生物工艺学复习资料(含填空题)

一、名词解释

1.促进剂：指那些既不是营养物又不是前体但能提高产量的添加剂。对于菌体生长的抑制剂常是次级代谢产物形成的促进剂。2．组成型突变：在DNA上，调节基因R和操纵基因O的突变可干扰阻遏蛋白的形成或结合。RNA聚合酶不需要诱导物便能工作，这类作用称“组成型”突变作用。

3．反馈抑制：某代谢途径终点产物的过量积累抑制该途径前面第一步或第二步酶的活性。

4．次级代谢物：次级代谢物又称次生代谢物，是某些微生物通常在生长后期（分化期）合成的大分子化合物，不是微生物生长所必须的，但对产生菌的生存有一定价值。5．补料分批发酵：又称半连续发酵或半连续培养，指在分批培养过程中，间遏或连续地补加新鲜培养基的培养方法。

6．临界氧浓度：指不影响菌的呼吸或产物合成所允许的最低氧浓度。

7．连续发酵：也称连续流动培养，既培养基料液连续输入发酵罐，同时连续排出含有产品的发酵液。

8．工业生物技术：应用化学、生物学及工程学的原理，对生物催化剂进行改造和改良，并依靠生物催化剂的作用，将物料进行加工转化以提供产品或为社会服务的技术。9．富集培养：是指能增加混合菌群中所需菌种数量的一种技术。方法要领是给混合菌群提供一些有利于所需菌种生长或不利于其他菌种生长的条件。

10．杂交育种：是指将两个基因型不同的菌株经吻哈（或接合）使遗传物质重新组合，从中分离和筛选出具有新性状的菌株。11．原始亲本：经考察选定的准备用来配对杂交的菌株称为原始亲本，常是具有应用潜力的野生菌株或需要进一步改良的现用生产菌株。

12．自然选育：不经过人工处理，利用菌种的自然突变而进行菌种筛选的过程叫自然选育。

13．直接亲本：微生物杂交育种直接用来配对杂交的菌株称为直接亲本。直接亲本由原始亲本经诱变获得，经诱变后带有适当的遗传标记，常用的遗传标记有颜色、营养要求和抗药性等。

14．原生质体融合：在等渗条件下将两亲本的原生质体混合，由聚乙二醇（PEG）作为助融剂，使它们互相凝集，发生细胞融合，接着两亲本基因组由接触到交换，从而实现遗传重组。在再生细胞的菌落中就有可能获得具有理想性状的重组子。

15．组成型酶：细胞不管生长在什么培养基内，为维持细胞的正常生命活动有些酶总是适量存在，这种类型的酶称组成型酶。16．营养缺陷型菌株：是微生物经诱变处理后，由于基因突变，它丧失了合成某种必须物质（氨基酸、维生素或核苷酸碱基）的能力，在基本培养基上不能生长，需要补加该种必须物质后才能生长。

17．生物反应过程：将生物技术的实验室成果经工艺及工程开发，成为可供工业生产的工艺过程统称为生物反应过程，其实质是利用生物催化剂以从事生物技术产品的生产过程。

18．分批富集培养：采用分批培养的方法把富集培养物分次移接到新鲜的同一种培养基并保持相同的培养条件以维持选择压力的培养方法。关键是移种的时间，应在所需菌种占优势的情况下移种。

19．反馈阻遏：某代谢途径终点产物（或其衍生物）的过量积累会阻遏该途径一系列酶的合成。

20．前体：指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中并使产物的产量有较大的提高，而其自身的结构并没多大的变化。

三、简答题

2．青霉素的生物合成受哪些代谢调节的影响？如何正确控制？

（1）青霉素的前体α-氨基己二酸的生物合成受赖氨酸的反馈抑制，或者可解释为它夺去青霉素合成所需的前体—α-氨基己二酸。此外赖氨酸对三肽合成酶有反馈抑制和反馈阻遏作用。因此，提高青霉素菌种生产能力的重要措施是筛选赖氨酸营养缺陷型突变株并限制发酵培养基中赖氨酸的供应量。

（2）半胱氨酸的生物合成

青霉素菌种可通过3条途径固定硫合成半胱氨酸，但经甲硫氨酸是合成半胱氨酸的重要途径，甲硫氨酸对该类抗生素的合成有明显的促进作用，对该类抗生素合成酶起激活剂或诱导剂的作用。因此，经甲硫氨酸是合成半胱氨酸是青霉素合成所必须的。

（3）缬氨酸生物合成的调节

缬氨酸生物合成途径中的第一个酶——乙酰羟酸合成酶，对缬氨酸的反馈抑制是敏感的。高产突变株这一酶已失去与缬氨酸结合的变构位点，且能形成更多的乙酰羟酸合成酶，从而使缬氨酸的合成增加。

（4）氮代谢的调节

NH4Cl对该类抗生素的合成有明显的抑制作用，可能抑制了该类抗生素生物合成的有关酶或与该类抗生素合成有关的其他步骤。这种调节作用可能的靶位：谷氨酸的供给，其他含氮化合物（如蛋白质）的分解代谢，从环境中吸收前体的效力，赖氨酸的分解代谢物为头孢菌素提供侧链前体—α-氨基己二酸。

（5）高浓度葡萄糖的分解代谢物阻遏作用在青霉素合成期，高浓度葡萄糖对青霉素的生物合成会产生强烈的分解代谢物阻遏作用，因此，为保证青霉素正常的生物合成，在青霉素合成期应通过补料控制维持低浓度的葡萄糖。

1．简述微生物选择性分离方法的基本步骤，如何用选择性分离方法从自然界分离获得蛋白酶产生菌？

微生物选择性分离方法步骤：

①含微生物材料(样品分离源)的选择。②分离源材料的预处理。

③所需菌种的选择性分离。

④所需菌种的选择性培养。

⑤菌落的选择和纯化。

利用选择性分离的方法从自然界分离筛选蛋白酶产生菌：

①从蛋白质加工厂（豆制品厂、肉制品厂）附近的土壤中采集样品分离源。

②用富含蛋白质的原料（豆饼）为培养基对样品分离源进行富集培养，使目的菌数量和生长势达到优势。

③样品分离源经富集培养后制成菌悬液，适当稀释后涂布于以酪蛋白为唯一氮源的平板培养基。经保温培养一定时间后，选择分解酪蛋白形成透明圈的菌落。将透明圈直径与菌落直径之比值大的菌落编号后移接于试管斜面培养基，经保温培养长出丰厚的菌落。

④将试管斜面培养基长出各菌株，按编号分别进行小型发酵试验，通过测定发酵结果的蛋白酶活力，筛选出产酶活力高菌株。2．简述诱变育种的一般步骤，如何利用诱变育种的方法选育获得抗噬菌体的菌株？

诱变育种的一般步骤：

出发菌种→斜面活化培养→单细胞或单孢子悬浮液→诱变处理→稀释涂布平板→培养出单菌落→挑取单菌落纯化→摇瓶初筛发酵试验→挑出高产菌斜面→菌种保藏→斜面活化→摇瓶复筛发酵试验→稳定性考查→中试考查→生产应用

利用诱变育种的方法选育抗噬菌体的菌株：①敏感菌株先经人工诱变处理，然后将处理过的细胞或孢子液分离在含有高浓度噬菌体的平板培养基上，经诱变后存活的细胞或孢子中，若存在抗性变异菌株就能在此平板上生长，人工诱变可以提高抗性菌株出现的频率。

②还可将敏感菌株的细胞或孢子经人工诱变处理后接入种子培养基，待菌丝长浓后加入高浓度的噬菌体继续培养几天，再加入噬菌

体反复感染，使敏感菌被噬菌体所裂解，最后取再生菌丝进行平板分离，从中筛选出抗性菌株。

3．用基因表达的操纵子模型解释酶合成的诱导作用的机理。

诱导作用机理：Jacob—Monod模型

有4个基因位于DNA上，调节基因R、启动基因P、操纵基因O、结构基因S。

启动基因P是RNA聚合酶的启动点，该酶负责将DNA转录给信使RNA(mRNA)。无诱导物存在时，调节基因R编码生成的阻遏物与操纵基因O结合，则RNA聚合酶不能移动，不会制造互补于结构基因S的DNA序列的mRNA，所以没有酶形成。

有诱导物存在时，诱导物（基质）与调节基因R编码生成的阻遏蛋白结合，使得阻遏蛋白变构而不能与操纵基因O结合，RNA聚合酶便可从启动基因P移动，并转录结构基因S，进而合成异化基质所需的酶。

1．以发酵工业肌苷酸生产为例阐述如何避开固有的调节机制实现中间产物的积累？（1）目的产物肌苷酸（IMP）所在的代谢途径——嘌呤核苷酸生物合成途径如下：（2）谷氨酸棒杆菌中该途径原有的代谢调节机制为：终点产物AMP(腺苷酸)和GMP(鸟苷酸)施加累积的反馈抑制和阻遏PRPP酰胺转移酶，AMP反馈抑制S-AMP合成酶，GMP反馈抑制和阻遏IMP脱氢酶。

（3）实现肌苷酸生产的措施

①菌种选育：通过诱变获得一缺失S-AMP合成酶的AMP营养缺陷型突变株，这种菌变成需要AMP以供生长。

②培养控制：

菌种保藏和种子培养培养基需提供充足的AMP以保证菌种生长。

生产培养基提供生长限量的AMP，则菌株不会在细胞内积累AMP而达到反馈调节的浓度，AMP和GMP对PRPP酰胺转移酶的累积反馈调节作用被解除，于是菌把更多的碳和氮转化为IMP（肌苷酸）。而IMP脱氢酶仍被GMP反馈抑制和阻遏，只有一小部分IMP转化为GMP，大部分IMP积累并分泌出来。

2．发酵过程中引起pH变化的因素有哪些？如何进行pH的控制？

引起发酵液PH下降的因素有：

（1）培养基中碳、氮比例不当，碳源过多，特别是葡萄糖过量，或中间补糖过多使溶氧不足，致使有机酸大量积累而PH下跌。（2）消泡油加得过多，油脂氧化需更多氧。（3）生理酸性物质存在，氨被利用，PH下降。

引起发酵液PH上升的因素：

（1）培养基碳、氮比例不当，氮源过多，氨基氮释放，使PH上升。

（2）生理碱性物质存在。

（3）中间补料中氨水或尿素等碱性物质加入过多使PH上升。

发酵过程中pH的控制：

了解发酵过程中各个阶段的合适PH以后，需要进一步设法控制PH在合适的范围内。（1）首先在基础培养基配方中考虑到维持PH的需要，碳、氮源的种类和浓度，生理酸性盐、生理碱性盐的使用。

（2）通过中间补糖来控制PH。

①按需补糖：根据生产菌生长代谢对PH的需要来决定补糖速率。

②恒速补糖，PH由加酸、碱来控制。

这两种方法均能达到控制PH的目的，并且糖耗速率几乎相等。但采用按需补糖来控制PH 可获得持久的抗生素高产，比恒速补糖产量提高25%。

（3）中间补加氨水、尿素、硫酸铵、碳酸钙调节PH。

在某些抗生素发酵过程中，发酵液中氨基酸含量较低，PH较低时，可通入氨水。但PH 较高时，超出适合范围，可以用（NH4）2SO4代替氨水以降低PH，以补充氮源的不足。

在乳酸发酵过程中，中间补加CaCO3 维持

PH值在PH5.0以上。

（4）采用PH控制器控制加糖、加酸或加碱。

在发酵过程中利用PH电极来监测发酵过程PH的变化，连续测定并记录PH的变化，将信号输入PH控制器来指令加糖、加酸或加碱，使发酵液的PH控制在预定的值。

3、如何利用选择性分离的方法从自然界分离筛选到纤维素酶产生菌？

①从富含纤维素原料的加工厂（棉花加工厂、秸秆加工厂）附近的土壤中采集样品分离源。

②用富含纤维素的原料（秸秆）为培养基对样品分离源进行富集培养，使目的菌数量和生长势达到优势。

③样品分离源经富集培养后制成菌悬液，适当稀释后涂布于以纤维素粉为唯一碳源的平板培养基。经保温培养一定时间后，选择分解纤维素形成透明圈的菌落。将透明圈直径与菌落直径之比值大的菌落编号后移接于试管斜面培养基，经保温培养长出丰厚的菌落。

④将试管斜面培养基长出各菌株，按编号分别进行小型发酵试验，通过测定发酵结果的纤维素酶活力，筛选出产酶活力高菌株。2．用基因表达的操纵子模型解释酶合成的反馈阻遏作用的机理。

反馈阻遏作用机理：

受反馈阻遏作用控制的酶，是调节基因R编码的阻遏蛋白作用的结果。在正常情况下（无终点产物积累），调节基因R编码的阻遏蛋白无活性，RNA聚合酶能转录结构S基因合成酶。

在终点产物积累的情况下，阻遏物蛋白可被辅阻遏物（终点产物）激活，被激活的阻遏蛋白然后与操纵基因O结合，从而妨碍RNA 聚合酶转录结构S基因合成mRNA，酶的合成过程被阻遏。有时终点产物的衍生物，而不是终点产物本身，是辅阻遏物。3．阐述利用目的产物的结构类似物筛选耐反馈调节作用突变株的原理和方法？

原理：

氨基酸A在正常情况下抑制或阻遏它自己的生物合成酶，其本身又是合成蛋白质所必须的。氨基酸A的结构类似物A、也有相同的抑制或阻遏作用，但不能用于蛋白质合成。诱变菌株在含有A、的培养基中培养，绝大多数细胞因不能合成A而死亡，只有那些对A、不敏感的突变株仍能合成A并长成菌落。

方法：

分离耐反馈抑制或反馈阻遏作用突变株的最简便的方法是选择目的产物的结构类似物。把经诱变的细胞铺在含有这种抗代谢物的平板上，大多数细胞不能生长，从中挑选出耐抗代谢物的突变株。

7、抗噬菌体育种常采用的方法有哪些？（1）利用自然突变来筛选抗性菌株

以噬菌体为筛子，利用微生物的自然突变来筛选抗性菌株，敏感菌株不经任何人工诱变处理由其自然突变为抗性菌株，这种方法获得的抗性菌株频率很低。

（2）如何利用诱变育种来筛选抗性菌株？

①敏感菌株先经人工诱变处理，然后将处理过的细胞或孢子液分离在含有高浓度噬菌体的平板培养基上，经诱变后存活的细胞或孢子中，若存在抗性变异菌株就能在此平板上生长，人工诱变可以提高抗性菌株出现的频率。

②还可将敏感菌株的细胞或孢子经人工诱变处理后接入种子培养基，待菌丝长浓后加入高浓度的噬菌体继续培养几天，再加入噬菌体反复感染，使敏感菌被噬菌体所裂解，最后取再生菌丝进行平板分离，从中筛选出抗性菌株。