细胞或者基质细胞（MSCs）有多谱系潜能，可以向成骨，成脂，成软骨，还有其它谱系分化 （1）。MSCs出现在骨髓和其它间质组织中，可能迁移到损伤或炎症处，参与组织修复 （2）。MSCs可在体外条件下被纯化并向成骨细胞分化，这为从分子上研究成骨提供了方便的工具 （1）。关于这一过程的更多知识，对基础研究及MSCs在骨骼再生医学上的临床应用都是十分重要的 （3），同样地，理解它在骨病中失调的情况也很重要，比如说癌症。
在这点上，非常有意思的是骨肉瘤，最常见的骨原发恶性肿瘤，可能是由基因及表观遗传上的改变打断了MSCs向成骨的分化所致 （4）。 干细胞分化受基因表达的变化所高度调控，这种变化在转录水平上与DNA 或染色质结合在转录调控子上有关，或是与染色质图像的局部改变有关 （5~7）。高通量方法的发展，比如RNA测序（RNA-Seq），以及染色质免疫沉淀及测序（CHIP-Seq），使人们可以对这种改变。 在基因组水平上进行描述（8，9）举例来说，RNA-Seq可以系统性地发现启动子与外显子的轮流使用 （10），而CHIP-Seq显示特定的组蛋白修饰区域，以及这些变化是如何改变基因活性的（5，8）。CHIP-Seq也使人们可以发现基因组结合位点，并为广泛的转录因子（TFs）寻找目标基因（11，12）。此外，综合基因组分析可以在整个基因组中识别功能区域，比如启动子和增强子，这些成果又可以被用来丰富新的转录因子结合位点（TFBS）分布，以帮助发现新的生物过程调控因子 （5）。 在单倍体RUNX2缺乏患者中的骨骼发育缺陷 （13），或是Runx2缺合子（nullizygous）小鼠中骨化骨的缺失（14，15），揭示了RUNT相关转录因子2（RUNX2，即CBFA1）对于骨的发育是不可或缺的。在成骨中，RUNX2涉及调控增殖，迁移，定型，以及向成骨谱系的分化（16~19）。RUNX2对上游信号起反应，调控基因的表达，这些上游信号包括TGFB，BMP及Wnt信号通路（20~23）；但是，成骨细胞中的下游目标被描述得就没有那么好。除了它在发育和失调中的作用，RUNX2还为人所知的是涉及肿瘤形成；RUNX2与MYC原癌基因协同，在造血谱系中启动瘤变发生 （24），近期的证据提示在乳腺癌和前列腺癌细胞中，RUNX2的肿瘤生长和代谢属性（25~27）。在骨肉瘤中，RUNX2常常是过度表达的，这与预后不良有联系
转基因小鼠肿瘤模型的研究进展_百替生物
转基因小鼠肿瘤模型的研究进展 沈富毅，潘隽玮，郁嘉伦，余昂，侯晓骏 [摘要]动物模型在肿瘤病因的揭示，发病机理的探索以及治疗措施的评估中有着不可替代的重要作用。继常规转基因方法之后，可诱导表达转基因、基因打靶、条件性基因打靶以及基因捕获等技术的出现及其在肿瘤模型建立中的应用为我们提供了大量能较好模拟人体相应肿瘤的动物模型，极大地深化了我们对肿瘤生物学行为的认识，并有助于人们找到攻克肿瘤的办法。 [关键词]肿瘤，小鼠模型，转基因 肿瘤是一类严重危害人类健康及生命的重大疾病，动物模型在肿瘤病因、发病机理的揭示以及治疗措施的评价中发挥着不可替代的作用。肿瘤动物模型最早源自小鼠自发突变系或经致癌剂诱变而得，对它们的研究使我们对环境致癌物及其代谢活动机理有了一定的认识；但自发突变频率在自然状态下通常很低，而诱发模型也因其不可精确控制性而限制了它们的应用。在过去的二十多年里，随着人们对癌基因激活或抑癌基因失活在肿瘤发生发展中作用的认识日益深入，以及近年发展起来的小鼠生殖系引入可诱导或精细调控突变技术的应用，小鼠肿瘤模型的建立工作取得了突破性进展，本文就此作一简要综述。 1.常规转基因（transgenic） 上世纪80年代初发展起来的原核显微注射技术，使我们可以将外源DNA直接导入小鼠生殖系以构建转基因动物模型。目的基因在合适启动子驱动下表达，可赋予转基因动物新的表型，通过其表型分析可识别研究基因的功能。转基因动物技术在肿瘤研究中的主要作用就是建立转基因的肿瘤动物模型，该研究始于1974年，Jaenisch等1用显微注射法将多瘤病毒SV40的DNA导入到小鼠的囊胚（blastocyst）中，在子代小鼠的肝、肾组织中检测到了SV40的DNA。这一结果证明，将外源基因导入胚胎细胞中并实现整合是可能的。以后相继有人用同样的方法实现了外源基因向小鼠受精卵的转移，并能遗传给后代。在基因转移的方法上相继出现了逆转录病毒载体法、电脉冲法等。1985年，Adams2等用转基因方法首次构建了B淋巴瘤myc癌基因易位的小鼠模型，此后10年，陆续发展了针对各种类型恶性肿瘤的转基因小鼠研究。如今这项技术运用较为成熟的是，利用免疫球蛋白启动子调控的c-myc基因在转基因小鼠中的表达，导致早期淋巴瘤的发生3。在LTR/c-myc转基因小鼠模型中，利用哺乳类动物肿瘤病毒长末端重复序列（LTR）驱动c-myc广谱的表达，可造成多种组织形成肿瘤，如睾丸、乳腺和淋巴系。1984年Stewart把小鼠乳腺癌病毒（MMTV）的增强子与myc基因或ras基因连接,形成的MMTV-myc转基因小鼠和MMTV/V-Ha-Ras转基因小鼠都有高的乳腺癌发生率4。近年来，这项技术更多的运用于肿瘤发生机制的探索上。Li等5构建了乳腺癌WAP-Tag转基因小鼠模型，该模型由小鼠乳清酸蛋白WAP启动子和SV40大T抗原构建而成，可用于乳腺癌变过程中细胞的增殖与凋亡、DNA突变及修复机制等方面的研究。在慢性粒细胞性白血病(CML)的研究中，Heisterkamp等6构建的bcr-abl和crkl双转基因小鼠发病潜伏期及存活期均大大缩短，直接证明了crkl参与
神经递质P物质通过调控转录因子Osterix的表达促进成骨细胞分化
神经递质P物质通过调控转录因子 Osterix的表达促进成骨细胞分化 （作者:___________单位: ___________邮编: ___________） 作者：孙海飚，刘强，郭敏锋，张华平，陈君长 【摘要】目的研究神经递质P物质调控成骨细胞分化的分子途径。方法分离骨髓基质干细胞进行原代及传代培养；分别采用空白对照、P物质、P物质NK1受体拮抗剂、P物质+P物质NK1受体拮抗剂进行干预,诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞分化；传代培养1～2周后，抽提细胞总RNA，用RT PCR检测分化过程中Osterix基因的表达。检测结果重复3次,采用单因素方差分析检测结果。结果骨髓基质干细胞在生长对数增殖期为4～6d，采用RT PCR检测发现P物质干预成骨细胞分化，导致成骨细胞分化过程中重要的转录引子Osterix 基因表达，与其他各组比较有显著差异(P0.05)，Osterix基因表达上调，从而刺激前成骨细胞向成骨细胞转化。而P物质+P物质NK1受体拮抗剂共同干预，Osterix基因表达与空白对照组无显著差异(P0.05)，说明P物质通过P物质NK1受体对成骨细胞分化进行调控。结论P物质可调控前成骨细胞分化过程中转录因子Osterix基因表
达促进其向成骨细胞分化。P物质对Osterix基因表达的调控依赖P 物质NK1受体。 【关键词】P物质；成骨细胞；分化；Osterix ABSTRACT: Objective To study the molecular pathway of osteoblastic differentiation induced by substance P (SP), a neurotransmitter. Methods Mesenchymal stem cells were isolated and cultured, and treated with SP or its receptor (NK1) antagonist to induce osteoblastic cell differentiation, respectively. Alkaline phosphatase activity was determined; Osterix gene expression was detected by RT PCR after 1-2 weeks for three times. The data of each culture condition were analyzed using SPSS12.0 statistical software to determine whether the differences between conditions were significant. Results After 4-5 days culture, bone marrow stromal cells became spindle shaped, triangular or polygonic. They covered the plate surface, formed extensive cell sheets in each group after 11-12 days of culture, and then induced differentiation to osteoblast. SP up regulated the important transcription factor Osterix gene expression significantly (P0.05). Conclusion The up regulation of Osterix gene expression by SP may stimulate osteoblastic cell differentiation. SP s regulation depends on its receptor NK1. KEY WORDS: substance P; osteoblast; differentiation;
破骨细胞分化成熟因子及其信号转导通路_黄晓斌
#综述# 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30400240) 作者单位:300192 天津,中国医学科学院中国协和医科大学放射医学研究所 通讯作者:黄晓斌,Email:HXB19800401@https://www.360docs.net/doc/d17071581.html, 破骨细胞分化成熟因子及其信号转导通路 黄晓斌 孙元明 李雨民 杨福军 摘要:破骨细胞从起源发育至成熟,再经活化发挥吸收作用是一个复杂的多级调控过程,始终都受到一系列细胞因子的影响。有些细胞因子对破骨细胞的成熟分化起促进作用,如:RANKL 、TNF -A 、IL -1、IL -6、1,25-(OH)2D 3、PTH 、M -CSF 等,其中RANKL 和M -CSF 是破骨细胞形成和分化过程中的两个必需的因子;有些因子起抑制作用,如:OPG 、IL -4、IL -10、雌激素、降钙素、TGF -B 等。OPG P RANK P RANKL 系统在破骨细胞分化成熟过程中起着枢纽作用,大部分细胞因子都直接或间接地通过OPG P RANK P RANKL 系统来发挥作用,其中还涉及到成骨细胞、破骨细胞、基质细胞等复杂的相互作用。介导破骨细胞分化成熟的各种细胞因子反应的信号传导路径主要包括MAPK 、NF -kappaB 、CN P NFAT 等通路,全面地了解破骨细胞因子及其信号传导通路,将有助于临床更好地分析各种骨代谢性疾病的病因及发病机制,进而为治疗提供理论依据。 关键词:破骨细胞;细胞因子;信号转导 The cytokines of osteoclast and their path o f signal transduction H U ANG Xiaobin ,SU N Yuanming ,LI Yumin ,et al .Department o f Biomedicine ,I nstitute of Radiation Medicine ,CAMS &PU MC ,Tian j in 300192,China Abstract :It is a complicated process that osteoclast differentiates from progenitor to mature osteoclast which have the function of bone resorption.There are series of cytokines and systemic hormones involved i n this phase.Some cytokines promote osteoclast developmen t,such as RANKL,TNF -A ,IL -1,IL -6,1、25-(OH)2D 3,PTH,M -CSF,and the list will go on,in which RANKL and M -CSF are essen tial.Other cytokines inhibi t osteoclast growth,such as OPG,IL -4,IL -10,estrogen,calcitonin,TGF -B ,and so on.The OPG P RANK P RANKL system is vi tal in the period.Most of cytokines play role through OPG P RANK P RANKL system directly or indi rectly.The interaction between osteoclast and os teoblast or stromal cell i s also important.There are several si gnal path ways such as MAPK,NF -kappaB and CN P NFAT,involved in osteoclast di fferentiation.Understanding the cytoki nes of osteoclast and path of signal transduction respectively make i t possible for us to comprehend the developmen t and the treatment of the bone metabolic diseases. Key words :Os teoelast;Cytokine;Si gnal transduction 骨是一不断更新的组织,骨吸收和骨形成的动态平衡维持着正常的骨代谢。骨吸收的主要细胞是破骨细胞(osteoclast,OC)。破骨细胞是体内高度专业化的细胞,来源于造血干细胞的单核-巨噬细胞前 体分支。破骨细胞前体细胞是单核细胞,含皱折缘。当这些单核细胞贴附于骨表面时,在一定的微环境中形成成熟的TRAP 阳性的多核破骨细胞。成熟的破骨细胞形态多为不规则的圆形或卵圆形,大小不 等,形状不一,直径约20~100L m,含有2~50个核,核膜光滑,染色质颗粒微细,分布均匀。破骨细胞在分化成熟过程中受到一系列细胞因子的影响。 1 破骨细胞分化成熟因子 111 肿瘤坏死因子超家族(tumor necrosis factors,TNFs) 破骨细胞分化成熟的过程中,有三个非常重要的因子,即骨保护素(OPG)、细胞核因子kappaB 受体活化因子(RANK)、细胞核因子kappaB 受体活化因子配基(RANKL),它们都是肿瘤坏死因子配体和受体家族成员,这三个因子所形成的OPG P RANKL P RANK 系统介导了OC 形成、分化过程中所必须的细
基因编辑技术简介
基因编辑技术学习总结 CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）是在细菌中发现的适应性免疫反应系统，能有效抵抗噬菌体等对细菌造成的损伤。这项机制被应用于基因编辑，是当前生物学的研究热点。 一、基因编辑技术的发展 基因编辑技术的发展可追溯到1968年I型限制性内切酶的发现，它可以识别DNA并随即剪切DNA，但由于不具有特异性而不能得到应用；1970年后具有识别特异性的Ⅱ型限制性内切酶被发现；1981年一种Ⅱ型限制性内切酶，FokI 在黄杆菌中被分离出来，成为了基因研究的重要工具。 FokI不同于一般的Ⅱ限制性内切酶（识别和剪切利用同一结构域，因而难以在保证剪切活性的条件下改变识别域），FokI的含有两个相对独立的结构域，N端为识别域，C端为剪切域；这种特性使得FokI可以通过对识别域的改造对DNA进行定点切割。在这种理论的基础上，发展出了ZFN——锌指核酸酶，TALEN ——转录激活样效应蛋白核酸酶；两种技术都是通过使能够识别DNA序列的蛋白与FokI相连实现基因的特异性切割，其不同在于锌指结构域通过约30个氨基酸对DNA三联体进行识别，而转录激活效应蛋白则是通过34个氨基酸组成的识别单体对不同核苷酸进行识别，因而TALEN的识别效率显著高于ZFN。然而它们都是利用利用蛋白进行DNA识别，并使用相同的剪切蛋白－FokI形成二聚体进行DNA剪切。 CRISPR的不同之处在于它利用RNA进行DNA识别，其识别效率优势显而易见；此外CRISPR技术不需要对识别域和限制性内切酶剪切域进行连接，因而设计简单，编辑高效。 CRISPR技术起源于1987年日本在细菌DNA中发现“重复－居间（spacer）－重复序列”，2002年命名为成簇规律性间隔短回文重复（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）并预测改基因序列与细菌获得性免疫有关，2007年其免疫功能得到证实，并最终于2012年成功运用于基因编辑。 蛋白质、RNA介导的DNA编辑技术都已取得成功。2014年，单链DNA引导的具有核酸内切酶活性的TtAgo蛋白在嗜热菌中被发现。这种DNA指导核酸内切酶是否可以应用于基因编辑技术，韩春雨团队发表文章，利用NgAgo蛋白实现了格DNA引导的基因组编辑，但其实验结果目前依然存在争议。
成骨细胞骨形成机制
浅谈骨不断地进行着重建，骨重建过程包括破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌酸性物 质溶解矿物质，分泌蛋白酶消化骨基质，形成骨吸收陷窝；其后，成骨细胞移行至 被吸收部位，分泌骨基质，骨基质矿化而形成新骨。破骨与成骨过程的平衡是维持 正常骨量的关键。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和 矿化。目前，随着研究的不断深入，在骨形成过程中，成骨细胞发展及其调控的分 子机制也逐渐得以揭示。 1成骨细胞的起源 成骨细胞起源于多能的骨髓基质的间质细胞，除成骨细胞外，基质细胞还可分 化成软骨细胞，成纤维细胞，脂肪细胞或肌细胞。成骨细胞来源谱系有以下几种：(1)骨髓克隆形成单位(成纤维细胞集落形成单位，cfu-f)；(2)骨祖细胞，可分化 成前成骨细胞和前软骨细胞谱系，常位于骨髓腔中，有很强的自身增殖能力；(3)
前成骨细胞，即最近的成骨前体，能定向分化成成骨细胞，具有合成和增殖能力［ 1，2］。成骨细胞由多能的间质干细胞在体内的各种调控因素的调节下发展而来， 调控因素主要有bmp-2，bmp-2能诱导基质细胞向成骨细胞分化，具体就是诱导间质干细胞分化形成骨祖细胞进而形成前成骨细胞［3］。 2成骨细胞发展阶段及骨形成机制 成骨细胞在骨形成过程中要经历成骨细胞增殖，细胞外基质成熟、细胞外基质 矿化和成骨细胞凋亡四个阶段。很多因素可调节这几个阶段，从而最终调控骨形成 。 成骨细胞增殖期成骨细胞数量增加，以形成多层细胞，并合成、分泌?型胶原 以便最终可以矿化形成骨结节。对成骨细胞增殖的调控具体说来即是对细胞周期的 调控，后者包括细胞在有丝分裂原作用下复制dna和细胞分裂的调节机制，典型的
基因编辑技术
生物学研究最具影响力技术：“基因编辑技术”大盘点 2014年10月29日，Nature杂志上发布了名为”Promoterless gene targeting without nucleases ameliorates haemophilia B in mice”的研究论文，据悉，该文章发布了一种超越CRISPR 的基因组编辑新技术，而CRISPR技术在今年被《Nature Methods》评为在过去十年中对生物学研究影响最深的十大技术之一。 新方法不需要内切酶在特异位点剪切DNA，也不需要使用启动子，大大降低了新基因自身插入到基因组中随机位置而引起癌症的机会。该技术使用一种常用的病毒——改良的腺相关病毒（AAV）。改良的病毒载体中，所有的病毒基因被删除，只保留了治疗基因。再利用同源重组，将目标基因插入，达到基因编辑的目的。 在了解这项新技术有点之后，有必要了解什么是基因编辑技术及基因编辑的三大利器：ZFN（锌指核酸酶）、TALEN（转录激活样效应因子核酸酶）和CRISPR/Cas9（成簇规律间隔短回文重复技术）。 基因编辑是近年来发展起来的可以对基因组完成精确修饰的一种技术，可完成基因定点InDel突变、敲入、多位点同时突变和小片段的删失等，可在基因组水平上进行精确的基因编辑。在科研领域，该技术可以快速构建模式动物，节约大量科研时间和经费；在农业领域，该技术可以人为改造基因序列，使之符合人们的要求，如改良水稻等粮食作物；在医辽领域，基因编辑技术可以更加准确、深入地了解疾病发病机理和探究基因功能，可以改造人的基因，达到基因治疗的目的等。因此，基因组编辑具有极其广泛的发展前景和应用价值。 ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9是三大基因编辑技术，基因编辑技术本质上均是利用非同源末端链接途径（NHEJ）修复和同源重组（HR）修复，联合特异性DNA的靶向识别及核酸内切酶完成的DNA序列改变。因此，这三种编辑工具的共同点是：含有靶点DNA序列的识别区域及DNA剪切功能区域，其中ZFN技术具有锌指结构域能够识别靶点DNA，而TALEN的DNA识别区域是重复可变双残基的重复，DNA剪切区域都是一种名为Fokl的核酸内切酶结构域。CRISPR的DNA识别区域是crRNA或向导RNA，Cas9蛋白负责DNA的剪切。当DNA 结合域识别靶点DNA序列后，核酸内切酶或Cas9蛋白将DNA剪切，靶DNA双链断裂，再启动DNA损伤修复机制，实现基因敲除、插入等。 基因编辑技术优缺点： 1）ZFN 的基因打靶效率能够达到30%左右，已经可以做到针对某些特定的序列来设计
成骨分化相关信号通路的研究进展
Advances in Clinical Medicine 临床医学进展, 2017, 7(4), 235-241 Published Online October 2017 in Hans. https://www.360docs.net/doc/d17071581.html,/journal/acm https://https://www.360docs.net/doc/d17071581.html,/10.12677/acm.2017.74039 Research Progress of Osteogenesis-Related Signaling Pathways Lei Zhou, Minghai Wang* Department of Orthopedics, The Fifth People’s Hospital of Shanghai, Fudan University, Shanghai Received: Sep. 27th, 2017; accepted: Oct. 7th, 2017; published: Oct. 16th, 2017 Abstract Objective: Osteogenesis is the foundation of bone formation and key procedure of bone metabol-ism. In recent years, major progress was made in the molecular mechanism of osteogenesis at home and abroad. Therefore, the mechanism and research progress of osteogenesis-related sig-naling pathways was reviewed. Methods: Literature about ossification and osteogenesis-relate signaling pathways in recent years were reviewed and analyzed. Results: Several signaling path-ways have been found osteogenesis-related, among them, BMP-SMAD, Wnt/β-Catenin, Notch, Hedgehog, MAPK and FGF signaling pathways play the leading role in bone-formation. Besides, a complex regulatory network is composed of interactions between multiple signaling pathways. However, the specific mechanism of osteogenesis-related signaling pathways is still unclear be-cause of limited research methods. Conclusion: To make clear the mechanism of these signaling pathways respectively and their interactions is of great significance for illustrating the complete mechanism of osteogenesis. Keywords Bone Metabolism, Osteogenesis, Signaling Pathway 成骨分化相关信号通路的研究进展 周雷，王明海* 复旦大学附属上海市第五人民医院骨科，上海 收稿日期：2017年9月27日；录用日期：2017年10月7日；发布日期：2017年10月16日 *通讯作者。
破骨细胞
破骨细胞在骨吸收部位，与骨接触后，由基质产生的信号向胞内分泌囊泡含H-ATP酶，向微环境释放蛋白水解酶。其中，无机钙及磷酸盐的降解是通过ATP酶介导的质子分泌。在吸收陷窝处产生一个酸性环境，而有机基质，主要由胶原和弹性蛋白组成，由半胱氨酸、天冬氨酸蛋白酶降解，其中组织水解酶K起主要作用。 DC分泌IL1/6、TNFα。增加破骨细胞释放TRAP和组织水解酶K，还可以促进破骨细胞生成通过刺激T 细胞表达RANKL。 未成熟的DC可发育为破骨细胞样的细胞， 巨噬细胞在炎症中融合主要依赖IL4 RANKL-induced differentiation of osteoclasts in vitro was performed as described previously (12). In brief, primary osteoclast precursors (nonad- herent mouse bone marrow cells, splenocytes, and RAW 264.7) were sus- pended in -MEM supplemented with 10% FBS and cultured in a 24-well culture plate at 1 10 6 cells per well. After 48 h, the culture medium was replaced with fresh culture medium with or without 100 ng/ml mouse re- combinant soluble RANKL (Wako Pure Chemical). After 4 days, cells were dehydrated with ethanol-acetone (1:1) for 1 min, dried, and stained at room temperature with TRAP staining solution. TRAP-positive cells ap- peared dark red. We counted TRAP-positive multinucleated cells contain- ing three or more nuclei as osteoclasts.常用的评价方法有生化指标的测量、骨密度测量、骨组织计量学观察、骨生物力学指标检测等。其中生化指标和骨组织计量学是主要的指标 破骨细胞细胞体相当大，直径20-100um，有多个细胞核，积聚在一起，通常有15~20个。 被激活的破骨细胞靠粘附蛋白连接在骨表面，同时刺激骨被覆细胞收缩成团，暴露出钙化骨面，破骨细胞的腹部与暴露的骨表面形成一个密闭的小空间，不断的释放酸和溶酶体，使骨基质脱钙后降解而实现溶骨的功能。破骨细胞存活7周左右，在完成破骨功能后自然凋亡。OPG作为分化负向调节因子。 正常情况下，破骨细胞粘附于骨表面但并不粗糙，而粗糙的边缘则是骨吸收活跃的标志。阿仑膦酸钠不影响破骨细胞的聚集或粘附，但它确实能够抑制破骨细胞的活性。小鼠体内进行的有关标记有放射性活性的[3H]阿仑膦酸钠在骨内作用部位的研究显示，破骨细胞表面的摄入是成骨细胞表面的10倍。标记有放射活性[3H]阿仑膦酸钠分别给予大鼠6天和小鼠49天后，检查其骨组织发现，正常骨形成于阿仑膦酸钠上面，后者与基质结合后不再具有药理活性，因此阿仑膦酸钠必须持续服用以抑制新形成的吸收表面的破骨细胞。狒狒和大鼠的组织形态测量学显示，阿仑膦酸钠能降低骨转换（即，骨重建部位的数量），而且在这些重建部位，骨形成超过骨吸收，从而使骨量增加。‘ 骨质疏松症是一个世界范围的、越来越引起人们重视的健康问题。目前全世界约2亿人患有骨质疏松，其发病率已跃居常见病、多发病的第七位。当前，我国已进入老龄社会，老年病尤其是骨质疏松症的防治成为重要的
浅谈基因编辑技术在农作物领域中的应用与问题探究
现代农业研究 近年来，农作物转基因技术得到了快速发展，将基因编辑技术应用在农作物育种上，能得到多个新的生物品种，尤其在玉米、大豆、棉花等农作物上有着较好应用。转基因技术的应用，一定程度推动了农业领域发展，但是还存在一定安全问题，要想充分利用作物转基因技术，还要注重基因编辑农作物的管理和检测，以便能发挥基因编辑技术在研发新品种上的作用，尽可能提高农作物营养价值。 1基因编辑技术在农作物领域的应用 1.1ZFN 技术 ZFN 主要负责识别和结合特定的核苷酸序列，将ZFN 技术应用到作物育种中，可对植物基因进行重新编辑。锌指核酸酶由锌脂蛋白和核酸酶结构域组成，其中核酸酶结构域对切割点不具有识别特异性，只有在二聚体情况下可使其具备酶活性。因此，需要对任一靶位点设置一对ZFN，以便形成核酸酶二聚体，从而进行DNA 链的切割。有研究学者采用该技术，替换掉烟草中乙酰乳酸酶基因的三个核苷酸点，进而得到抗除草剂的作物[1]。另外，将ZFN 技术应用在玉米作物 中，能合成磷酸酶基因，使得玉米具有抗除草剂性能，同时还能减少玉米中的肌醇六磷酸含量，提高了作物营养品质。尽管当前ZFN 技术在多种植物中取得较好运用，但是由于锌指单元对切割点识别性不高，因此在不同基因改造上的识别差异较大，限制了该技术的广泛使用。 1.2TALEN 技术 该技术是一种基于核苷酸的编辑技术，是由核酸内切酶和DNA 结构域共同组成的，其中DNA 结构域主要是由多个氨基酸序列构成的，重复序列能识别相应的碱基。TALEN 技术运用原理为：结合靶位点两端的序列设置一对TALEN，与识别位点结合后，两个核酸内切酶结合起到形成二聚体，在切割DNA 链后可完成基因编辑。有学者将该技术运用到水稻中，破坏了细菌性病原菌效应蛋白在作物基因组上的位点，进而提高了水稻抗百叶枯病。另外，在这一技术作用下，还能破坏水稻甜菜碱乙醛脱氢酶结合位点，能起到提高水稻品质的作用。而将该转基因技术运用到小麦育种中，能得到抗性较强的小麦，相对于传统育种技术来讲有 浅谈基因编辑技术在农作物领域中的 应用与问题探究 （威海海洋职业学院 264300） 【摘要】随着ZFN 、CPISPR/Cas9等基因编辑技术的发展和运用，大量基因编辑作物生产出来，这种背景下，基因编辑作物的检测及安全成为重点研究问题。本文主要围绕基因编辑技术在农作物领域的应用、针对基因编辑农作物的安全评价监管、基因编辑农作物的检测等方面展开讨论，具体分析了基因编辑技术在农业领域的应用现状，并以保障农作物食用安全为主，加强基因编辑作物有关问题的研究，促进农业领域良好发展。【关键词】基因编辑技术；农作物领域；应用分析 邹丹丹 Discussion on the Application and the Problem of the Gene Editing Technology in the Field of Crop Zou Dandan [Abstract]With the development and application of gene editing technology such as ZFN,CPISPR/Cas9,a large number of gene editing crops have been produced.Under this background,the detection and safe?ty of gene editing crops has become a key research issue.In this paper,the application of gene editing technology in agriculture was analyzed in detail,and the main purpose was to ensure the food safety of crops,to strengthen the research on related problems of gene editing crops,and to promote the good de?velopment of agricultural field. [Keywords]gene editing technology;crop field;application analysis （Weihai Marine V ocational College 264300） 农业经济
基因打靶综述
基因打靶技术 【摘要】基因打靶技术是建立在同源重组技术之上,可对基因组进行定位修饰的实验方法。本文简述了基因敲除技术的基本原理、打靶策略、筛选机制,在动植物和微生物中常用的基因敲除方法以及基因打靶的应用。 基因敲除技术是研究功能基因作用的重要方法, 是后基因组时代的重要研究内容。 。 【关键词】基因打靶;同源重组;打靶策略;筛选机制 一．前言 发展历史： 基因敲除（gene knockout）又称基因打靶（Gene targeting） 是自20 世纪80 年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，。早在80年代初,人们就开始研究在哺乳动物基因组中,存在使外源DNA与现存同源序列同源重组 的可能性。1985年, Smithies及其同事的研究使之得到确证。同期的相关研究证明了鼠多能 干细胞系具有诱发小鼠产生种系组织的能力,甚至在长期培养后仍存在,导入这些细胞器系的突变可以传给后代。其传统概念是指同源重组敲除技术即利用DNA 转化技术，将构建的打靶载体导入靶细胞后，通过载体DNA 序列与靶细胞内染色体上同源DNA 序列间的重组，将载体DNA 定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，或 与靶细胞基因组上某一确定片段置换，从而达到基因敲除的目的[5]。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功 的有基因的插入突变和RNAi，它们同样可以达到基因敲除的目的。所以，基因敲除的基本原理是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的一种分子生 物学技术。 二．主题 1基因打靶的基本原理 绝大多数的基因打靶策略都是基于同源重组( homologous recombination)的机制。同 源重组是指发生在非姐妹染色单体( sister chromatin)之间或同一染色体上含有同源序 列的DNA分子之间或分子之内的重新组合,普遍存在于噬菌体、细菌和真核生物中。
转基因动物模型在医学生物学中的应用
转基因动物模型在医学生物学中的应用 摘要：在医学研究中,用转基因动物的方法研究基因的表达调控与疾病发生的关系、建立各种人类疾病的动物模型已经为许多疑难疾病的发病机制研究提供了十分有用的资料。随着分子生物学技术在医学研究中的应用,人类对疾病的研究已经深入到基因水平,特别是随着人类基因组计划的实施,从基因水平认识人类疾病的发生、发展规律并研究治疗方法必将是21 世纪医学研究的重要课题。因此,实验动物学科应该紧跟生命科学发展的步伐,积极开展转基因动物的研究、开发工作以适应生物医学发展的需要。本文重点就转基因动物技术在医学研究中的一些应用情况作一概述。 关键词：转基因动物模型、基因、医学生物学 正文：1、发病机理研究 将癌基因与特定的启动子、增强子融合制备转基因动物，在特定组织中表达癌基因而致癌，为癌基因致癌机制研究积累了大量的资料，也由于应用了这一体系，使癌基因研究迎来又一热潮。SV40 DNA与MT启动子融合导入小鼠，成年期出现脑脉络丛乳头瘤，相应测得SV40 Tag表达。SV40 Tag基因与胰岛素基因增强子融合，导入小鼠后在胰腺中表达SV 40 Tag，诱发了胰腺癌。导入乳腺癌病毒基因增强子与myc基因的融合基因，在乳腺中测得myc的特异表达产物，并诱发了乳腺癌，而且这种肿瘤的易患性能遗传给子代。 2、遗传病的研究 转基因动物在遗传病的研究中具有重要的应用价值,被认为是遗传学研究中继连锁分析、体细胞遗传和基因克隆技术之后的第四代技术。在人类遗传病的研究中,适当的动物模型对研究基因突变在遗传病发病中的作用是必不可少的。这种动物模型过去只能靠自然突变或人工诱导的方法获得。自然突变的机会极其难得,人工诱导的方法不易控制,因此都不能满足日益发展的遗传病研究工作的需要。用转基因动物的方法构建人类遗传病的模型可为遗传病研究提供理想的动物模型。其中一个成功的例子是镰状红细胞贫血的发病机理的研究。已建立的人血红蛋白β链突变基因小鼠,出现了与镰状红细胞贫血病人同样的红细胞形态改变。除此之外,高胆固醇血症、囊性纤维化等都构建了转基因小鼠模型。这些遗传病动物模型为深入研究发病机理以及基因治疗创造了前所未有的条件。 3、病毒性疾病
成骨细胞骨形成机制研究解读
成骨细胞骨形成机制研究 发布时间：2003-1-14 作者：童安莉陈璐璐、丁桂芝 骨不断地进行着重建，骨重建过程包括破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌酸性物质溶解矿物质，分泌蛋白酶消化骨基质，形成骨吸收陷窝；其后，成骨细胞移行至 被吸收部位，分泌骨基质，骨基质矿化而形成新骨。破骨与成骨过程的平衡是维持 正常骨量的关键。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和 矿化。目前，随着研究的不断深入，在骨形成过程中，成骨细胞发展及其调控的分 子机制也逐渐得以揭示。 1 成骨细胞的起源 成骨细胞起源于多能的骨髓基质的间质细胞，除成骨细胞外，基质细胞还可分 化成软骨细胞，成纤维细胞，脂肪细胞或肌细胞。成骨细胞来源谱系有以下几种： (1)骨髓克隆形成单位(成纤维细胞集落形成单位，CFU-F)；(2)骨祖细胞，可分化 成前成骨细胞和前软骨细胞谱系，常位于骨髓腔中，有很强的自身增殖能力； (3) 前成骨细胞，即最近的成骨前体，能定向分化成成骨细胞，具有合成和增殖能力［ 1，2］。成骨细胞由多能的间质干细胞在体内的各种调控因素的调节下发展而来， 调控因素主要有BMP-2，BMP-2能诱导基质细胞向成骨细胞分化，具体就是诱导间质 干细胞分化形成骨祖细胞进而形成前成骨细胞［3］。 2 成骨细胞发展阶段及骨形成机制 成骨细胞在骨形成过程中要经历成骨细胞增殖，细胞外基质成熟、细胞外基质 矿化和成骨细胞凋亡四个阶段。很多因素可调节这几个阶段，从而最终调控骨形成 。 成骨细胞增殖期成骨细胞数量增加，以形成多层细胞，并合成、分泌Ⅰ型胶原 以便最终可以矿化形成骨结节。对成骨细胞增殖的调控具体说来即是对细胞周期的