PCR的分类

1.菌落的处理（我用的是质粒小提，用15ml离心管摇菌，通常加5ml培养基）挑取新鲜

菌落于含抗性的（LB）培养基中 37°C 200rpm摇床摇2-4小时以上（通常赶时间的话

我就在摇后3小时做，这时我的PCR循环数就要相应多些，设置为32-35个循环，若不赶时

间的话，我都是取摇过夜的活化菌做模板，此时我的PCR循环数就相应少些，一般28-30

个循环）

2. 菌液的处理无需特殊处理菌液或取1-2ul菌液稀释为100倍体积，沸水浴10-15mins

甚至于在稀释体系中按1/1000加triton（这个我没做过）提出加triton的人说这是为了

破膜，以便能够释放出带目的基因的质粒，不过我觉得此步骤多次一举，细胞膜在沸水浴

中肯定会变形掉我试过沸水浴15mins，其效果和无需处理的菌液（实际上我在PCR的体系

上做了手脚，后述）近似，所以后来我就没有再那么麻烦的去稀释，煮沸

3. pcr体系：无特殊要求同普通PCR，我一般使用20ul或25ul体系，鉴定用嘛，不用太

铺张，过少的体系也不推荐，除非你很信任你的“枪”和你的加样的力度

4. 模板的量：1-2ul 未处理的和处理过的菌液均可以加1-2ul作为模板，需要说明的是PCR

的反应是一个微量反应，用于检测10的负3-6次方级别，如果用未做任何处理的菌落来做

PCR其量过于大，菌落通常都是10的6次方级别（因为我看到最近有一帖是一位仁兄直接

用菌落做模板，我没有做过验证，但从原理上来说是不推荐的）

5. 退火温度：55-58°C 此步我没有详细的论证，因为我的目的基因我都做过梯度PCR，其

退火温度均可以用55°C或者58°C完成 T7，SP6的退火温度400-900bp的产物大概为55°

C我也有62度为最佳退火温度的产物，但是用T7+目的基因-R在58°C和55°C均可以P

出目的条带

6. 循环数：取决于模板的拷贝数，，均可以P出来最少的我试过28个，最多的也不过

35个

7 .预变形时间：因为嫌稀释菌液煮沸的过程很麻烦，所以后来我就直接取的活化菌液，考

虑到的确可能细胞膜变形不完全，导致扩增的模板未能完全释放，以致扩增效率降低，我

将预变形的时间改为10-15mins ，效果不错，之前煮沸过的菌液自然不需要考虑这一步

PCR

破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。使DNA充分变性，减少DNA 复杂结构对扩

增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的DNA模板，最好不要

吝啬这个步骤。

PCR所用的酶主要有两种来源：Taq和Pfu，分别来自两种不同的噬热菌。其中T aq扩增

效率高但易发生错配。Pfu扩增效率弱但有纠错功能。所以实际使用时根据需要必须做不同

的选择。

PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。

②引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。

③引物内部不应出现互补序列。

④两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。

⑤引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。

⑥引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。

⑦引物的5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。

降落PCR，设计多循环反应的程序，以使相连循环的退火温度越来越低。由于开始时的退火温度选择为高于估计的Tm值，随着循环的进行，退火温度逐渐降到Tm值，并最终低于这个水平，用于确保第一个引物—模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。首先在较高的温度下扩增，此时虽然扩增效率低，但非特异扩增基本没有。随着退火温度的降低，非特异扩增会逐步增多。但由于此时特异的扩增产物已经达到一定的数量优势，因此会对非特异扩增产生强烈的竞争抑制，从而大幅提高PCR的特异性和效率

梯度PCR其实就是在不同退火温度下进行多个的PCR反应，不用一次一次的作很多次，温度梯度PCR可以很快的找出最适合的退火温度，或者说可以在最适合的退火温度下扩增出目的条带。

荧光PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时, 探针结合在DNA任意一条单链上;PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

RT-PCR 为反转录PCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。

RT-PCR技术相关试剂oligo: 多聚体，相当于mRNA引物AMV RT：禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶MMLV RT：莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶dNTPs：脱氧核苷酸RNase：RNA水解酶

PCR Buffer：RT-PCR缓冲液MgCl2：2价镁离子