3血凝及血凝抑制试验
二О一三年三月专业技术考试
（血凝及血凝抑制试验）
姓名：成绩：
一、填空题：（5分/空，共计75分）
1、检测禽流感抗体，目前在用的检测依据的标准名称为：《高致病性禽流感诊断技术》，其编号（含年号）为：GB/T 18936-2003 。
2、检测新城疫抗体，目前在用的检测依据的标准名称为：《新城疫诊断技术》，其编号（含年号）为：GB/T16550-2008。
3、新城疫抗体检测中，血凝试验所用的磷酸盐缓冲液（PBS)所需pH值为7.2。
4、国标《新城疫诊断技术》中5.2血凝试验操作程序：b）吸取0.025ml病毒悬液加入第1孔中，吹打 3 次~ 5 次充分混匀；
5、国标《新城疫诊断技术》中5.3血凝试验结果判定：a）在PBS对照孔出现正确结果的情况下，将反应板倾斜，观察红细胞是否完全凝集。以完全凝集的病毒最大稀释度为该抗原的血凝滴度。
6、国标《新城疫诊断技术》中HI试验程序6.2.e）每孔加入0.025ml体积分数的1%红细胞悬液，轻晃混匀后，室温（约20℃~ 25℃）静置约40 min，若环境温度太高，放4℃静置60 min。当PBS对照孔红细胞呈明显纽扣状沉到孔底时判定结果。
7、国标《新城疫诊断技术》中HI试验结果判定6.3.a）在PBS对照孔出现正确结果的情况下，将反应板倾斜，从背侧观察，看红细胞是否呈泪珠状流下。滴度是指产生完全不凝集（红细胞完全流下）的最高稀释度。只有当阴性血清与标准抗原对照的HI滴度不大于2log2，阳性血清与标准抗原对照的HI滴度与已知滴度相差在1个稀释度范围内，并且所有阴、阳性血清都不发生自凝的情况下，HI试验结果方判定有效。
二、请简单描述检测新城疫抗体用1%鸡红细胞悬液（RBC)制备方法（25分）
采集①至少三只SPF公鸡或无禽流感和新城疫抗体的非免疫鸡的抗凝血液，放入离心管中，②以2000r/min离心5min-10min，去掉血浆和白细胞层，重复以上过程，③反复洗涤三次（洗净血浆和白细胞），④最后吸取压积红细胞用PBS配成体积分数为1%的悬液，⑤于4℃保存备用。
血凝与血凝抑制试验标准方法
血凝抑制（HI）试验操作规程 1.仪器、设备和试剂的准备 1.1仪器及设备 V型96孔血凝板、微量振荡器、低速台式离心机、含25μL的单道加样器、含25μL的 八道加样器、小圆底试管、吸管。 1.2抗原和试剂： 1.2.1相应HI抗原 1.2.2相应阳性血清 1.2.3生理盐水、阿氏液（血球保护液） 1.2.41%鸡红细胞悬液 1.2.4.1红细胞的采集从2-6月龄SPF公鸡翅静脉采集血液与等量的阿氏液混合（采集后 上下颠倒使血液和阿氏液混匀，防止凝血） 1.2.4.2红细胞的洗涤将于阿氏液混合的血液，分装于圆底试管中，以1000rpm离心5分 钟，吸弃阿氏液；加入适量生理盐水轻轻吸打将红细胞充分混合，以1500rpm离心5-10分 钟，吸弃上清液时，应注意吸弃红细胞表面的白细胞层，并应尽量吸净上清液。按上述步骤， 用生理盐水对红细胞进行洗涤三次，最后一次洗涤应1500rpm离心10分钟（确保红细胞的 压积）。 1.2.4.3吸弃上清液，将沉淀的红细胞吸取1ml，加入99ml生理盐水摇匀配制成1%的红细 胞悬液。（按照需要量配制） 1.2.4.41%红细胞悬液的标定对首次配制的红细胞悬液应进行标定，取配制好的红细胞悬 液60ml，自然沉降后，弃掉上部生理盐水50ml，混匀后装入刻度离心管中，1000rpm离心 5分钟，红细胞压积应为0.6ml 2．HI抗原工作液配制 2.1HI抗原血凝价测定 血凝试验： 1．取一块V型96孔板，按表1每孔加入生理盐水25ul，将HI抗原进行系列倍比稀 释，至11孔后吸取25ul弃去，第12孔为对照，稀释后每孔再加入25ul生理盐水，最后每 孔加入1%鸡红细胞悬液25ul，微量振荡器中速摇匀，置于室温（20—25℃），20~30分钟后 判定结果，以能使100%红细胞凝集的抗原最高稀释倍数作为判定终点。 表1病毒血凝试验 孔号：123456789101112滴度：1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048对照 生理盐水252525252525252525252525抗原(病毒)2525252525252525252525弃去生理盐水252525252525252525252525红细胞悬液252525252525252525252525 轻轻振荡1-2min置于20~25℃静置20-25min后判定结果
病毒血凝和血凝抑制试验以新城疫为例
实践三病毒血凝和血凝抑制试验--（以新城疫为例）实践目的： 1．掌握血凝（HA）和血凝抑制(HI)试验的原理 2．掌握鸡新城疫病毒血凝和血凝抑制试验的操作方法 实践原理： 某些病毒(如鸡新城疫病毒，禽流感病毒等)能够与人或动物的红细胞发生凝集，此即为 病毒稀释倍数1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 对照生理盐水 病毒液 1％红细胞悬液25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl # 表示100％完全凝集++ 表示50％凝集- 表示不凝集
表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。 能使100％红细胞凝集的病毒液的最高稀释倍数，称为该病毒液的红细胞凝集效价。如上例：病毒液的HA效价为1:128，HI试验时，病毒抗原液25微升内须含4个凝集单位，则应将原病毒液作成128/4＝32倍的稀释液。 生理盐水225μl 被检血清 4单位病毒液25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl 振荡器上振荡1～2分钟，放37℃作用20分钟 1%红细胞悬液25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl 振荡器上振荡1～2分钟，放137℃作用15分钟 结果例示-------++##-#注：- 表示不凝集、++ 表示部分凝集、# 表示完全凝集。
淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。 能将4单位病毒物质凝集红细胞的作用完全抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清的红细胞凝集抑制效价，用被检血清的稀释倍数或以2为底的对数(10g2)表示。如上例，该血清的红细胞凝集抑制效价为1：128或HI效价为7(10g2)。 2．根据血凝价将新城疫病毒稀释成4个单位病毒液，每三位学生做一个血凝抑制试验，检测待检血清的血凝抑制效价，记录试验结果 3．回答问题： （1）病毒的血凝和血凝抑制试验的原理是什么？ （2）病毒血凝反应是抗原抗体反应吗，为什么？ （3）病毒血凝抑制反应是抗原抗体反应吗，为什么？
血凝抑制试验
血凝抑制试验 1 适用范围 本标准规定了禽流感的血凝试验、血凝抑制试验。 本标准适用于禽流感抗体的检测（主要适用于血清样品）。 2 血凝试验 2.1 材料与试剂 2.1.1 器材：普通天平、分析天平、普通离心机、微型振荡器、高压灭菌器、刻度离心管、微量移液器及96孔V形微量血凝板。 2.2.2 pH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）。 2.2.3 1%鸡红细胞悬液。 2.2.4 阿氏液。 2.2.5 血凝抗原、被检血清。 2.2 操作程序 A. 取96孔V形微量血凝板，用微量移液器在第1孔~第12孔加25 μL生理盐水，共滴2排。每排的第1孔加入抗原25 μL，用微量移液器，从第1孔~第11孔对抗原作系列倍比稀释：即将第1孔的抗原与生理盐水用移液器反复吹吸3次后，吸出25 μL移至第2孔，再反复吹吸3次后，吸出25 μL移至第3孔，以此类推，直至第11孔。从第11孔中吸出25 μL弃去，此孔抗原的最终稀释度为1:211（即11 log2）。第12孔作为对照孔。 B. 每孔中加入25 μL生理盐水，再加入1%鸡红细胞悬液25 μL。 C. 将血凝板置于微量振荡器上500 r/min振荡1~2 min。 D.在室温18~25℃下静置20~40 min，或37 ℃静置15~20 min，或4 ℃静置60 min。红细胞对照孔成明显的纽扣状沉到孔底时即可判定结果。 2.3 抗原血凝效价判定 A. 在反应时间内，对照孔的红细胞全部沉淀时，观察判读血凝结果。 对于使用V形孔微量血凝板进行的试验，将血凝板倾斜70°，观察沉淀于孔底的红细胞是否沿倾斜面向下呈线状流动（红细胞对照孔成明显的纽扣状沉到孔底），以出现全部凝集（红细胞无流动）的抗原最大稀释度为该抗原的血凝效价，该效价为1个血凝单位（HAU）。 3 血凝抑制试验 3.1 血清的处理 3.1.1 被检血清样品准备
病毒的血凝及血凝抑制试验[医学参照]
病毒的血凝及血凝抑制试验 有些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性 设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(HI) 试验，具有特异性。通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病 毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。 [目的要求] 掌握病毒HA和HI试验的原理和基本操作方法，了解其实用价值。 [材料与试剂] 1. 96孔“U”形或“V”形微量反应板，50μL定量移液器，滴头，微型振荡器。 2. 生理盐水，0.5% 鸡红细胞悬液。 3. 新城疫病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），新城疫阳性血清，被检鸡血清。 [实验内容及操作方法] （一）血球凝集(HA)试验 1. 在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50μL生理盐水。 2. 于左侧第1孔加50μL病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），混合均匀后，吸50μL 至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃50μL；第12孔为红细胞对照。 3. 自右至左依次向各孔加入0.5% 鸡红细胞悬液50μL，在振荡器上振荡，室温 下静置后观察结果（表4-1）。 表 4-1 病毒血凝试验的操作方法（单位：μL） 弃50
4. 结果判定：从静置后10 min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100% 凝集（++++），不凝集者（-）红细胞沉于孔底呈点状。 以100% 凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。从表4-1看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:128，则l:128为1个血凝单位，1:64、l:32分别为2、4个血凝单位，或将128/4=32，即1:32稀释的病毒液为4个血凝单位。 (二) 血球凝集抑制(HI)试验 1. 根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。 2. 在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，自第1孔至第11孔各加50μL生理盐水。 3. 第１孔加被检鸡血清50μL，吹吸混合均匀，吸50μL至第2孔，依此倍比稀释至第10孔，吸弃50μL，稀释度分别为：1:２、1:4、1:8 ……；第12孔加新城疫阳性血清50μL，作为血清对照。 4. 自第1孔至12孔各加50μL 4个血凝单位的新城疫病毒液，其中第11孔为4单位新城疫病毒液对照，振荡混合均匀，置室温中作用10min 。 5. 自第l孔至12孔各加0.5% 鸡红细胞悬液50μL，振荡混合均匀，室温下静置后观察结果（表4-2）。 表4-2 病毒血凝抑制试验的操作方法（单位：μL） 6. 结果判定：待病毒对照孔（第11孔）出现红细胞100%凝集（++++），而血清
血凝抑制实验
摘要：目前在禽流感血凝抑制试验方面存在很多问题，会对血凝抑制试验的意义造成影响从而导致不正确的结果；禽流感抗原也存在相的差异，在实际检测中也容易出现误导。 关键词：血凝抑制相的差异标定 Problems in Hemagglutimation Inhibition Test with Avian Influenza Liu Ping , Liu Dong , Li Bin , Wang QunYi ,Huan XiuRong, Wang ZongSheng ，Fan GenCheng, Du YuanZhao Qingdao YEBIO Bioengineering Co,National Animal Quarantine Institute ,Ministry of Agriculture ,Qindao Shandong Abstract : Quite a few problems exist with regard to hemagglutination test with avan influenza,affecting HI test meanings and leading to wrong results.Phase variation exists in avian influanza antigen,causing mistakes in practical operation of HI test. Keywords: Hemagglutination inhibition,phase variation, standardization 禽流感病毒能够与鸡红细胞发生凝集现象，这种红细胞凝集现象可被特异性免疫血清所抑制，即红细胞凝集抑制实验（HI）。由于血凝反应可被特异性抗体所抑制，抗体与病毒结合后，血凝素不能吸附于红细胞表面的受体上，因此血凝抑制试验可以用于：1）检测血清中的抗体水平。2）鉴定病毒。3）辅助诊断病毒性疾病。4）作为适时免疫的辅助手段，能避免免疫失败、免疫空挡及重复免疫造成的损失。目前在禽流感血凝抑制试验方面存在很多问题，会对血凝抑制试验的意义造成影响从而导致不正确的结果。 一、由于禽流感病毒变异较快，所以在血凝抑制试验中经常会出现不同厂家生产的相同亚型的禽流感抗原所测同一血清的血凝抑制价不同，禽流感亚型病毒株按其血凝抑制试验中所表现的亲和力不同而分为三种类型：对本株和异株免疫血清均呈较高效价的为“ R”相；对本株效价高对异株低的为“ P” 相；对本株及异株均低的为“ Q”相。由此可见养殖户经常反映的打你们厂家的疫苗去别的地方检测结果往往会很低，这就是我们所说的“ P”相，即抗原相的差异。如果在试验中出现相的差异所测结果会相差2-3 个滴度，所以在血凝抑制试验操作时，挑选亲和相毒株作为测定抗原较好，这样会提高诊断的灵敏度
血凝血凝抑制试验说明书
鸡新城疫血凝与血凝抑制实验 鸡新城疫血凝（HA）及血凝抑制(H1)试验 基本原理： 许多病毒表面具血凝素，具有凝集某些动物或人红细胞的特性，称为血凝现象，可用于鉴定病毒。血凝现象可以被特异性抗体所抑制，称为血凝抑制现象，利用这种特性可进行血清学试验，称为血凝抑制试验。器材及试剂: 待检病毒:鸡新城疫病毒鸡胚尿囊液； 待检血清：抗鸡新城疫病病毒阳性血清； 生理盐水/PBS、1%鸡红细胞、96孔V形微量血凝板、加样器等。 实验步骤 PBS的配制： 1%鸡红细胞的配制： （一）血凝试验（HA）取96孔板，按以下步骤操作： 1、第一排1-12孔各加生理盐水50ul，第二排1-12孔加生理盐水50ul为红细胞对照； 2、吸50ul病毒液于第一排第1孔，混匀后取50ul至第2孔，依次稀释至第12孔，弃去50ul，各孔经倍比稀释后稀释度依次为2-1~2-12 。 3、第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微型震荡器震荡2min混匀。 4、室温静置10-30分，观察结果（见下表）。 5、结果判定：红细胞对照组红细胞完全沉降，以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集的病毒最高稀释倍数，作为病毒的血凝价，即HI效价，用2n表示。 （二）四单位检测： （三）血凝抑制试验（HI） 取一96孔板，按以下步骤操作： 1、4个单位抗原的制备：按HA试验测出的病毒血凝价除以4即为4个单位血凝素的稀释度。 2、待检血清的稀释：第一、二、三排1-12孔各加生理盐水50ul，于第一排第1孔中加入50ul待检血清，反复吹吸3-5次混匀后，取50ul至第2孔混匀，吸取50ul至第3孔，依次稀释至第12孔，弃去50ul，经倍比稀释，血清的稀释倍数为21~212 。 3、第一、二排1-12孔各加4个单位血凝素50ul，微量震荡器震荡2min混匀； 4、室温静置20min； 5、第一、二、三排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微量震荡器震荡2min混匀混匀。
血凝和血凝抑制试验
血凝和血凝抑制试验 一些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝(Hemagglutination，HA)。正粘病毒和副粘病毒是最主要的红细胞凝集性病毒；其他病毒包括披膜病毒、细小病毒、某些肠道病毒和腺病毒等也有凝集红细胞的作用，但常要求比较严格的反应条件，例如一定的pH范围等。各种病毒的血凝素性质不尽相同。某些病毒可在很广的pH条件下呈现血凝作用，某些病毒则只在很窄的pH范围内才能凝集红细胞。某些病毒的血凝作用具有温度依赖性，也就是只在一定温度范围内才出现血凝现象；但另一些病毒却可在4℃、室温和37℃呈现同样的血凝作用。病毒凝集的红细胞种类，也随病毒种类而不同，例如某些病毒主要对人和禽的红细胞呈现凝集作用，另一些病毒则可凝集豚鼠或大鼠等的红细胞。 当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以封闭病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触，这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制(HemagglutinationInhibition，HI)，也称为血凝抑制反应。血凝的原理因病毒而有所不同，如痘病毒对鸡红细胞发生凝集作用并非是病毒的本身，而是痘病毒的产物类脂蛋白的作用。而流感病毒的血凝作用是病毒囊膜上的血凝素与红细胞表面的受体糖蛋白相互吸附而发生的。病毒的血凝现象大致可以分为可逆转型、不可逆转性、凝集条件严格型三类。 血凝和血凝抑制试验有常量法和微量法两种，目前国内外广泛使用的都是微量法，各要素用量均为25ul，微量法省时、省料、高效。以下简要介绍本次试验的主要内容，详细内容参见各国标。 各实验室所采用的HA和HI试验程序不同，下面的例子是应用V型微量板进行的试验，两种方法反应总体积都为75ul，本试验所用试剂为如下： 1.生理盐水：用蒸馏水或去离子水配制成0.85％NaCl溶液，高 压灭菌备用。 2.红细胞悬液：采鸡血液，加于倍量的红细胞保存液-阿氏液中，置4℃普通冰箱保存，可用一个月。使用前，取红细胞悬液1份，用5～10倍量的生理盐水洗涤3次，直至上清无色透明。取沉淀红细胞，加生理盐水制备成1％红细胞悬液。
血凝抑制试验
影响禽流感血凝抑制试验因素的分析 及解决方法 摘要：在试验过程中，存在很多的因素会直接影响禽流感血凝抑制试验，从而导致试验结果不正确等现象出现， 禽流感病毒能够与鸡红细胞发生凝集现象，这种红细胞凝集现象可被特异性免疫血清所抑制，即红细胞凝集抑制实验（HI）。基层工作中常用于新城疫、禽流感等免疫抗体的检测，辅助诊断病毒性疾病等，此方法操作简便、快速、准确、实用，但在实践中也常常由于某些因素的影响，从而使试验结果不精确，有时甚至无法判定结果。 1血凝试验原理和方法 血凝(直接血凝)反应(HA)：利用病毒或病毒的血凝素，能选择性凝集动物红细胞及病毒浓度与红细胞凝集程度呈正相关的特性，采集敏感的动物红细胞配制成1%红细胞悬液与待测定的病毒液在微量血凝板上进行红细胞凝集实验，根据红细胞的凝集程度间接测定病毒中的病毒浓度。方法是用鸡红细胞与标准抗原作用，检测出标准抗原血凝单位,为血凝抑制试验作准备。 2影响血凝试验的主要因素 2.1被检血清腐败变性 被检血清腐败变性严重影响免疫抗体检测。因此，血样采集后要及时分离血清，分离后及时测定或放臵在4℃冰箱内保存，要力求新鲜，如暂时不测定可冷冻保存。血清使用前要充分摇匀。 2.2不同来源、不同浓度的红细胞 不同来源、不同浓度的红细胞会使结果差异很大，所以红细胞来源一定要相同。一般需要3只或3只以上公鸡来提供红细胞，将3只以上公鸡红细胞混合在一起。也可由1只公鸡来提供红细胞，但必须经多次试验证明是可行的。有抗体鸡提供的红细胞需要更多次数洗涤。但要注意有时不同的公鸡提供的红细胞对禽流感H5亚型抗体测定，效价差异很大。不同浓度的红细胞对抗体测定也有影响。 2.3病毒悬液和红细胞悬液在使用前没有摇匀 病毒悬液和红细胞悬液如没有摇匀，加入时浓度高低不一，会人为造成误差。因此抗原和红细胞使用前一定要摇匀，保证每一孔中加入的浓度准确一致。
血凝抑制实验报告_1
( 实验报告) 姓名：____________________ 单位：____________________ 日期：____________________ 编号：YB-BH-004573 血凝抑制实验报告Hemagglutination inhibition test report
血凝抑制实验报告 血凝抑制实验报告一 禽流感血凝和血凝抑制试验可用于血清中抗体水平的监测，也可用于判断未使用疫苗群体的感染状态等。该试验是目前世界卫生组织和国际动物健康组织进行全球流感监测所普遍采用的方法，而且因其具有经济、快速、可靠、操作简便、能够处理大量的样品，并能在短时间内报告禽流感抗体水平等优点，已经成为当前基层兽医实验室禽流感疫病监测和免疫抗体检测中最为常用的方法。但因该试验受人为操作影响较大，经常因操作不规范、不严谨等造成结果偏差大、重复性差等问题，现根据几年来的工作经验对该试验过程中应注意的事项做一探讨。 一、血凝试验操作程序 1、取96孔90°V形酶标板，用微量移液器在第一至第五排的1~12孔每孔加25 μL PBS液。 2、吸取25 μL标准禽流感抗原加入到第一排第1孔中充分混匀。 3、从第1孔吸取25 μL混匀后的抗原液加到第2孔中，混匀后吸取25μL 加入到第3孔中，依次进行倍比稀释至第二排最后一孔即第24孔，最后弃去25 μL。第三排孔至第四排孔同上操作。 4、依次向第一至第五排孔的每孔中加入25 μL 1%的鸡红细胞悬液。
5、将酶标板置于微量振荡器上振荡10秒，室温（20-25℃）静置30 min 观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下）。 6、结果判定：将板作45°倾斜，观察红细胞是否呈泪滴状流淌。以完全凝集（不流淌）的抗原或病毒最高稀释倍数为1个血凝单位（HAU） 二、血凝抑制试验操作程序 1、根据血凝试验结果配制4HAU抗原。（即1HAU抗原除以4） 2、取96孔V形酶标板，用移液器在第1~12孔各加入25 μL PBS。 3、在第1孔加入25 μL被检血清，充分混匀后移出25 μL加至第2孔，依次类推，倍比稀释至第12孔，弃去25 μL。 4、按以上步骤加入阳性血清和阴性血清（各做两份），作对照孔。 5、在第1~12孔各加入25 μL 4单位抗原，置于微量振荡器上轻轻混匀，室温20-25℃下静置30 min。 6、每孔加入25 μL 1%的鸡红细胞悬液。置于微量振荡器上轻轻混匀，室温（20-25℃）静置40 min后观察结果，若环境温度过高，可于4℃条件下进行，红细胞将呈明显的纽扣状沉到孔底。 7、结果判定：只有阴性对照孔血清滴度不大于2 log2，阳性对照孔误差不超过1个滴度，试验结果才有效。将酶标板作45°倾斜，以完全抑制红细胞凝集的最大稀释倍数判为该血清的血凝抑制滴度。当被检血清效价大于等于4log2，判为禽流感抗体阳性。 三、试验过程中的注意事项 1样品的保存及试验前处理 1.1 采集的血液样品应及时分离血清，最好分装至离心管中，标记清楚，离
病毒血凝和血凝抑制试验--(以新城疫为例)
实践三 病毒血凝和血凝抑制试验--（以新城疫为例） 实践目的： 1．掌握血凝（HA ）和血凝抑制(HI)试验的原理 2．掌握鸡新城疫病毒血凝和血凝抑制试验的操作方法 实践原理： 某些病毒(如鸡新城疫病毒，禽流感病毒等)能够与人或动物的红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象。这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异性抗体（免疫血清）所抑制，即为红细胞凝集抑制试验。 实践内容： 1．红细胞凝集试验(HA 试验) 主要是测定病毒的红细胞凝集价，以确定红细胞凝集抑制试验所用病毒稀释倍数(抗原单位)。有试管法和微量法两种，现以常用的微量法进行说明。 鸡新城疫病毒的HA 试验现采用微量法，在V 形微量反应板上进行。 (1)首先用微量移液器向每个孔加入稀释液即灭菌生理盐水一滴(25μl)。 (2)用微量移液器取病毒抗原液25μl 加入第1孔内，吸头浸于液体中缓慢吸吹几次使病毒与稀释液混合均匀，再吸取25μl 液体小心地移至第2孔，如此连续稀释至第11孔，第11孔吸取25μl 液体弃掉；病毒稀释倍数依为1:2～1:2048，第12孔为红细胞对照。 (3)再以微量移液器每孔加％红细胞悬浮液1滴(25μl)。 (4)在振荡器上振荡混匀约l ～2分钟，再置37℃作用15分钟后观察结果。 (5)每次测定样品都应同时做红细胞对照。 表1 鸡新城疫血凝效价(HA)的测定术式(微量法) 孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 病毒稀释倍数 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 对照 生理盐水 25 l 25l μ病毒液 25l l l l l 25l l l l l l μl 弃去 1％红细胞悬液 25μ l 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 25μl 感作 置振荡器上混匀1～2分钟，放37℃静置15分钟 # 表示100％完全凝集 ++ 表示50％凝集 - 表示不凝集
鸡新城疫血凝(HA)及血凝抑制(H1)试验
鸡新城疫血凝（HA）及血凝抑制(H1)试验 （一）目的意义： 1.掌握血凝试验（HA）与血凝抑制试验（HAI）的基本方法； 2.了解HA与HI在新城疫病毒及其它病毒诊断和鉴定中的应用。 (二)基本原理： 许多病毒表面具血凝素，具有凝集某些动物或人红细胞的特性，称为血凝现象，可用于鉴定病毒。 血凝现象可以被特异性抗体所抑制，称为血凝抑制现象，利用这种特性可进行血清学试验，称为血凝抑制试验。 （三）器材及试剂: 待检病毒:鸡新城疫病毒鸡胚尿囊液； 待检血清：抗鸡新城疫病病毒阳性血清； 生理盐水、1%鸡红细胞、96孔V形微量血凝板、加样器等。 （四）实验步骤： 一、血凝试验（HA）取96孔板，按以下步骤操作： 1、第一排1-12孔各加生理盐水50ul，第二排1-12孔加生理盐水50ul 为红细胞对照； 2、吸50ul病毒液于第一排第1孔，混匀后取50ul至第2孔，依次稀释至第12孔，弃去50ul，各孔经倍比稀释后稀释度依次为2-1~2-12 。 3、第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微型震荡器震荡2min混匀。 4、室温静置10-30分，观察结果（见下表）。
5、结果判定：红细胞对照组红细胞完全沉降，以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集的病毒最高稀释倍数，作为病毒的血凝价，即HI效价，用2n表示。 二、血凝抑制试验（HI） 取一96孔板，按以下步骤操作： 1、4个单位抗原的制备：按HA试验测出的病毒血凝价除以4即为4 个单位血凝素的稀释 度。 2、待检血清的稀释：第一、二、三排1-12孔各加生理盐水50ul，于第一排第1孔中加入 50ul待检血清，反复吹吸3-5次混匀后，取50ul至第2孔混匀，吸取50ul至第3孔，依次 稀释至第12孔，弃去50ul，经倍比稀释，血清的稀释倍数为21~212 。 3、第一、二排1-12孔各加4个单位血凝素50ul，微量震荡器震荡2min 混匀；
血凝抑制实验报告
血凝抑制实验报告 【导语】实验报告是把实验的目的、方法、过程、结果等记录下来，经过整理，写成的书面汇报。以下是文库小编整理的血凝抑制实验报告，供大家借鉴！ 【篇一】血凝抑制实验报告 禽流感血凝和血凝抑制试验可用于血清中抗体水平的监测，也可用于判断未使用疫苗群体的感染状态等。该试验是目前世界卫生组织和国际动物健康组织进行全球流感监测所普遍采用的方法，而且因其具有经济、快速、可靠、操作简便、能够处理大量的样品，并能在短时间内报告禽流感抗体水平等优点，已经成为当前基层兽医实验室禽流感疫病监测和免疫抗体检测中最为常用的方法。但因该试验受人为操作影响较大，经常因操作不规范、不严谨等造成结果偏差大、重复性差等问题，现根据几年来的工作经验对该试验过程中应注意的事项做一探讨。 一、血凝试验操作程序 1、取96孔90°V形酶标板，用微量移液器在第一至第五排的1~12孔每孔加25μLPBS液。 2、吸取25μL标准禽流感抗原加入到第一排第1孔中充分混匀。 3、从第1孔吸取25μL混匀后的抗原液加到第2孔中，混匀后吸取25μL 加入到第3孔中，依次进行倍比稀释至第二排最后一孔即第24孔，最后弃去25μL。第三排孔至第四排孔同上操作。 4、依次向第一至第五排孔的每孔中加入25μL1%的鸡红细胞悬液。 5、将酶标板置于微量振荡器上振荡10秒，室温（20-25℃）静置30min 观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下）。 6、结果判定：将板作45°倾斜，观察红细胞是否呈泪滴状流淌。以完全凝集（不流淌）的抗原或病毒稀释倍数为1个血凝单位（HAU） 二、血凝抑制试验操作程序 1、根据血凝试验结果配制4HAU抗原。（即1HAU抗原除以4） 2、取96孔V形酶标板，用移液器在第1~12孔各加入25μLPBS。 3、在第1孔加入25μL被检血清，充分混匀后移出25μL加至第2孔，依次类推，倍比稀释至第12孔，弃去25μL。 4、按以上步骤加入阳性血清和阴性血清（各做两份），作对照孔。 5、在第1~12孔各加入25μL4单位抗原，置于微量振荡器上轻轻混匀，室温20-25℃下静置30min。 6、每孔加入25μL1%的鸡红细胞悬液。置于微量振荡器上轻轻混匀，室温（20-25℃）静置40min后观察结果，若环境温度过高，可于4℃条件下进行，红细胞将呈明显的纽扣状沉到孔底。 7、结果判定：只有阴性对照孔血清滴度不大于2log2，阳性对照孔误差不超过1个滴度，试验结果才有效。将酶标板作45°倾斜，以完全抑制红细胞凝集的稀释倍数判为该血清的血凝抑制滴度。当被检血清效价大于等于4log2，判为禽流感抗体阳性。 三、试验过程中的注意事项
影响血凝抑制实验的因素
影响血凝抑制实验的因素 目前，县级实验室做的最多的要数血凝试验和血凝抑制试验。经过反复操作，不断摸索，逐渐找出一些影响血凝抑制试验的因素。现列举出来，以便日后引以为戒。 1 红细胞悬液浓度：来源于不同个体鸡的红细胞，对抗原的敏感性不尽相同。因此实验时最好用3-4只未免疫鸡。配制红细胞时，红细胞浓度低，HI滴度就会下降；红细胞浓度高，HI滴度就会上升。有实验表明，红细胞浓度增加一倍，HI滴度就会上升20.7-0.9，因此，红细胞浓度以1％为宜。 2 抗原的稀释倍数：配制抗原时，浓度必须准确。当抗原浓度高时，HI抗体效价就下降；当抗原浓度抵时，HI抗体效价就上升。 3 实验用的稀释液（PBS）：稀释液的pH值对实验有影响。稀释液的pH值5.8以下，红细胞容易产生自凝现象；pH值在7.8以上凝集图形易消失，也会造成实验误差。而pH值为7.0时，红细胞沉降最充分，图形最清晰，HI效价也最高，因此实验时用ph7.0-7.2的稀释液。 4 实验时的温度：实验时的温度，从4-37℃，随着温度上升，HA与HI滴度提高，但在37℃时，凝集的红细胞易洗脱；4℃以下红细胞易产生自凝，故操作常用18-22℃。 （以上所阐述的是实验室操作过程中存在的几点因素，在实际工作中，也存在着其他诸多原因，如采样的时间、采样的数量、以及由疫苗产生的影响等第。） 血凝抑制试验：一些动物红细胞(如鸡、豚鼠等)以及人“O”型血红细胞上有流感病毒受体，遇流感病毒可产生红细胞凝集现象，简称血凝。若将特异性抗体与流感病毒(血凝素)预先作用后再加入红细胞则不产生凝集，称为血凝抑制现象。用定量血凝素与不同稀释度血清抗体作用后，能完全抑制血凝的最高稀释度，即为血凝抑制抗体效价。 血凝抑制试验主要材料： 1 大孔塑料板，1mL吸管或1mL移液器。 2 双份血清收集及处理：急性期血清于发病3d内采取，恢复期血清于发病后2～4周采取。取0.1mL已分离的血清加入0.9(或0.4)mL霍乱滤液(RDE)(即1∶10或1∶5稀释)摇匀，于37℃水浴中过夜，以去除血清中的非特异性抑制素，次日置56℃水浴50min以灭活多余的RDE。 3 流感病毒血凝素制备：流感病毒接种鸡胚后48h收获的尿囊液，加入1/10000硫柳汞防腐。为了延迟尿盐沉淀可先用无菌生理盐水做等量稀释，置4℃备用。 4 鸡红细胞悬液的制备：从静脉或心脏抽取正常健康鸡血，保存于阿氏(Alsevr＇s)液中，置4℃保存。用前以生理盐水洗3次，末次经2000r/min离心10min，将红细胞用生理盐水配成1％浓度。 血凝素滴定：将流感病毒血凝素在大孔塑料板内用生理盐水从1∶5开始做系列倍比稀释，每孔0.25mL再加入等量1％鸡红细胞，摇匀，置室温或4℃30～45min后观察结果，以出现十十血凝的血凝素最高稀释度为其血凝效价，即为1个血凝单位，实验时采用4个血凝素单位，例如血凝素效价为1∶320，为1个单位，4个单位即为1∶80稀释。正式实验前经校对取4个血凝单位用于实验。 血凝抑制试验步骤： ○1. 将上述已处理的待检血清(1∶10或1∶5)再用生理盐水做系列倍比稀释，每孔加0.25mL。○2加入等量已配好的4个单位血凝素。○3每孔加入0.25mL 1％鸡红细胞，摇匀置室温或4℃30～45min。 血凝抑制试验结果观察：观察结果时将血凝板倾斜数十秒钟，待阴性孔内红细胞自由下滑呈泪滴状时读结果。以出现完全抑制的血清最高稀释度的倒数为抗体的效价。在检测患者双份血清时需在同一次试验中进行，并以恢复期血清抗体效价较急性期抗体效价升高4倍或4倍以上为阳性
血凝抑制实验报告三篇
血凝抑制实验报告三篇 ——WORD文档，下载后可编辑修改—— 禽流感血凝和血凝抑制试验可用于血清中抗体水平的监测，也可用于判断未使用疫苗群体的感染状态等。该试验是目前世界卫生组织和国际动物健康组织进行全球流感监测所普遍采用的方法，而且因其具有经济、快速、可靠、操作简便、能够处理大量的样品，并能在短时间内报告禽流感抗体水平等优点，已经成为当前基层兽医实验室禽流感疫病监测和免疫抗体检测中最为常用的方法。但因该试验受人为操作影响较大，经常因操作不规范、不严谨等造成结果偏差大、重复性差等问题，现根据几年来的工作经验对该试验过程中应注意的事项做一探讨。 一、血凝试验操作程序 1、取96孔90°V形酶标板，用微量移液器在第一至第五排的1~12孔每孔加25 μL PBS液。 2、吸取25 μL标准禽流感抗原加入到第一排第1孔中充分混匀。 3、从第1孔吸取25 μL混匀后的抗原液加到第2孔中，混匀后吸取25μL加入到第3孔中，依次进行倍比稀释至第二排最后一孔即第24孔，最后弃去25 μL。第三排孔至第四排孔同上操作。 4、依次向第一至第五排孔的每孔中加入25 μL 1%的鸡红细胞悬液。 5、将酶标板置于微量振荡器上振荡10秒，室温（20-25℃）静置30 min观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下）。
6、结果判定：将板作45°倾斜，观察红细胞是否呈泪滴状流淌。以完全凝集（不流淌）的抗原或病毒最高稀释倍数为1个血凝单位（HAU） 二、血凝抑制试验操作程序 1、根据血凝试验结果配制4HAU抗原。（即1HAU抗原除以4） 2、取96孔V形酶标板，用移液器在第1~12孔各加入25 μL PBS。 3、在第1孔加入25 μL被检血清，充分混匀后移出25 μL加至第2孔，依次类推，倍比稀释至第12孔，弃去25 μL。 4、按以上步骤加入阳性血清和阴性血清（各做两份），作对照孔。 5、在第1~12孔各加入25 μL 4单位抗原，置于微量振荡器上轻轻混匀，室温20-25℃下静置30 min。 6、每孔加入25 μL 1%的鸡红细胞悬液。置于微量振荡器上轻轻混匀，室温（20-25℃）静置40 min后观察结果，若环境温度过高，可于4℃条件下进行，红细胞将呈明显的纽扣状沉到孔底。 7、结果判定：只有阴性对照孔血清滴度不大于2 log2，阳性对照孔误差不超过1个滴度，试验结果才有效。将酶标板作45°倾斜，以完全抑制红细胞凝集的最大稀释倍数判为该血清的血凝抑制滴度。当被检血清效价大于等于4log2，判为禽流感抗体阳性。 三、试验过程中的注意事项 1样品的保存及试验前处理 1.1 采集的血液样品应及时分离血清，最好分装至离心管中，标记清楚，离心后吸出血清，对应编号冷藏送检，并禁止运输过程中剧
血凝抑制实验报告
血凝抑制实验报告 【篇一】血凝抑制实验报告 禽流感血凝和血凝抑制试验可用于血清中抗体水平的监测，也可用于判断未使用疫苗群体的感染状态等。该试验是目前世界卫生组织和国际动物健康组织进行全球流感监测所普遍采用的方法，而且因其具有经济、快速、可靠、操作简便、能够处理大量的样品，并能在短时间内报告禽流感抗体水平等优点，已经成为当前基层兽医实验室禽流感疫病监测和免疫抗体检测中最为常用的方法。但因该试验受人为操作影响较大，经常因操作不规范、不严谨等造成结果偏差大、重复性差等问题，现根据几年来的工作经验对该试验过程中应注意的事项做一探讨。 一、血凝试验操作程序 1、取96孔90°V形酶标板，用微量移液器在第一至第五排的1~12孔每孔加25μLPBS液。 2、吸取25μL标准禽流感抗原加入到第一排第1孔中充分混匀。 3、从第1孔吸取25μL混匀后的抗原液加到第2孔中，混匀后吸取25μL加入到第3孔中，依次进行倍比稀释至第二排最后一孔即第24孔，最后弃去25μL。第三排孔至第四排孔同上操作。 4、依次向第一至第五排孔的每孔中加入25μL1%的鸡红细胞悬液。 5、将酶标板置于微量振荡器上振荡10秒，室温
（20-25℃）静置30min观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下）。 6、结果判定：将板作45°倾斜，观察红细胞是否呈泪滴状流淌。以完全凝集（不流淌）的抗原或病毒稀释倍数为1个血凝单位（HAU） 二、血凝抑制试验操作程序 1、根据血凝试验结果配制4HAU抗原。（即1HAU抗原除以4） 2、取96孔V形酶标板，用移液器在第1~12孔各加入25μLPBS。 3、在第1孔加入25μL被检血清，充分混匀后移出25μL加至第2孔，依次类推，倍比稀释至第12孔，弃去25μL。 4、按以上步骤加入阳性血清和阴性血清（各做两份），作对照孔。 5、在第1~12孔各加入25μL4单位抗原，置于微量振荡器上轻轻混匀，室温20-25℃下静置30min。 6、每孔加入25μL1%的鸡红细胞悬液。置于微量振荡器上轻轻混匀，室温（20-25℃）静置40min后观察结果，若环境温度过高，可于4℃条件下进行，红细胞将呈明显的纽扣状沉到孔底。 7、结果判定：只有阴性对照孔血清滴度不大于2log2，阳性对照孔误差不超过1个滴度，试验结果才有效。将酶标板作45°倾斜，以完全抑制红细胞凝集的稀释倍数判为该血