用慢病毒载体制备转基因动物的研究进展

邓继先

1**

沈伟

1,2

(1军事医学科学院生物工程研究所北京 100071 2西北农业大学动物科技学院杨凌 712100)

摘要慢病毒是逆转录病毒的一种,具有逆转录病毒的基本结构,但也有不同于逆转录病毒的组份和特性,作为基因治疗载体发展起来,最近已用于转基因动物制备。慢病毒像其它逆转录病毒

一样,其基因组经逆转录后能整合在宿主DNA 上;由于病毒载体经改构后,不在宿主细胞增殖,不会导致寄主细胞的死亡,被它感染的或转化的动物细胞能够连续传代;这种载体的最大优势是能感染静止细胞和不产生嵌合体动物。详细介绍了慢病毒载体构建原理、近年慢病毒载体在转基因动物制备方法和应用研究的新进展。

关键词慢病毒载体转基因动物逆转录病毒收稿日期:2004 04 05 修回日期:2004 05 11*国家 863 计划资助项目(2002AA206621)**电子信箱:dengj x@https://www.360docs.net/doc/d311256104.html,.

慢病毒(Lentivirus )属于逆转录病毒科(Retrovidae),为RNA 病毒,由于这类病毒的一个重要特点是毒粒中含有依赖RNA 的多聚酶即逆转录酶,故现名为逆转录病毒。在这一科里还包括一些RNA 肿瘤病毒(RNA tumorviruses),白血病病毒(Leukoviruses)和致瘤RNA 病毒(Oncobaviruses)等。慢病毒是一类重要病毒,如人免疫缺陷病毒(HIV)和猴免疫缺陷病毒(SI V)等。慢病毒除了具有一般逆转录病毒gag 、pol 和env 3个基本基因结构外,还包含4个辅助基因,vif 、vpr 、ne f 、vpu 和2个调节基因tat 和rev 。慢病毒载体(Lentiviral vector,LV)作为外源基因载体,已广泛地用于体外细胞的转染

和基因治疗的研究[1,2]

。

1 非慢病毒的逆转录病毒载体法的发展

以前人们将逆转录病毒载体注入小鼠囊胚腔或用高滴度的逆转录病毒载体颗粒感染着床前或着床后胚胎,或直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共育以达到感染目的。逆转录病毒作为动物基因转移载体最早的研究见于1974年的报道。Jaenisch R 等(1974年)将SV40DNA 注入小鼠囊胚腔中发现获得的小鼠体内有SV40DNA 整合。大多逆转录病毒载体通过病毒两端的特殊

序列在逆转录时整合到分裂细胞,这一过程依赖有丝分裂的核裂开,使逆转录前整合复合体转位到核上。这样,逆转录病毒载体转染动物胚胎的早期,产生延迟的整合,产生不同组织和不同位点的镶嵌体。为了提高逆转录病毒载体的转移效率和减少嵌合体形成,近些年,人们对逆转录病毒载体转染生殖细胞的研究逐渐增多,生殖细胞包括卵母细胞、精原干细胞和精原细胞都有可能成为转基因动物制备的一条新的途径,特别对于有商业价值的大型动物转基因更有意义[3]

。1998年,Chan 等[4]

利用复制缺陷型MoMLV 作载体转染牛卵母细胞最终产生了转基因牛。2001年,Cabot 等

[5]

则利用携带

GFP 蛋白基因的复制缺陷型MoMLV 作载体转染体

外熟化的猪卵母细胞后,进行体外受精,获得转基因猪,表达了GFP 。最近,Kyle 等

[6]

在用Gen

pgk gal 载体转染体外培养的大鼠精原干细胞,然后将精原干细胞移植到裸鼠睾丸内成熟,经3天感染,0 5%的干细胞被转导,能在小鼠受体睾丸内产生转基因精子,类似于从小鼠到小鼠的精原干细胞移植获得转基因子代水平。精原细胞在体外培养比较困难,但这些细胞也是接受基因治疗的病毒载体整合的潜在的目标受体细胞之一,De Miguel 等[7]

在建立体外培养精原细胞后,用携带MDM 2基因的逆转录病毒载体成功地高效转染精原细胞。非慢病毒的逆转录病毒载体在转基因动物制备的应用方面,使用的时间已很长,但存在一些难以克服的缺陷,应用不十分广泛。主要问题是非慢

第24卷第9期

中国生物工程杂志

CHINA BIOTEC HNOLOGY

2004年9月

病毒的逆转录病毒载体对不分裂的静止细胞不感染和表达沉默[8]。近些年发展的LV克服了这些缺陷。随着分子病毒学研究的不断深入,人们对慢病毒的分子生物学特性有了较为深刻的了解,发展出LV,不仅在基因治疗方面显示出优越特性,而且在转基因动物制备方面发挥出优势,近些年基因表达调控和基因功能的应用研究越来越多。LV与其它转基因技术方法相结合用于转基因动物的构建,从而大大提高了产生转基因动物的成功率。

2 慢病毒的特点与载体构建

因为LV克服了其它逆转录病毒载体的一些缺陷,便于发展为转动物基因的载体。就目前所知,在大多数情况下,慢病毒像其它逆转录病毒一样,其基因组经逆转录后能整合在宿主DNA上,也可以在正常细胞中进行操作,因此可将它改建为有用的外源基因的转移载体;LV与其它逆转录病毒载体不同,它不但感染分裂细胞,也感染静止细胞;由于病毒载体经改构后,不在宿主细胞繁殖,不会导致寄主细胞的死亡,被它感染的或转化的动物细胞能够连续传代。因此利用慢病毒作载体,改变动物细胞的基因型,并遗传到子代。LV的发展正受到人们的重视,其中包括SIV、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、马感染性贫血病毒(EI AV)等。这些病毒对人无致病性,在人类细胞中不会复制。可以高效转染分裂期及静止期细胞。但是SI V和FI V的RNA可与HI V 1颗粒交叉包装产生有复制能力的病毒(RC V),这就可能在人畜之间产生新的有复制能力的病毒。而且,Hofmann 等[9]研究发现在非人类慢病毒转染人细胞的过程中,可能存在转导效率的障碍。LV的发展开始来自基因治疗,而且人是HIV 1的天然宿主,在人类的临床实践中应用HI V 1要比应用动物病毒所获得的期望值要高。

HIV 1是慢病毒中最具特征性的病毒,第一个LV系统即以此病毒为基础进行构建的。HIV 1 DNA前病毒的主要结构基因及其排列形式与其它逆转录病毒相同,均为5!LTR gag pro pol env 3! LTR。其中gag基因编码病毒的核心蛋白,pol基因编码病毒复制所需的酶类,env基因编码病毒的包膜糖蛋白,pro基因则编码切割蛋白前体所需的蛋白酶。与其它逆转录病毒不同的是,HIV 1基因组尚有较多调节基因,其中属于HIV 1基因复制所必需的tat基因和rev基因,分别编码两个反式激活因子Tat蛋白和Rev蛋白,前者在HI V 1基因组复制和转录延伸过程中发挥重要作用,后者则可促使HI V 1基因的表达由早期向晚期转化。非HIV 1复制所必需的调节基因有ne f、vif、vpr和vpu。这些基因的编码产物都有各自的功能,在此不一一赘述。慢病毒载体的构建原理就是将HI V 1基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列)和编码反式作用蛋白的序列进行分离。载体系统包括包装部分和载体部分:包装部分由去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列HIV 1基因组而构建,能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白;载体部分与包装成分互补,仅含有包装、逆转录和整合所需的HIV 1顺式作用序列,同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。为进一步降低两部分因同源重组产生RC V 可能性,Naldin等将包装部分的5!LTR换成巨细胞病毒(C MV)立即早期启动子,3!LTR换成人珠蛋白poly A信号序列,并将包装部分分别构建在两个质粒上,即一个表达gag和pol、另一个表达rev,在载体部分的5!端使用嵌合体序列,用RSV的增强子启动子替代U3区(RRL),这样在转录时不依赖tat的存在,在载体中去掉HI V的tat基因,在3! LTR也删掉了U3的绝大部分序列,从而极大地增加了使用的生物安全性。为了使载体能扩大感染范围,人们采用表达水疱性口炎病毒(VSV)糖蛋白G的质粒和双嗜性小鼠白血病病毒(MLV)包膜蛋白Env的质粒,分别取代表达HIV本身包膜蛋白Env的质粒,使HIV 1载体颗粒包上了VSV或双嗜性MLV的包膜。这样做的结果至少具有三个方面的积极意义:(1)包膜的更换进一步降低了HIV 1载体恢复成野生型病毒的可能;(2)使HI V载体感染宿主的范围不再仅限于CD4+细胞,而扩大到几乎能感染所有组织来源的细胞;(3)VSV的包膜赋予HI V载体颗粒高度的稳定性,使其能够通过超速离心而浓缩,达到高滴度。目前,已使HI V 1载体滴度达到107~108TU ml[10,11]。

LV与逆转录病毒载体的基因转移基本一样,由于用含病毒的gag和pol质粒、含病毒env的质粒构建成的包装细胞系,为了安全起见还需要使转移载体与上述两个质粒不存在同源重组序列,将外源目的基因克隆到转移载体中,将克隆了目的基因的转移载体转入包装细胞中形成有感染活性的重

第9期邓继先等:用慢病毒载体制备转基因动物的研究进展

组慢病毒,再去感染早期胚胎或显微注射受精卵。由于慢病毒的高效率感染和在宿主细胞DNA上的高度整合特性,可以大大提高基因转移的效率。

3 慢病毒载体转基因动物

尽管LV已于1996年就发展出来,一直用于细胞转染和基因治疗的研究,但直到2002年Lois 等[12]试用于转基因大鼠和小鼠的制备。为了提高外源基因在体内表达水平,他们对用于细胞转染的慢病毒载体进行了改构,在外源基因后添加旱獭肝炎病毒转录后调控元件(WRE);为了提高病毒滴度,在5!端LTR和外源基因启动子之间添加了HIV 1的侧翼元件(flap element)。在小鼠单细胞胚胎的卵周隙注射大约10~100pl病毒液(浓度:103 I U l),然后移植到代孕鼠。Southern blot检测82%至少携带一个拷贝基因,检测表达的荧光蛋白,为76%。第二次实验,分别达到87 5%和80%。将去掉透明带的胚胎与20000I U l、4000I U l、800 I U l的慢病毒培养3天,直到桑葚胚期或囊胚期,再移植到代孕鼠子宫内,这样处理胚胎,其存活率降低,但病毒载体能感染胚胎,整合到DNA上。转基因阳性率基本上与病毒载体浓度成正比,尽管不成线形关系。注射大鼠胚胎的卵周隙,获得59%的转基因阳性率。并且使用组织或细胞表达特异性启动子,转基因的表达部位非常特异。

对于畜牧动物转基因,显微注射的效率低下造成成本过高一直是困扰人们的问题,为了寻求解决这个问题的方法,最近,Hofmann等[13]使用LV PGK 转移外源基因到猪和牛胚胎获得初步成功。携带调控GFP蛋白基因表达的PDK启动子、中间聚嘌啉区(cPPT)和W RE,LV包被VSV包膜糖蛋白G,收集人工受精的猪胚,采用109~1010I U ml的经显微注射到受精卵的卵周隙,获得的仔猪70%携带外源基因GFP,其中表达率94%,经直接荧光显影和免疫组化检测,在转基因猪的所有组织均表达GFP,包括生殖细胞;实验还证实外源基因能经生殖细胞传递到子代动物;在LV使用人角蛋白K14启动子(LV K14)表达GFP,能特异地在动物皮肤基底层角质细胞表达;用LV GFP在体外受精前后感染牛卵母细胞,其胚胎的感染率分别为45%、92%。这些结果表明LV具有很高的外源基因转移效率,表达具有组织特异性,并对胚胎显微操作要求低。

LV具有其它逆转录病毒的特点,可在从生殖细胞到囊胚期各发育阶段转移外源基因,近两年已有几家实验室分别进行一些观察,其结果均获得成功。Hamra等[14]用LV EGFP转染体外培养的精原细胞,然后将整合有LV EGFP的精原细胞移植到化学杀死精原细胞的野生型雄性大鼠睾丸,移植后大约60天,与相当年龄的雌性大鼠交配,获得44只子代大鼠,其中有26只来自移植精子干细胞克隆,13只携带慢病毒转基因,大约30%转基因阳性。说明LV可整合到精原细胞DNA上经自然交配制备转基因动物。Ikawa等[15]用LV GFP和RV GFP进行同步比较,观察两种载体的转基因效率、表达特异性和水平,采用与去透明质带受精卵共培育,产生的囊胚移植到代孕鼠子宫,PCR分析判断两种载体均有60%~70%的F0鼠整合外源基因, Southern blot分析整合在不同位点,并观察到能经生殖细胞传递外源基因到下一代。观察表达情况则存在区别,LV的转基因小鼠大多数能表达外源基因,而肿瘤逆转录病毒载体小鼠的外源基因完全保持沉默;如使用的启动子具有组织特异性,其表达部位具有组织特异性,使用视网膜紫质蛋白、红色素基因的调控序列表达EGFP,均能特异地在杆状和锥状光接受细胞表达,但使用角膜表皮特异存在角质蛋白12启动子(K12)表达EGFP,不但能在角膜表达,也在其它组织表达,这可能与K12启动子的特异性有关。这一实验结果说明了受精卵经适当处理,可以感染LV,如此看来,用LV制备转基因动物是一种简单而有用的方法。由于逆转录病毒载体转染小鼠ES细胞常常出现转基因表达沉默,局限了使用范围。Pfeifer等[8]用携带CAG和PGK启动子调控GFP与LacZ的LV转染小鼠ES细胞,转移的基因能在未分化ES细胞增殖期间稳定地表达,E S细胞体外或体外分化时都能表达转移基因,移植这种细胞到小鼠的囊胚,生产的嵌合体鼠在多种组织中表达外源基因,嵌合鼠交配产生的胚胎仍能表达外源基因产物。用这些LV感染小鼠植入前的桑葚胚,无论在胚胎期还是新生小鼠都能稳定表达外源基因。用于人ES细胞感染,在传代几次后仍能稳定表达外源基因。LV比以前发展的逆转录病毒载体对ES细胞和植入前胚胎转染效率和表达水平有明显改善。

4 展望

LV载体与SMGT结合可能是提高转基因效率

18中国生物工程杂志第24卷

的手段之一,特别是LV注射曲细精管感染动物的精原干细胞,使外源DNA整合到动物精原干细胞上,使动物通过自然受精产生转基因动物。直接将DNA注射到动物的曲细精管,使外源DNA整合到精原干细胞的染色体上,随精原干细胞增殖而复制,通过自然交配产生转基因动物[16]。

LV载体与小的干扰性RNA(siRNA)技术结合抑制特异基因的表达或Knockdown,可能成为制备抗病毒动物的有用方法。RNA病毒可能最适合使用这种方法抑制其增殖,从理论上讲,病毒基因组和转录链核酸都可能是靶链[17,18]。国际动物流行病机构列入甲型传染性疾病因子的2 3是RNA病毒,如口蹄疫病毒、猪传染性肠胃炎冠状病毒和最近爆发的禽流感等。Bitkio等用呼吸道合胞病毒mRNA的siRNA转入细胞,能减少病毒的mRNA表达,在细胞上进行试验的还有HIV、肝炎病毒和脊髓灰质炎病毒,都获得预想的结果。预计使用这种小的RNA不会影响到动物的生理功能,需要siRNA 能在动物体内高效表达,抑制致病病毒转录产物产生或表达。还有一些需要解决的问题,那些短发夹结构RNA(shRNA)结构是最有效的?需要什么样的表达水平才能抑制病毒的复制或阻断感染?针对病毒的多种血清型的RNA共表达是否能达到预期效果?制备出的抗病毒动物的一致性怎样?能否持久存在?这些问题目前尚无答案。

英国Roslin研究所的Clark和Whitela w(2003年)对LV在转基因动物上使用推崇备至,认为是今后转基因畜牧动物最有用的手段之一,特别是与siRNA结合使用,对于改良畜牧动物生长性状、提高饲料利用率和抗病能力都有重要使用价值。特别是禽类受精卵产于体外时已经处于桑椹胚阶段,采用LV作为基因转移的载体具有很大的优越性。近些年发展的LV不论从理论上还是实践中都具有广阔的应用前景。这种方法的优点是基因转移效率高,整合率也明显高于其他基因转移方法;转录病毒生命周期中具有DNA阶段,并且基因组结构简单,便于基因操作;易于分离,重组反转录病毒感染细胞后不引起细胞病变,并且产生的病毒粒子以芽生的方式从细胞膜上释放,存在于细胞的培养上清液中,易与宿主细胞分离,且污染宿主细胞DNA等成分的概率低。对于大型动物的转基因有很大的诱惑力,可以大幅度地节省制备费用,而且容易操作,LV克服了肿瘤性逆转录病毒载体易形成嵌合体、表达沉默等不利因素。另外,LV用于畜牧动物的改良,也存在与基因治疗相同的问题,如随机插入是否干扰插入位点基因表达,甚至引起突变,整合的拷贝过多,携带基因较小(<10kb)也是LV限制因素之一。在安全方面,由于在基因治疗方面的需要和考虑,现在已有自身灭活的载体可利用。

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Progress About the Generation of Transgenic Animals with Lentiviral Vector

DE NG Ji xian1 SHE N Wei1,2

(1Institute of Bi otechnology,Acade my of Military Medical Sciences,Beiji ng 100071,China

(2College of Animal Sciences and technology,Northwest Sci Tech Universi ty of Agriculture and Fores try,Yangling 712100,China)

Abstract Lentiviruse is a kind of retroviridae.Some of their characters are different from restroviruses though they possess the basic structures and components.Lentiviral vectors have been used as vec tor of gene therapy. Recently,these vec tors are applied to generation of transgenic animals.DNA produced by lentiviruses genomic restro transcription can integrate into host cell DNA as that produced by other restroviruses.Lentiviral vectors can?t proliferate in host cells or cause host cell death after viruses are rebuilt.Host cells transformed by lentiviral vectors can proliferate and transfer.A considerable advantage of lentiviral vector is the ability at infecting still cells and non generation of chimera animals.The construct principle of lentiviral vectors,and some progress about the present methods of production and application of transgenic animals were introduced in detail.

Key words Lentiviral vector Transgene animal Retrovirus

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20中国生物工程杂志第24卷

慢病毒载体使用手册

LentiCRISPRv2 and lentiGuide-Puro: lentiviral CRISPR/Cas9 and single guide RNA CRISPR (C lustered R egularly I nterspaced S hort P alindromic R epeats) is a microbial nuclease system involved in defense against invading phages and plasmids. CRISPR loci in microbial hosts contain a combination of CRISPR-associated (Cas) genes as well as non-coding RNA elements capable of programming the specificity of the CRISPR-mediated nucleic acid cleavage. Lentiviral CRISPR/Cas can infect a broad variety of mammalian cells by co-expressing a mammalian codon-optimized Cas9 nuclease along with a single guide RNA (sgRNA) to facilitate genome editing (Shalem*, Sanjana*, et al., Science 2014). Protocols for cloning into the lentiviral transfer plasmid and general considerations for producing lentivirus are described below. Separate protocols are available for amplifying the genome-scale CRISPR knock-out (GeCKO) libraries. This protocol is for creating individual lentiviral CRISPR plasmids targeting a single genomic locus. lentiCRISPRv2 (one vector system): This plasmid contains two expression cassettes, hSpCas9 and the chimeric guide RNA. The vector can be digested using BsmB I, and a pair of annealed oligos can be cloned into the single guide RNA scaffold. The oligos are designed based on the target site sequence (20bp) and needs to be flanked on the 3' end by a 3bp NGG PAM sequence, as shown on the next page. lentiGuide-Puro (two vector system): This plasmid expressed only the chimeric guide RNA. It does not contain Cas9. Please use lentiCas9-Blast (a separate lentiviral construct that delivers hSpCas9 and blasticidin resistance) to first integrate Cas9 into your cell line. The lentiGuide-Puro vector can be digested using BsmB I, and a pair of annealed oligos can be cloned into the single guide RNA scaffold. The oligos are designed based on the target site sequence (20bp) and needs to be flanked on the 3' end by a 3bp NGG PAM sequence, as shown on the next page. Which vector to use: lentiCRISPRv2 is identical to the original lentiCRISPRv1 but produces nearly 10X higher titer virus. lentiGuide-Puro produces >100X higher titer virus over lentiCRISPRv1 and should be used in cell lines where Cas9 has already been integrated in (e.g. using the separate lentiCas9-Blast lentivirus). For applications where Cas9 cannot first be introduced (e.g. primary cells), lentiCRISPRv2 is recommended. After transduction, use puromycin to select for cells with lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro. Lentiviral production: Before starting any lentiviral work, please ensure compliance with your Environmental Health and Safety office and government/organization/university. Briefly, to make lentivirus, a transfer plasmid (e.g. lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro) must be co-transfected into HEK293(F)T cells with the packaging plasmids pVSVg (AddGene 8454) and psPAX2 (AddGene 12260). As a positive control for viral production, we often use a CMV-EGFP lentiviral transfer plasmid (eg. AddGene 19319). Target design notes and online resources: For application of Cas9 for site-specific genome editing in eukaryotic cells and organisms, we have computationally identified suitable target sites for the S. pyogenes Cas9 and calculated most likely off-targets within the genome. Please visit https://www.360docs.net/doc/d311256104.html, to access these Cas9 target design tools. Complete plasmid sequences, protocols, a discussion forum and additional information can be found at the Zhang Lab GeCKO website: https://www.360docs.net/doc/d311256104.html,/gecko/ . Citation: Please reference the following publications for the use of this material. Improved lentiviral vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Sanjana NE*, Shalem O*, Zhang F. Nature Methods (2014). Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Shalem O*, Sanjana NE*, Hartenian E, Shi X, Scott DA, Mikkelsen T, Heckl D, Ebert BL, Root DE, Doench JG, Zhang F (2014). Science, 343, 83-7. DOI: 10.1126/science.1247005

过表达慢病毒载体构建和包装手册 version1

过表达慢病毒载体构建和包装手册 Version1.0 吉凯基因二零一一年五月

目录简介 (3) 第一部分过表达慢病毒载体的制备实验流程 (4) 实验材料 (5) 过表达克隆制备 (6) 第二部分慢病毒包装与滴度检测实验流程 (17) 实验材料 (18) L e n t i v i r u s病毒包装 (21) 病毒的收获及浓缩 (22) L e n t i v i r u s滴度测定 (24) 参考文献 (33)

简介慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内较长期的表达且安全性高。吉凯基因提供的慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，吉凯基因建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒，除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。吉凯基因慢病毒载体系统由GV慢病毒载体系列、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体三质粒组成。GV慢载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件，例如WRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。通常根据不同的实验目的针对GV载体改造以进行基因功能研究。pHelper 1.0载体中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper 2.0载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。吉凯基因过表达慢病毒产品可通过对GV慢病毒载体的改造和病毒包装，获得带有特定基因序列的慢病毒颗粒，以满足不同的实验需求。本手册为吉凯基因RNAi慢病毒载体的构建和病毒包装的通用操作流程，目的是为了方便大家交流使用，部分细节内容未能做到一一详述，敬请谅解。同时希望大家能够针对手册中的错误和问题，提出宝贵的意见。

病毒载体概述

病毒载体概述引言基因导入系统(gene delivery system)就是基因治疗的核心技术,可分为病毒载体系统与非病毒载体系统。本章主要论述用于人类基因治疗的病毒载体系统。用于基因治疗的病毒载体应具备以下基本条件: 1、携带外源基因并能包装成病毒颗粒; 2、介导外源基因的转移与表达; 3、对机体不致病。然而,大多数野生型病毒对机体都具有致病性。因此需要对其进行改造后才能用于人体。原则上,各种类型的病毒都能被改造成病毒载体。但就是由于病毒的多样性及与机体复杂的依存关系,人们至今对许多病毒的生活周期、分子生物学、与疾病发生及发展的关系等的认识还很不全面,从而限制了许多病毒发展成为具有实用性的载体。近20年来,只有少数几种病毒如反转录病毒(包括HIV病毒)、腺病毒、腺病毒伴随病毒、疱疹病毒(包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)、甲病毒等被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度的应用。第一节病毒载体产生的原理病毒载体的产生建立在对病毒的生活周期与分子生物学认识的基础之上。研究病毒载体首先要对病毒的基因组结构与功能有充分的了解,最好能获得病毒基因组全序列信息。病毒基因组可分为编码区与非编码区。编码区基因产生病毒的结构蛋白与非结构蛋白;根据其对病毒感染性复制的影响,又可分为必需基因与非必需基因。非编码区中含有病毒进行复制与包装等功能所必需的顺式作用元件。各种野生型病毒颗粒都具有一定的包装容量,即对所包装的病毒基因组的长度有一定的限制。一般来说,病毒包装容量不超过自身基因组大小的105～110％。

基因重组技术的发展使病毒载体的产生成为可能。最简单的做法就是,将适当长度的外源DNA插入病毒基因组的非必需区,包装成重组病毒颗粒。比如,本实验室曾将4、5kb的lacZ基因表达盒 (CMV-lacZ-polyA)插入HSV1病毒的UL44(糖蛋白C)基因的XbaI位点中,病毒基因组的其余部分不改变,构建成重组病毒HSV1-lacZ100(吴小兵等,1998)。由于UL44基因产物对于HSV病毒在培养细胞中产毒性感染就是非必需的,因此,该重组病毒可以在细胞中增殖传代。用这种重组病毒感染细胞,能将lacZ基因带入细胞并高效表达。用同样的方法,将AAV-2病毒的rep与cap基因片段(4、3kb)插入HSV1病毒的UL2(编码尿嘧啶DNA糖基化酶)或UL44(编码糖蛋白C)基因中,构建成具有提供重组AAV载体复制与包装所需的全部辅助功能的辅助病毒rHSV-rc(伍志坚等,1999)。然而,这样的重组病毒作为基因转移载体有许多缺点。首先,许多野生型病毒通过在细胞中产毒性复制而导致细胞裂解死亡;或带有病毒癌基因而使细胞发生转化。因此必须经过改造使其成为复制缺陷性病毒并且删除致癌基因后才能用于基因治疗。其次,插入外源DNA的长度受到很大限制,尤其对于基因组本身较小的病毒如腺病毒伴随病毒(AAV,4、7kb)、反转录病毒(8～10kb)、腺病毒(36kb),如果不去除病毒基因,可供外源DNA插入的容量就十分小。因此,必须删除更多的病毒基因以腾出位置插入较大的外源DNA。为了增加病毒载体插入外源DNA的容量,除了可以删除病毒的非必需基因外,还可以进一步删去部分或全部必需基因,这些必需基因的功能由辅助病毒或包装细胞系反式提供。病毒载体大体上可分为两种类型: 重组型病毒载体:这类载体就是以完整的病毒基因组为改造对象。一般的步骤就是选择性地删除病毒的某些必需基因尤其就是立早基因或早期基因,或控制其表达;缺失的必需基因的功能由互补细胞反式提供;用外源基因表达单位替代病毒非必需基因区;病毒复制与包装所需的顺式作用元件不变。这类载体一般通过同源重组方法将外源基因表达单位插入病毒基因组中。如在传统的重组腺病毒构建方法中,将外源基因表达盒(exogenous gene expression cassette)插入穿梭质粒(如pXCX2或pFGdX1)的腺病毒同源序列中,与辅助

基因工程的现状及发展

基因工程的现状及发展 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII

基因工程的现状及发展研究背景：迄今为止，基因工程还没有用于人体，但已在从细菌到家畜的几乎所有非人生命物体上做了实验，并取得了成功。事实上，所有用于治疗糖尿病的胰岛素都来自一种细菌，其DNA中被插入人类可产生胰岛素的基因，细菌便可自行复制胰岛素。基因工程技术使得许多植物具有了抗病虫害和抗除草剂的能力；在美国，大约有一半的大豆和四分之一的玉米都是转基因的。目前，是否该在农业中采用转基因动植物已成为人们争论的焦点：支持者认为，转基因的农产品更容易生长，也含有更多的营养（甚至药物），有助于减缓世界范围内的饥荒和疾病；而反对者则认为，在农产品中引入新的基因会产生副作用，尤其是会破坏环境。目的意义：如果将一种生物的 DNA中的某个遗传密码片断连接到另外一种生物的DNA 链上去，将DNA重新组织一下，就可以按照人类的愿望，设计出新的遗传物质并创造出新的生物类型。内容摘要：如果将一种生物的 DNA中的某个遗传密码片断连接到另外一种生物的DNA 链上去，将DNA重新组织一下，就可以按照人类的愿望，设计出新的遗传物质并创造出新的生物类型，这与过去培育生物繁殖后代的传统做法完全不同。这种做法就像技术科学的工程设计，按照人类的需要把这种生物的这个“基因”与那种生物的那个“基因”重新“施工”，“组装”成新的基因组合，创造出新的生物。这种完全按照人的意愿，由重新组装基因到新生物产生的生物科学技术，就称为“基因工程”，或者说是“遗传工程”。基因工程在20世纪取得了很大的进展，这至少有两个有力的证明。一是转基因动植物，一是克隆技术。转基因动植物由于植入了新的基因，使得动植物具有了原先没有的全新的性状，这引起了一场农业革命。如今，转基因技术已经开始广泛应用，如抗虫西红柿、生长迅速的鲫鱼等。1997年世界十大科技突破之首是克隆羊的诞生。这只叫“多利”母绵羊是第一只通过无性繁殖产生的哺乳动物，它完全秉承了给予它细胞核的那只母羊的遗传基因。“克隆”一时间成为人们注目的焦点。尽管有着伦理和社会方面的忧虑，但生物技术的巨大进步使人类对未来的想象有了更广阔的空间。成果展示：

转基因研究的现状及发展

转基因研究的现状及发展转基因作物是当今世界各国现代生物技术产业研究的热点，中国的转基因生物技术发展一、我国转基因作物的发展现状迅速，由于科学界对转基因作物对人类及生态环世界上最早的转基因作物诞生于年，是一境利与弊的争论，措政府应制定相应的政策、施对到种含有抗生素药类抗体的烟草。世纪年代，其进行安全管理。本文论述了转基因作物在国际农业生物技术已逐渐成为各国现代生物技术产业研国内的发展现状，分析了转基因作物对人类及生态环境的利与弊以及关于我国转基因作物安全管究的热点。转基因技术的应用 1．在畜牧兽医中的应用应用于动物抗病育种转基因技术可以用于动物抗病育种，通过克隆特定基因组中的某些编码片段，对之加以一定形式的修饰以后转入畜禽基因组，如果转基因在宿主基因组能得以表达，那么畜禽对该种病毒的感染应具有一定的抵抗能力，或者应能够减轻该种病毒侵染时对机体带来的危害。（其用于遗传育种，不仅可以加速改良的进程，使选择的效率提高，改良的机会增多，并且不会受到有性繁殖的限制。）例如Clements等将绵羊髓鞘脱落病毒的表壳蛋白基因转入绵羊，获得的转基因动物抗病力明显提高；丘才良把一种寒带比目鱼抗冻基因成功地转移到大西洋鲑中，为提高某些鱼类的抗寒能力做了积极的尝试。 2．在医学领域中的应用用于生产药用蛋白用转基因动物的乳腺生产重组蛋白（乳腺生物反应器）可能是转基因动物的最大应用，这也是世界范围内转基因研究的热点之一。Swamdom （1992）用β-球蛋白的4个核酸酶I的高敏位点与人的两个基因相连，融合基因产生的转基因猪与鼠的原型相似。目前，把转基因动物当作生物反应器来生产药用蛋白已经受到国际社会的极大关注，不仅各国政府投资，一些私人集团也不惜投入大量资金加以研究和开发。 3．转基因的应用存在的问题及展望（1）转基因表达水平低，许多转基因的表达强烈地位受着其宿主染色体上整合位点的影响，往往出现异位表达和个体发育不适宜阶段表达，影响转基因表达能力或基因表达的组织特异性，从而使大部分转基因表达水平极低，极少部分基因表达水平过高。（2）难以控制转基因在宿主基因组中的行为，转基因随机整合于动物的基因组中，可能会引起宿生细胞染色体的插入突变，还会造成插入位点的基因片段丢失，插入位点周围序列的倍增及基因的转移，也可能激活正常状态下处于关闭状态的基因。（3）不了解哪些基因控制多数生理过程，不了解基因表达的发育控制和组织特异性控制的机制。（4）制作转基因动物的效率低，这是目前几乎所有从事转基因动物研究的实验室都面临的问题，也是制约着这项技术广泛应用的关键。（5）对传统伦理是一种挑战，对人类的生存有一定的负面作用等。当然，我们不能因为这些缺点的存在就否定转基因技术的研究价值。因为它作为一种新兴的生物技术，配合其他相关的生物技术将具有广阔的应用前景。随着这一技术日趋成熟，许多问题有望逐步得到解决。

转基因动物技术应用研究进展汇总

转基因动物技术应用研究进展摘要：本文主要对动物转基因技术发展状况作了概述，重点是近年发展的提高转基因效率的非定点整合转基因方法, 如睾丸转基因法和卵巢转基因法; 提高转基因精确性的定点整合转基因的基因打靶法作了介绍。然后对转基因技术的应用作了论述，最后对转基因技术的发展前景作了展望。关键字：动物转基因技术；应用；展望 Progress on Techniques for Producing Transgenic Animals And their Application Abstract: This review describes the recently developed animal gene transfer techniques, including gene transfer into the testis and ovary for easily making non-site specific methods; gene targeting in embryonic stem cells, somatic cells and primordial germ cells for site specific methods.The application and prospect of transgenic technology was also discussed. Key words: animal gene transfer technique; application;prospect 动物转基因技术是将外源基因移入动物细胞并整合到基因组中, 从而使其得以表达。自Palmiter等[1] (1982)把大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵获得超级巨鼠以来,世界各国科学家对转基因技术应用于动物生产的研究产生了极大的兴趣,并相继在兔、羊、猪、牛、鸡、鱼等动物上获得转基因成功。转基因动物研究是近年来生命科学中最热门、发展最快的领域之一,其应用已广泛渗透于分子生物学、发育生物学、免疫学、制药及畜牧育种等各个研究领域中。这项技术正在对动物生产产生一场新的革命,在提高生长速度、生产性能,改善产品品质、抗病育种、基因治疗等方面取得了可喜的进展,显示出诱人的应用前景。 1 转基因动物技术 1.1 显微注射法这一方法是发展最早,目前应用最广泛和最为有效的制作转基因动物的方法,创始人是Jaenisch和Mintz等,Gorden等[2]和最先通过此法获得转基因动物。其基本原理是:通过显微操作仪将外源基因直接用注射器注入受精卵,利用受精卵繁殖过程中DNA的复制过程,将外源基因整合到DNA中,发育成转基因动物。 1.2 逆转录病毒载体导入法将目的基因重组到逆转录病毒载体上,制成高滴度的病毒颗粒,人为感染着床前后的胚胎,

基因工程技术的现状和前景发展

基因工程技术的现状和前景发展摘要从20世纪70年代初发展起来的基因工程技术，经过30多年来的进步与发展，已成为生物技术的核心内容。许多科学家预言，生物学将成为21世纪最重要的学科，基因工程及相关领域的产业将成为21世纪的主导产业之一。基因工程研究和应用范围涉及农业、工业、医药、能源、环保等许多领域。基因工程应用于植物方面农业领域是目前转基因技术应用最为广泛的领域之一。农作物生物技术的目的是提高作物产量，改善品质，增强作物抗逆性、抗病虫害的能力。基因工程在这些领域已取得了令人瞩目的成就。由于植物病毒分子生物学的发展，植物抗病基因工程也也已全面展开。自从发现烟草花叶病毒(TMV)的外壳蛋白基因导入烟草中，在转基因植株上明显延迟发病时间或减轻病害的症状，通过导入植物病毒外壳蛋白来提高植物抗病毒的能力，已用多种植物病毒进行了试验。?在利用基因工程手段增强植物对细菌和真菌病的抗性方面，也已取得很大进展。植物对逆境的抗性一直是植物生物学家关心的问题。由于植物生理学家、遗传学家和分子生物学家协同作战，耐涝、耐盐碱、耐旱和耐冷的转基因作物新品种(系)也已获得成功。植物的抗寒性对其生长发育尤为重要。科学家发现极地的鱼体内有一些特殊蛋白可以抑制冰晶的增长，从而免受低温的冻害并正常地生活在寒冷的极地中。将这种抗冻蛋白基因从鱼基因组中分离出来，导入植物体可获得转基因植物，目前这种基因已被转入番茄和黄瓜中。?随着生活水平的提高，人们越来越关注口味、口感、营养成分、欣赏价值等品质性状。实践证明，利用基因工程可以有效地改善植物的品质，而且越来越多的基因工程植物进入了商品化生产领域，近几年利用基因工程改良作物品质也取得了不少进展，如美国国际植物研究所的科学家们从大豆中获取蛋白质合成基因，成功地导入到马铃薯中，培育出高蛋白马铃薯品种，其蛋白质含量接近大豆，**提高了营养价值，得到了农场主及消费者的普遍欢迎。在花色、花香、花姿等性状的改良上也作了大量的研究。? 基因工程应用于医药方面目前，以基因工程药物为主导的基因工程应用产业已成为全球发展最快的产业之一，发展前景非常广阔。基因工程药物主要包括细胞因子、抗体、疫苗、激素和寡核甘酸药物等。它们对预防人类的肿瘤、心血管疾病、遗传病、糖尿病、包括艾滋病在内的各种传染病、类风湿疾病等有重要作用。在很多领域特别是疑难病症上，基因工程工程药物起到了传统化学药物难以达到的作用。我们最为熟悉的干扰素(IFN)就是一类利用基因工程技术研制成的多功能细胞因子，在临床上已用于治疗白血病、乙肝、丙肝、多发性硬化症和类风湿关节炎等多种疾病。?目前，应用基因工程研制的艾滋病疫苗已完成中试，并进入临床验证阶段；专门用于治疗肿瘤的“肿瘤基因导弹”也将在不久完成研制，它可有目的地寻找并杀死肿瘤，将使癌症的治愈成为可能。由中国、美国、德国三国科学家及中外六家研究机构参与研制的专门用于治疗乙肝、慢迁肝、慢活肝、丙肝、肝硬化的体细胞基因生物注射剂，最终解决了从剪切、分离到吞食肝细胞内肝炎病毒，修复、促进肝细胞再生的全过程。经4年临床试验已在全国面向肝炎患者。此项基因学研究成果在国际治肝领域中，是继干扰素等药物之后的一项具有革命性转变的重大医学成果。基因工程应用于环保方面

慢病毒载体的构建及其在基因治疗方面的应用

慢病毒载体的构建及其在基因治疗方面的应用摘要：慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。经改造的慢病毒作为外源基因载体，具有其独特的特点和优势。基因治疗成功的关键是选择合适的载体系统，慢病毒载体作为一种特殊的逆转录病毒载体，具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点，已成为当前基因治疗载体研究的热点。近年来对其基础生物学特性、载体改造及其应用等研究均取得了较大进展，笔者对慢病毒载体的构建以及其在人类疾病基因治疗方面的应用做简单的介绍。关键词：慢病毒载体；载体构建；基因治疗基因治疗是向靶细胞或组织中引入外源基因DNA或RNA片段，以纠正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗的目的。其关键问题之一是如何将目的基因导入靶细胞，得到稳定、高效表达。理想的基因载体应具备：靶向特异性；高度稳定、易制备、可浓缩和纯化；无毒性；有利于基因高效转移和长期表达；容量大，易人工合成，缺乏自动复制载体自身的能力［１］。由于病毒基因组结构简单、分子背景比较清楚、易于改造和操作、感染效率高、有较高靶细胞特异性，这些都是其他载体系统无法比拟的，而慢病毒载体由于其对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力且转染效率高、靶向性好和持久性表达等特点，病毒载体系统就显得格外引人注目。 1 慢病毒及其载体的简介慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。慢病毒除了具有一般逆转录病毒gag、pol和env3个基本结构基因外，还包含4个辅助基因vif、vpr、nef、vpu 和2个调节基因tat和rev［２］。慢病毒载体（Lentiviral vector，LV）作为外源基因载体，其产生均包括一个遗传割裂基因表达的设计。病毒元件要符合以下条件：①慢病毒组装辅助蛋白至少含有gag-pol基因；②慢病毒转基因载体RNA 包括转基因表达盒；③异质糖蛋白。目前使用不同种属来源的慢病毒载体，包括来源于人类（HIV-1和HIV-2）以及猿猴（SIV）、猫（FIV）等其它物种［３］。 2 病毒载体的构建由于慢病毒的一些自身因素，我们需对其进行以下的一些改建，使其可以更好地为疾病治疗和科研工作服务。 2.1 最小辅助包装元件为了减少病毒序列的数量从而减少同源重组的风险，去除了组装慢病毒载体结构中不同辅助元件或用其它的特异序列来代替。其中包括原位癌激活基因序列的调整。另外，去掉附加或调节基因与gag-pol基因一样，已在一些慢病毒载体

慢病毒载体包装构建过程

慢病毒载体包装构建过程原理：慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。概念：慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。辅助成分：慢病毒载体辅助成分包括：慢病毒包装质粒和可产生病毒颗粒的细胞系。慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。基本原理：慢病毒载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。

包装成分：由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。载体成分：与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装成分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3′LTR换成SV40 polyA等。一、实验流程（1和2为并列步骤） 1.慢病毒过表达质粒载体的构建设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。 2.慢病毒干扰质粒载体的构建合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体 3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养24和48h后，分别收集富含

慢病毒系统简介及应用

慢病毒包装系统简介及应用一、慢病毒包装简介及其用途慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体，然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3' 端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。在siRNA表达载体中，构成siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4个U 3 '突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体。慢病毒载体（Lentiviral vector）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。二、这一系统的目的，主要是为了解决以下问题： 1. 对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi，cDNA克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。 2. 进行稳转细胞株的筛选；

慢病毒载体,稳定表达

慢病毒载体，稳定表达一、慢病毒逆转录病毒（Retrovirus）：是一种RNA病毒，在复制时需在逆转录酶的作用下首先将RNA 转变为cDNA，再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增。主要包括RNA肿瘤病毒、慢病毒及泡沫病毒等三种亚科。慢病毒（Lentivirus）：属于逆转录病毒科，名称源自该种病毒长达数年的潜伏期。最经典的慢病毒是由HIV病毒改造而来，而且HIV-1/HIV-2系统也得到了广泛的应用，除了HIV病毒系统以外，后续还有猿类免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus, SIV）载体系统、猫免疫缺陷病毒（felines immunodeficiency virus, FIV）载体系统、绵羊梅迪-维斯纳病毒（MMV）载体系统和马传染性贫血(EIA）载体系统等。慢病毒结构： 2个调节基因：（1）tat基因：反式激活因子，对HIV基因起正调控作用。（2）rev基因：病毒蛋白表达调节因子，增加gag和env基因对结构蛋白的表达。 4个辅助蛋白（附属）基因：（1）vif和vpu调节感染性病毒颗粒的产生；（2）vpr和nef参与疾病的表现。慢病毒的优势： 1.慢病毒携带的基因组可整合到宿主基因组，使宿主细胞长时间稳定表达外源基因； 2.可感染分裂和非分裂细胞； 3.低免疫原性，直接注射活体组织不易造成免疫反应，适用于动物实验； 4.可以更换特异性启动子； 5.野生型的HIV大小约为9.8 kb，插入片段可长达5-6 kb；

二、慢病毒载体慢病毒载体（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒载体，是逆转录病毒的一种，基因组是RNA，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。慢病毒包装过程：慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生小RNA。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂。慢病毒包装和侵染细胞的过程（元和生物）三、慢病毒的使用和优势慢病毒的使用量的取决因素：滴度，感染体积，MOI ，细胞密度滴度（Titer）：单位体积液体中有感染能力的病毒或噬菌体数目。单位：TU/mL （活性滴度单位）、copies/mL （物理滴度单位）检测方法：定量PCR检测干扰后细胞基因组中外源DNA拷贝数。实验原理：慢病毒介导外源基因以逆转录方式整合进目的细胞基因组。图3 MOI（multiplicity of infection）：感染复数或者复感染指数。指感染时病毒和细胞数量的比值。在实验中也将某个细胞达到80%感染时所需的MOI 值定义为这个细胞的MOI值。加的病毒量(μl)=细胞数×MOI/滴度(…/ml) ×1000。最后，818 一些有关慢病毒方面的产品： 1.关于慢病毒载体构建方面： ORF表达克隆产品【LPP-货号-载体-100，ORF/Promoter/lncRNA慢病毒】 shRNA克隆产品【LPP-货号-载体-050，shRNA慢病毒】 miRNA克隆产品【LPP-货号-载体-050，miRNA/inhibitor慢病毒】

慢病毒载体构建步骤研究

一、简介慢病毒( Lentivirus )载体是以HIV-1 (人类免疫缺陷I 型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi 的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA 半衰期短，体外合成siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA 的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA 的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA ，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。慢病毒载体能够产生表达shRNA 的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA ，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。慢病毒作为siRNA 的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶川启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶川有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA 聚合酶川遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3'端形成1~4个U。 U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶川依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达?21ntRNA 和?50ntRNA 茎环结构(stem loop )。在 siRNA 表达载体中，构成siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA ；也可由载体直接表达小发卡状RNA (small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶川启动子和4?5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4个U 3 '突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA 的方法，寻找高效的siRNA ，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA 表达载体(筛选)。二、实验流程(大致的简单过程) 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的

转基因动物及其在医学中的应用

转基因动物及其在医学中的应用转基因动物是指通过加减特定的DNA片段而改变了基因构成和性状的动物，也可以认为是指体内基因组中稳定地整合有外源基因的动物。该项技术始于80年代初，很快便成为研究动物基因表达特性及其功能的重要手段，在基因表达的调控机制等方面的基础理论研究、家畜家禽的遗传性状改造、培育能为人类提供器官移植材料的家畜、培育人类疾病的模型动物、作为生物反应器主产工业和医学所需要的珍贵生物活性蛋白等方面被广泛应用。本文主要对其在人类医学方面的应用现状及前景作以论述。 1转基因动物的制备技术用以培育转基因动物的技术叫做转基因技术或基因转移。其总体过程是：首先从某种动物分离目的基因或人工构建该目的基因，把该目的基因在体外进行重组和扩增，然后再把加工好的目的基因设法导入另一个同种或异种动物受精卵的原核内（或细胞质内），使其稳定地整合到受体细胞的基因组中，最后使该受精卵发育成携带外源目的基因的个体，即产生了转基因动物。目前常用的转基因技术主要有： 1）原核内显微注射法是将在体外构建的目的基因，在显微操作仪下用极细的微吸管注射到处于原核时期的受精卵的原核中，让这种外源基因通过某种方式整合到受体细胞的基因组中去，以实现转基因的目的。 2）转染技术主要以RNA病毒或DNA病毒为载体，在体外将目的基因或连同启动子等序列一同重组到病毒的核酸载体上。再让该病毒感染受精卵或胚胎于细胞，利用载体病毒具有主动整合到受体细胞基因组中去的特性，让其连同所携带的目的基因等也一同整合到受体细胞的基因组上去。 90年代后又出现了两种较新的方法，即基因剔除和基因楔入技术。 3）细胞载体技术主要使用胚胎干细胞（ES）作为操作对象。胚胎干细胞是从哺乳动物早期胚胎的内细胞团中分离得到的一种二倍体细胞，可在体外培养并保持全能分化的潜能，一旦回复到适当的环境条件下即可形成胚系集落。可以用转基因技术将外源目的基因转移到胚胎干细胞中，通过同源重组或转换的方法使外源基因整合到胚胎干细胞的基因组中。而且，还可以根据由于外源基因的插入所产生的基因表达方面的改变，来对胚胎干细胞进行预筛选，从而大大提高转基因的成功率。被转基因后的胚胎干细胞经鉴定后可被移植到正常发育的囊胚中，再将囊胚导入假孕的代理母亲子宫内发育而产生出嵌合体动物，然后与正常的雄性动物交配即可获得生殖系携带外源基因的纯合转基因动物。目前还有用快速分裂的哺乳动物乳腺肌上皮细胞或小鼠精子作为细胞载体。 2转基因动物在医学中的应用