蛋白的酵母双杂交操作手册
蛋白的酵母双杂交实验
——以钓饵蛋白筛选cDNA 文库研究蛋白相互作用
第一部分 系统简介
1. 实验原理
蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用 对真核基因转录调控影响的实验。很早就已知道，转录活化蛋白可以和DNA 上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。这种DNA 结合与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两个相互独立的结构域即DNA 结合结构域(Binding Domain, BD)和转录活化结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的。目前酵母双杂交实验采用的系统有LexA 系统和Gal4
系统两种。在LexA 系统中，DNA 结合结构域由一个完整的原核蛋白LexA 构成，转录活化结构域则由一个88个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录; 在Gal4系统中，BD 和AD 分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域(1-147aa 与768-881aa)构成。cDNA 文库或DNA 与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。一般情况下，单独的BD 可以与GAL4上游活化序列（GAL UAS ）结合但不能引起转录，单独的AD 则不能与GAL UAS 结合，只有当BD 与AD 分别表达的融合蛋白由于相互作用而导致两者在空间上相互靠近时，BD 与AD 才能与GAL UAS 结合并且引起报道基因的转录。在BD 与AD 要导入的酵母菌AH109中，通过基因工程的方法在GAL4 UASs 和启动子的下游构建了3个报道基因——ADE2，HIS3，MEL1（或LacZ ），因此可以通过营养缺陷筛选和酵母菌表型的改变来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用。GAL4系统的原理如图所示：
图一：酵母双杂交系统工作原理
Kan r Amp r pGBKT7-bait pACT2-cDNA
2．系统特点
同以往研究蛋白质—蛋白质之间相互作用的实验手段相比，双杂交系统具有其独特优势。首先，融合体蛋白之间的相互作用是在真核酵母细胞内进行，蛋白质有可能保持天然的折叠状态，类似其在体内生理状态下的情况，这是其他离体生化检验方法所缺乏的，因此较之后者，它所证实的蛋白质间相互作用将更接近于在体的真实水平。其次，双杂交系统的敏感度即高，可以检测到在蛋白质之间结合常数低至1mmol/L左右的微弱作用。许多微弱或短暂的蛋白质之间的相互作用可以借助报道基因表达过程中的多级放大效应反映出来；融合蛋白基因在强启动子的作用下，处于较高的表达水平。第三，在筛选cDNA文库时，双杂交系统能够简捷地得到编码相互作用蛋白的基因序列，它只需构建质粒而不必准备抗体或纯化蛋白，省略了其它体外检测蛋白之间相互作用方法所必须的蛋白抽提、纯化等繁琐步骤。
需要指出的是，融合体蛋白必须转运至核内才能活化转录，因此对于胞外配体—受体作用以及需要核外修饰或受磷酸化等翻译后修饰过程介导的蛋白质间相互作用而言，该系统的应用受到一些限制。在进行文库筛选时，假阳性结果常常干扰实验的准确性，除某些文库编码的蛋白质本身含有转录活化成分外，细胞内的其它无关蛋白也可能有类似作用，因此双杂交系统检测的结果必须通过其它蛋白间相互作用的实验来进一步验证。
3．酵母双杂交GAL4系统筛选cDNA文库实验流程
4．GAL系统所用酵母菌株与载体
1). GAL系统所用酵母菌株
注：菌株AH109可利用所带的HIS3、ADE2、MEL1三个报道基进行筛库。
菌株Y187可利用所带的IacZ报道基因来验证两个已知蛋白间的相互作用。
菌株CG-1945可被用于用环己酰亚胺来分离BD-bait和AD-library质粒。
2). GAL系统所用各种质粒
第二部分实验流程
构建于AD载体的cDNA文库的扩增
一．培养基：
LB液体培养基，121℃，15 lbf/ in2灭菌15min
A． bacto-Tryptone 10.0g
B． bacto-Yeast Extract 5.0g
C．NaCl 5.0g
D． 5N NaOH 调pH →7.0
E. ddH2O →1000.0 ml
* LB固体培养平板为含有1.8％琼脂（Agar）的LB培养基
LB/Amp培养基为含有Amp 100 ug/ml（高压后冷却到50℃加入）的LB培养基
二．实验步骤：
1.自-70℃冰箱取出含有DNA文库的甘油菌，置于冰浴中缓慢化冻；
2.用新鲜的LB培养液在1.5ml离心管中将上述甘油菌1:106和1:108稀释；
3.取稀释菌液各10ul加入90ul LB培养液在1.5ml离心管中振荡混匀，涂布LB/Amp
平板(φ90mm); 37℃倒置培养过夜或30℃培养24-36hr,计数平板上单克隆菌落数；
4.确定待扩增的DNA文库滴度（cfu/ml）=克隆数×108(1:106稀释)或克隆数×1010(1:108
稀释)；
5.按照>2-4×104cfu/平板的浓度，涂布LB/Amp平板(φ150mm)，共100块；37℃倒
置培养过夜；
6.在超净台上，将所有生长菌落的平板上加适量LB培养液，将菌落刮下，转入2000ml
LB/ Amp培养液中，37℃振荡培养2-4hr;
7.留取适量培养菌液以50%无菌甘油稀释至25%终浓度，分装，保存于-70℃;
8.其余培养菌液8000rpm×10min, 4℃，收集细菌；用质粒DNA纯化试剂盒大量抽提
质粒DNA。
构建于AD载体的cDNA文库的纯化
一. 试剂：
质粒DNA提取缓冲液
名称缓冲液配方
P1 悬浮缓冲液50mM Tris-Cl,pH8.0; 10mM EDTA; 100ug/ml RNase A
P2 裂解缓冲液200mM NaOH; 1%SDS
KAc,pH5.5
P3 中和缓冲液 3.0M
QBT 平衡缓冲液750mM NaCl; 50mM MOPS,pH7.0; 15%异丙醇; 0.15％TritonX-100 QC 洗涤缓冲液 1.0M NaCl; 50mM MOPS,pH7.0; 15%异丙醇
QF 洗脱缓冲液 1.25M NaCl; 50mM Tris-Cl, pH8.5; 15%异丙醇
二.实验步骤：
1.培养菌液离心6000 rpm×10min，4℃,每500ml的培养物的沉淀重悬于50ml P1缓冲
液;
2.加入50m1 P2缓冲液，倒置4-6次混匀，室温孵育5min;
3.加入4℃预冷的50ml P3缓冲液，快速倒置4-6次混匀，冰浴30min (其间再倒置混
匀4-6次);
4.将上述混合液再倒置混匀，离心12000rpm× 30min, 4℃，保留上清；
5.上清再离心12000rpm× 15min, 4℃，留上清；
6.将上清液上样于经35m1QBT缓冲液平衡的QIAGEN-tip层析柱；
7.以100ml QC缓冲液洗涤层析柱2次；
8.以35m1 QF缓冲液洗脱吸附于层析柱上的DNA；
9.以0.7倍体积异丙醇沉淀DNA，离心12500 rpm × 30min，4℃，小心去除上清；
10.以7m1 70％乙醇洗涤沉淀DNA，离心12500 rpm × 10min，4℃，小心去除上清；
11.将沉淀的质粒DNA溶于5ml TE，pH8.0缓冲液，转移至新的无菌离心管中，用2.5
倍体积无水乙醇；l/10体积3.0M NaAc，pH5.2，于-20℃静置过夜；
12.离心12500rpm × 20min，4℃,去除上清，沉淀用70％乙醇洗涤，超净台风干；
13.干燥的DNA溶于适量体积TE，定量，分装100-200ug/管(用于1次转化反应，约
40ul)，保存于-20℃。
pGBKT7/bait小规模转化酵母菌AH109
一.试剂：
1.培养基：
YPDA液体培养基，(121°C，灭菌15min)
A. YPD (Clontech 公司) 15.0g
B.0.2%Adenine 4.5ml
C. ddH2O →300.0 ml
SD/-Trp 固体培养基，(121°C，灭菌15min)
A.SD Agar Base (Clontech 公司) 4.67g
B.10 × DO (-Leu-Trp) (Clontech 公司) 10.0 ml
C.20 × Leu 5.0 ml
D.ddH2O →100.0 ml 铺5块平板(90-100mm)
2.其它贮备液：
50% PEG 4000 (Sigma 公司, wt.=3,350)，用前抽滤或高压蒸汽灭菌;
100% DMSO (Sigma公司);
10 × TE: 0.1 M Tris-HCl (pH7.5)，10mM EDTA，高压蒸汽灭菌;
10 × LiAc: 1M LiAc用乙酸调pH7.5，高压蒸汽灭菌;
10 × Dropout/ -Trp-Leu 溶液: 3.2 g DO Supplement(-Leu-Trp) 溶于500ml ddH2O中;
20 × Leu: 200 mg L-Leucine (Sigma公司)溶于100ml ddH2O中;
0.2%Adenine: 0.2g Adenine Hemisulfate Salt(Sigma公司)溶于100ml ddH2O中;
ddH2O: 高压蒸汽灭菌;
二.实验步骤：
1.从YPDA平板上挑取生长1-3周、直径2-3 mm的AH109单克隆，接入1 ml YPDA
液体培养基中，振荡打散菌落，然后接入50 ml YPDA液体培养基中，30°C恒温，250rpm振荡培养过夜（16-18hr），至OD600>1.5；
2.取适量过夜菌液接种于300 ml 新鲜的YPDA液体培养基，至OD600=0.2-0.3，30°C
恒温，250rpm振荡培养至OD600=0.4-0.6 (约3hr)；
3.室温离心2500rpm × 5min，弃上清；加入25-50 ml ddH2O或TE 重悬洗涤酵母沉
淀细胞，离心弃上清，重复洗涤一次，沉淀用1.5 ml 1×TE/LiAc重悬后，即为酵母感受态细胞（若仅用于转染质粒，则可置于4°C可几天内使用）；
4.准备下列试剂：
2×转化反应10 ×TE 10 ×LiAc 50% PEG ddH2O
A. 1×TE/LiAc 1.50 ml 150 ul 150 ul / l.20 ml
B. PEG/LiAc 1.20 ml 120 ul 120 ul 960ul /
C. 1×TE 1.00 ml 100 ul / / 900ul
5.分装待转化的质粒DNA，振荡混匀：
pGBKT7-bait 0.1ug
Sperm DNA*(10 mg/ml) 0.1mg
*Sperm DNA 新配制时水浴煮沸20分钟，立即插入冰浴，保存于-20°C
6.每管加入100ul用1×TE/LiAc重悬的酵母感受态细胞，振荡混匀；
7.各加入600ul PEG/LiAc，剧烈振荡（提高转化效率），30°C恒温，200rpm 振荡培
养30min；
8.各加入70ul DMSO，缓缓倒置混匀(不能振荡)，42°C水浴热休克15min，迅速插入
冰浴冷却1-2min；
9.室温离心14,000rpm × 5sec，尽量弃尽上清，以0.5 ml 1×TE重悬沉淀细胞，取100ul
涂布SD/ -Trp固体培养板，30°C倒置培养3天待菌落长出。
钓饵蛋白自身激活报道基因的活性检测
—pGBKT7/bait与pACT2小规模共转化酵母
一.试剂：
1.培养基：
YPDA液体培养基，(121°C，灭菌15min)
A.YPD (Clontech 公司) 15.0g
B.0.2%Adenine 4.5ml
C.ddH2O →300.0 ml
SD/-Trp-Leu 固体培养基，(121°C，灭菌15min)
A.SD Agar Base (Clontech 公司) 4.67g
B.10 × DO (-Leu-Trp) (Clontech 公司) 10.0 ml
C.ddH2O →100.0 ml 铺5块平板(90-100mm)
SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT/X-α-GAL 固体培养基 (121°C，灭菌15min)
A.SD Agar Base (Clontech 公司) 4.67g
B.10 × DO (-Leu-Trp-His-Ade) (Clontech 公司) 10.0 ml
C.ddH2O →100.0 ml
121°C，灭菌15min，冷却到50℃加入适量5M 3-AT（至终浓度15mM）与100ul
X-α-GAL (20mg/ml)，铺5块平板(90-100mm)；
2.其它贮备液：
50% PEG 4000 (Sigma 公司，wt.=3,350)，用前抽滤或高压蒸汽灭菌；
100% DMSO (Sigma公司)；
10 × TE: 0.1 M Tris-HCl (pH7.5)，10mM EDTA，高压蒸汽灭菌；
10 × LiAc: 1M LiAc用乙酸调pH7.5，高压蒸汽灭菌；
10 × Dropout/ -Trp-Leu 溶液: 3.2 g DO Supplement(-Leu-Trp) 溶于500ml ddH2O中；
10 × Dropout/ -Trp-Leu-His-Ade溶液: 3.0 g DO Supplement (-Trp-Leu-His-Ade)溶于
500ml ddH2O中；
0.2%Adenine: 0.2g Adenine Hemisulfate Salt(Sigma公司)溶于100ml ddH2O中；
3-AT（5M）: 4.202g 3-AT溶于10ml ddH2O, 温水浴(<50℃)溶解,无菌滤器过滤后
分装10个EP管,- 20℃保存;
X-α-GAL(20mg/ml): 25mg X-α-GAL溶于1.25ml DMF中；
dddH2O: 高压蒸汽灭菌;
二.实验步骤：
1.从YPDA平板上挑取生长1-3周、直径2-3 mm的AH109单克隆，接入1 ml YPDA
液体培养基中，振荡打散菌落，然后接入50 ml YPDA液体培养基中，30°C恒温，250rpm振荡培养过夜（16-18hr），至OD600>1.5；
2.取适量过夜菌液接种于300 ml 新鲜的YPDA培养基中，至OD600=0.2-0.3，30°C
恒温，250rpm振荡培养至OD600=0.4-0.6 (约3hr)；
3.室温离心2500rpm × 5min，弃上清；加入25-50 ml ddH2O或TE 重悬洗涤酵母沉
淀细胞，离心弃上清，重复洗涤一次，沉淀用1.5 ml 1×TE/LiAc重悬后，即为酵母
感受态细胞；
4.准备下列试剂：
3×转化反应10 ×TE 10 ×LiAc 50% PEG ddH2O
A. 1×TE/LiAc 1.50 ml 150 ul 150 ul / l.20 ml
B. PEG/LiAc 2.00 ml 200 ul 200 ul 1.6ml /
C.1×TE 1.00 ml 100 ul / / 900 ul
5.分装待转化的质粒DNA，振荡混匀：
实验组阳性对照阴性对照用量
pGBKT7-bait pGBKT7-53 pGBKT7-lam 0.2 ug
pACT2 pGADT7-T pGADT7-T 0.1 ug
Sperm DNA*(10 mg/ml) 0.1 mg
*Sperm DNA 新配制时水浴煮沸20分钟，立即插入冰浴，保存于-20°C
6.每管加入100ul用1×TE/LiAc重悬的酵母感受态细胞，振荡混匀；
7.各加入600ul PEG/LiAc，剧烈振荡（提高转化效率），30°C恒温，200rpm 振荡培
养30min；
8.各加入70ul DMSO，缓缓倒置混匀(不能振荡)，42°C水浴热休克15min，迅速插入
冰浴冷却1-2min；
9.室温离心14,000rpm × 5sec，尽量弃尽上清，各以0.1 ml 1×TE重悬沉淀细胞，涂布
SD/ -Trp-Leu固体培养板，30°C倒置培养3天；
10.挑取菌落点种于SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT/X-α-GAL 平板，30°C倒置培养1-2天。
实验组菌落若无生长，说明钓饵无自身激活能力；实验组菌落若生长且变蓝，说明
钓饵有自身激活能力。
文库质粒大规模转化已携带钓饵质粒的酵母
一.试剂：
1.培养基：
SD/-Trp 液体培养基 (121°C，灭菌15min)
A.SD Base (Clontech 公司) 1.335g
B.10 × DO (-Leu-Trp) (Clontech 公司) 5.0 ml
C.20 × Leu 2.5 ml
D.ddH2O →50.0ml
YPDA液体培养基 (121°C，灭菌15min)
A.YPD (Clontech 公司) 15.0g
B.0.2%Adenine 4.5ml
C.ddH2O →300.0 ml
SD/-Trp-Leu 固体培养基 (121°C，灭菌15min)
A.SD Agar Base (Clontech 公司) 32.69g
B.10 × DO (-Leu-Trp) (Clontech 公司) 70.0 ml
C.ddH2O →700.0 ml × 5 铺10×5块平板
（150mm）
2.其它贮备液：
50% PEG 4000 (Sigma 公司，wt.=3,350)，用前抽滤或高压蒸汽灭菌；
100% DMSO (Sigma公司)；
10 × TE: 0.1 M Tris-HCl (pH7.5)，10mM EDTA，高压蒸汽灭菌；
10 × LiAc: 1M LiAc用乙酸调pH7.5，高压蒸汽灭菌；
10 × Dropout/ -Trp-Leu 溶液: 3.2g DO Supplement (-Leu-Trp) 溶于500ml ddH2O中；
20 × Leu: 200 mg L-Leucine溶于100ml ddH2O中；
0.2%Adenine: 0.2g Adenine Hemisulfate Salt(Sigma公司)溶于100ml ddH2O中；
ddH2O: 高压蒸汽灭菌;
二.实验步骤：
1.从SD/-Trp平板上挑取直径2-3 mm、携带pGBKT7-bait质粒（小规模转化）的AH109
单克隆，接入1 ml SD/-Trp液体培养基中，振荡打散菌落，然后接入50 ml SD/-Trp
液体培养基中，30°C恒温，250rpm振荡培养过夜（16-18hr），至OD600>1.5;
2.取适量过夜菌液接种于300 ml 新鲜的YPDA培养基，至OD600=0.2-0.3，30°C恒
温，250rpm振荡培养至OD600=0.4-0.6 (约3hr);
3.室温离心5000rpm × 5min，弃上清, 加入25-50 ml ddH2O或TE 重悬洗涤酵母沉淀
细胞，离心弃上清，重复洗涤一次，沉淀用1.5 ml 1×TE/LiAc重悬后，即为酵母感
受态细胞;
4.准备下列试剂：
10 ×TE 10 ×LiAc 50% PEG ddH2O
1×TE/LiAc 1.50 ml 150 ul 150 ul / l.20 ml
PEG/LiAc 10 ml 1.0ml 1.0ml 8.0ml /
1×TE 10 ml 1.0ml / / 9.0ml
5.取1ml用1.5 ml 1×TE/LiAc重悬的酵母感受态细胞，加入以下成分，振荡混匀：
cDNA文库质粒100ug
10 mg/ml Sperm DNA* 200ul
*Sperm DNA 新配制时水浴煮沸20分钟，立即插入冰浴，保存于-20°C
6.加入6ml PEG/LiAc，剧烈振荡（提高转化效率），30°C恒温，200rpm 振荡培养30min;
7.加入700ul DMSO，缓缓倒置混匀(不能振荡)，42°C水浴热休克15min(间歇轻柔混
匀)，迅速插入冰浴冷却1-2min;
8.室温离心2500rpm × 5min，尽量弃尽上清，以10ml 1×TE重悬沉淀细胞，取200 ul
涂布φ150mm 的SD/ -Trp-Leu固体培养板（共50块），同时取12ul菌液加108ul
1×TE后作1:10，1:102，1:103稀释，涂布3块φ90mm 的SD/ -Trp-Leu固体培养板
（用于计算转化效率），30°C倒置培养3-5天。
附表不同规模转化酵母感受态细胞
小规模大规模库规模
1.YPDA或SD液体培养基扩增酵母50ml 50ml 150ml
2.YPDA液体培养基扩增酵母菌300ml 300ml 1000ml
3.TE或ddH2O洗涤酵母细胞25-50ml 25-50ml 500ml
4.准备 A. 1×TE/LiAc 1.50 ml 1.50ml 8.0ml
B. PEG/LiAc 10ml 10ml 100ml
C. 1×TE 0.5ml 1ml或10ml 10ml
5.分装 A.DNA-BD vector 0.1ug 20-100ug 0.2-1.0mg
B.AD vector 0.1ug 10-50ug 0.1-0.5mg
C.Sperm DNA(10mg/ml) 10ul 200ul 2.0ml
6.1×TE/LiAc重悬感受态细胞 1.5ml 1.0ml 8.0ml
酵母感受态细胞100ul×20 1.0ml 8.0ml
7.加PEG/LiAc，剧烈振荡0.6ml×20 6.0ml 60.0ml
8.加DMSO，轻柔混匀70ul×20 700ul 7.0ml
9.室温离心后弃上清14000rpm×5sec 2500rpm×5min 2500rpm×5min
10.1×TE重悬感受态细胞0.1ml×20 6.0ml 10.0ml
铺固体选择培养基平板φ90mm×20 φ150mm×50 φ150mm×50
注：小规模转化用于：（1）检验DNA-BD/bait 有无自身激活报道基因的能力;
（2）观测 DNA-BD/bait 对宿主的毒性作用;
（3）对照实验;
（4）筛库前先转入DNA-BD/bait;
大规模、库规模转化用于：转入文库质粒或同时转化两种质粒筛库;
转化子的筛选与库质粒纯化
一. 培养基：
SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT/X-α-GAL 固体培养基 (121°C ，灭菌15min)
A. SD Agar Base (Clontech 公司) 4.67g
B. 10 × DO (-Leu-Trp-His-Ade) (Clontech 公司) 10.0 ml
C. ddH 2O → 100.0 ml
121°C ，灭菌15min ，冷却到50℃加入适量5M 3-AT （至终浓度15mM ）与100ul X-α-GAL(20mg/ml),铺5块平板(90-100mm)
65%甘油-硫酸镁缓冲液
A. 甘油 65ml
B. Mg 2SO 4·2H 2O 2.465g
C. 2.0M Tris ·HCl 1.25ml
D. ddH 2O → 100.0ml
二. 实验步骤：
1. 选择菌落数30-300的滴度平板计算转化效率与克隆总数：
假设100ug 库质粒转化时重悬菌液10ml, 以100ul 菌液涂布的1:100的滴度板上菌落数100，则：
2. 筛库要求克隆总数超过文库克隆数（胎肝库为1.6×106克隆）的十倍；若克隆总数
低于106则需重新转化;
3. 将平板移至4°C 冰箱，固化琼脂3-4小时; 转化效率：
克隆总数：
4.超净台中，向每块平板滴加5ml 1×TE，用涂布棒刮下菌落，收集于50ml离心管;
5.室温离心2500rpm×5min，弃上清。用无菌双蒸水反复洗涤3-5次;
6.保存菌种：每管取0.5ml菌液与0.5ml 65%甘油?硫酸镁混匀，-70°C冻存;
7.取适量菌液（使克隆总数达文库滴度的5-10倍），涂布SD/ -Trp-Leu-His-Ade筛选
平板，30°C倒置培养3-5天至菌落出现;
8.挑取菌落点种到SD/ -Trp-Leu-His-Ade/3-AT/X-α-GAL平板，30°C倒置温育，显兰
色的菌落即阳性候选克隆;
9.阳性候选克隆分区划线接种于SD/ -Trp-Leu /X-α-GAL平板上，30°C倒置温育3
天，使同一酵母菌中几种库质粒分离;
10.挑取再次显兰色菌落重复上一步;
11.此次所得兰色菌落点种于SD/ -Trp-Leu-His-Ade/3-AT/X-α-GAL平板，30°C倒置温
育1-2天，显兰色的菌落即可用于质粒提取鉴定。
酵母双杂合系统阳性克隆的鉴定
——酵母质粒DNA的提取
一.试剂与培养基：
SD/-Leu培养液，(121°C，灭菌15min)
A.SD Base (Clontech 公司) 2.67g
B.10 ×DO (-Leu-Trp) 10.0 ml
C.20 ×Trp 5.0 ml
D.ddH2O →100.0 ml
酵母裂解液:2%Triton X-100; 1% SDS; 100mM NaCl; 10mM Tris,pH8.0; 1mM EDTA
A.10% Triton X-100 20.0ml
B.10%SDS 10.0ml
C.NaCl 0.58g
D.Tris 0.12g
E.EDTANa2·2H2O 0.12g
F. 1.0N HCl →pH8.0
G.ddH2O →100.0ml
二.实验步骤：
1.挑取经过酵母营养缺陷平板筛选并分离的兰色酵母单菌落，接种于5.0ml SD/-Leu
液体培养基，30°C恒温，250rpm振荡培养1-2天，使丢失pGBKT7/bait 质粒;
2.室温离心5000rpm×1min，弃上清;
3.加入酵母裂解液200ul，振荡重悬菌团;
4.加入玻璃珠(sigma)0.2g，苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）0.2ml, 涡流振荡5min;
5.-70℃保存过夜或液氮冻存10 min;
6.室温复融，再振荡5 min;
7.室温离心12000 rpm×10min，上清转移至新的1.5 ml离心管中，加入3MNaAc
（1/10V）20ul，无水乙醇（2.5V）500ul，-70℃冻存30-60min;
8.离心12500 rpm×10min，4℃，弃上清；70%乙醇洗涤沉淀，于37℃烘箱或超净台
干燥DNA；以20-30ul无菌ddH2O重悬DNA，保存于-20℃。
大肠杆菌感受态细胞的制备（电转化）
一．培养基：
SOB液体培养基，115℃，101b/in2灭菌15min
A.bacto-Tryptone 10.0g
B.bacto-Yeast Extract 2.5g
C.NaCl 0.25g
D.KCl 0.09g
E.MgCl2·6H2O 1.02g
F.ddH2O →500.0ml
二.实验步骤：
1．挑取LB固体培养基上生长的E.coli KC8单菌落，接种于5ml LB液体培养基中，37℃恒温，250 rpm振荡培养过夜;
2．将 2.5ml新鲜菌液接种于500mlSOB培养液中，37℃恒温，250 rpm振荡培养至OD600=0.5-0.6（约2.5-3hr）;
3．将培养菌液收集于离心管中，冰水浴15-20min;
4．离心6000 rpm×10min，4℃，弃上清；以5ml预冷的无菌ddH2O重悬菌团，再加入500ml 预冷的无菌ddH2O洗涤沉淀细菌;
5．重复上述步骤1次，以充分去除培养基中残余的盐离子成分;
6．用40-50ml预冷的无菌10%甘油重悬沉淀细菌，转移至50ml无菌离心管中，离心6000 rpm×10min，4℃，弃上清；重复此步骤1次;
7．以等体积（约1.5-2.0ml）预冷的无菌10%甘油重悬上述沉淀的感受态细胞，分装200ul/管（5次转化反应），冻存于-70℃备用。
文库质粒DNA电转化大肠杆菌E.coli KC8
1．冰浴条件下，取2ul待转化质粒DNA加入40ul感受态细胞中，混匀;
2．加入间距0.1cm样品杯，电转化（1.8KV，25uF，200Ω）;
3．迅速加入1ml新鲜LB培养液，混匀，转入1.5ml离心管，37℃恒温，250rpm振摇孵育1h;
4．离心2500rpm×5min，4℃，弃上清，保留100ul菌液涂布LB/Amp平板，37℃倒置温育。
碱裂解法小量制备细菌质粒DNA
1.挑取LB固体培养基上生长的E.coli.入单菌落，接种于
2.0ml LB液体培养基中，37℃恒
温，250rpm振荡培养过夜(约12-14hr) ;
2.取1.5m1新鲜过夜菌，室温离心8000rpm×1min,弃尽上清;
3.将沉淀细菌振荡悬浮于100u1溶液I ;
(溶液I：50mM葡萄糖；25mM Tris·Cl; 10mM EDTA，pH8.0)
A. 2.0M Tris-C1，pH8.0 6.25ml
B. 0.4M EDTA, pH8.0 12.50ml
C.葡萄糖 4.730g
D. ddH2O →500ml
4.加200u1新鲜配制的溶液Ⅱ，倒置数次混匀;
(溶液Ⅱ：0.2M NaOH；1％SDS)
A.10M NaOH 0.1 ml
B.SDS 0.5 ml
C.ddH2O 4.4 ml
5.加入150u1预冷的溶液III，振荡混匀；离心12000rpm× 5min，4℃，弃沉淀;
(溶液Ⅲ：KAc缓冲液，3.0MK+; 5.0M Ac-)
A.5MKAc 300.0 ml
B.冰乙酸57.5 m1
C.ddH2O 142.5 m1
6.上清加入450ul的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),振荡混匀,离心12000rpm× 5min,4℃;
7.取上层水相，加0.9ml预冷无水乙醇,-20℃静置2hr以上,离心12000rpm×l5min,4℃;
8.将沉淀DNA用70%乙醇洗1次，37℃烘箱或超净台干燥DNA;
9.沉淀DNA重溶于20ul TE缓冲液(含RNase 10-20ug)，37℃水浴1-2hr后进一步酶切
分析或保存于-20℃。
(TE缓冲液：l0mM Tris-Cl;1mM EDTA)
A．Tris 1.2lg
B．EDTANa2·2H2O 0.37g
C. ddH20 800.0ml
D. 1.0N HCl调pH至所需
E． ddH20 →1000.0ml
DNA的限制性内切酶分析
1.限制性内切酶分析一般在0.5ml或1.5ml Eppendorf 离心管内进行，在适当的温度(通常
为37℃)水浴消化1-2hr;
2.一般每20u1反应体系如下：
A． DNA(0.2-2ug/ul) 7.0ul
B． 10×酶切缓冲液 2.0ul
C．限制性内切酶(10-20U／ul) 1.0ul
D．ddH2O 10.0ul
3.用于制备时，反应总体积可达50-200ul，各反应组分相应增加。
4.多酶消化时若缓冲液条件相同，可同时加入；否则，先做低温或低盐的酶消化，再做高
温或高盐的酶解。
本试验目的是将文库质粒按酶切图谱归类，因此所用酶为高频酶：HaeIII或AluI酶。
DNA片段的连接
1.DNA片段的连接一般在0.5ml或1.5m1 Eppendorf离心管内进行，一般每20 ul反应体系
如下，在适当的温度(通常为12-15℃)水浴8-14hr：
A．载体DNA(0.1-2ug/ul) 2.0ul
B．插入DNA(0.1-2ug/ul) 10.0ul
C．10×T4连接缓冲液 2.0ul
D．T4 DNA连接酶(1.0U／u1) 1.5-2.0ul
E．ddH2O 4.5-5.0ul
2.单酶位点连接时，为避免自身环化可进行脱磷酸化反应，一般在限制性酶切反应结束时，
每20L11反应体系加入2.0ul 10×CIP缓冲液和1-1.5U CIP酶，37℃水浴30-60min，补加0.5M EDTA，pH8.0 1.0ul，75℃热变性5min灭活CIP，然后苯酚：氯仿：异戊醇抽提，乙醇沉淀回收酶解DNA片段，再进行连接反应。
3.平端连接时，使用高浓度T4 DNA连接酶(5-10U/ul)，并加入15％终浓度的PEG8000。
蛋白相互作用的验证
——pGBKT7/bait与pACT2小规模共转化酵母
一.试剂：
1.培养基：
YPDA液体培养基，(121°C，灭菌15min)
A．YPD (Clontech 公司) 15.0g
B．0.2%Adenine 4.5ml
C. ddH2O →300.0 ml
SD/-Trp-Leu 固体培养基，(121°C，灭菌15min)
A. SD Agar Base (Clontech 公司) 4.67g
B. 10 × DO (-Leu-Trp) (Clontech 公司) 10.0 ml
C． ddH2O →100.0 ml 铺5块平板(90-100mm)
SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT/X-α-GAL 固体培养基 (121°C，灭菌15min)
A. SD Agar Base (Clontech 公司) 4.67g
B. 10 × DO (-Leu-Trp-His-Ade) (Clontech 公司) 10.0 ml
C． ddH2O →100.0 ml
121°C，灭菌15min，冷却到50℃加入适量5M 3-AT（至终浓度15mM）与100ul X-α-GAL(20mg/ml),铺5块平板(90-100mm)
2.其它贮备液
50% PEG 4000 (Sigma 公司 wt.=3,350)，用前抽滤或高压蒸汽灭菌;
100% DMSO (Sigma公司);
10 × TE: 0.1 M Tris-HCl (pH7.5)，10mM EDTA，高压蒸汽灭菌;
10 × LiAc: 1M LiAc用乙酸调pH7.5，高压蒸汽灭菌;
10 × Dropout/ -Trp-Leu 溶液: 3.2 g DO Supplement(-Leu-Trp) 溶于500ml ddH2O中;
10 × Dropout/ -Trp-Leu-His-Ade溶液: 3.0 g DO Supplement (-Trp-Leu-His-Ade)溶于
500ml ddH2O中;
0.2%Adenine: 0.2g Adenine Hemisulfate Salt(Sigma公司)溶于100ml ddH2O中;
3-AT（5M）: 4.202g 3-AT溶于10ml ddH2O, 温水浴(<50℃)溶解,无菌滤器过滤后
分装10个EP管,- 20℃保存;
X-α-GAL(20mg/ml): 1.25mg X-α-GAL)溶于1.25mlDMF中;
ddH2O: 高压蒸汽灭菌;
二.实验步骤：
1.从YPDA平板上挑取生长1-3周、直径2-3 mm的AH109单克隆，接入1 ml YPDA
液体培养基中，振荡打散菌落，然后接入50 ml YPDA液体培养基中，30°C恒温，
250rpm振荡培养过夜（16-18hr），至OD600>1.5;
2.取适量过夜菌液接种于300 ml 新鲜的YPDA培养基，至OD600=0.2-0.3，30°C恒
温，250rpm振荡培养至OD600=0.4-0.6 (约3hr);
3.室温离心5000rpm × 5min，弃上清；加入25-50 ml ddH2O或TE 重悬洗涤酵母沉
淀细胞，离心弃上清，重复洗涤一次，沉淀用1.5 ml 1×TE/LiAc重悬后，即为酵母
感受态细胞;
4.准备下列试剂：
3×转化反应10 ×TE 10 ×LiAc 50% PEG ddH2O
A. 1×TE/LiAc 1.50 ml 150 ul 150 ul / l.20 ml
B. PEG/LiAc 2.00 ml 200 ul 200 ul 1.6ml /
C. 1×TE 1.00 ml 100 ul / / 900 ul
5.分装待转化的质粒DNA：
实验组阳性对照阴性对照用量
1.pGBKT7-bait pGBKT7-53 pGBKT7-lam 0.2ug
2. pACT2-Y pGADT7-T pGADT7-T 0.1ug
3．Sperm DNA*(10 mg/ml) 0.1 mg
* Sperm DNA 新配制时水浴煮沸20分钟，立即插入冰浴，保存于-20°C。
6.每管加入100ul用1×TE/LiAc重悬的酵母感受态细胞，振荡混匀;
7.各加入600ul PEG/LiAc，剧烈振荡（提高转化效率），30°C恒温，200rpm 振荡培
养30min;
8.各加入70ul DMSO，缓缓倒置混匀(不能振荡)，42°C水浴热休克15min，迅速插入
冰浴冷却1-2min;
9.室温离心14,000rpm × 5sec，尽量弃尽上清，每管各取0.1 ml 1×TE重悬沉淀细胞，
涂布SD/ -Trp-Leu固体培养板，30°C倒置培养3天;
10.挑取菌落点种于SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT/X-α-GAL 平板，30°C倒置培养1-2天。
实验组菌落若无生长，说明蛋白间无相互作用；实验组菌落若生长且变蓝，说明蛋
白有相互作用;
附录1 培养基组分:
酵母培养基
z YPD（Clontech公司）成分：
Difco peptone 20 g/L
Yeast extract 10 g/L
Agar 20 g/L
10 × Dropout(-His-Trp –Leu-Ade) 溶液
为不含His，Trp，Leu，Ade等成分的10 × Dropout溶液
每1000ml溶液中含有下列成分，可用双蒸水配制后保存4℃
(1) L-Isoleucine L-异亮氨酸300mg
(2) L-Valine L-缬氨酸1500mg
(3) L-Uracil L-尿嘧啶200mg
(4) L-Arginine HC1 L-精氨酸盐酸盐200mg
(5) L-Lysine HC1 L-赖氨酸盐酸盐300mg
(6) L-Methionine L-甲硫氨酸200mg
(7) L-Phenylalanine L-苯丙氨酸500mg
(8) L-Threonine L-苏氨酸2000mg
(9) L-Tyrosine L-酪氨酸300mg
20×氨基酸储存液
每100ml溶液中分别含有下列成分，可用双蒸水配制后保存4℃
20×Trp L-Tryptophan L-组氨酸40mg 20×His L-Histidine L-色氨酸40mg 20×Leu L-Leucine L-亮氨酸200mg
酵母双杂实验步骤
2.1.1酵母双杂交 2.1.1.1Gateway入门克隆 设计Gateway引物时，在上游引物的5'端加上B1序列：GGGG-ACA-AGT-TT G-TAC -AAA-AAA-GCA-GGC-TNN-，下游引物的5'端加上B2序列：GGGG-ACC-ACT-TT G-T AC-AAG-AAA-GCT-GGG-TN-。其中，5'-GGGG序列是保护碱基，防止引物的重要部分被降解，下划线加粗的部分是在整个的Gateway克隆中可以保存下来的序列，3'端的碱基N是为了保证经过入门载体构建目的载体时阅读框的正确性，一般建议为C。 通过PCR扩增获得带有att B位点的基因片段，扩增体系和条件见3.2.2.2，其中将退火温度改为65℃。获得扩增产物后对其进行回收纯化，测定纯化后DNA 的质量和浓度后进行下一步的BP反应，反应体系如下： att B-PCR产物（≥10 ng/μL）1-7μL pDONR221 (150 ng/μL)1μL TE buffer, pH 8.0 补足8μL 将上述混合物加入离心管中，加入2μL BP反应酶，加入之前需将其在涡旋仪上轻轻振荡两次，所有组分混匀离心后，25℃反应1h，加入1μL蛋白酶K后，混匀离心，37℃反应10min终止BP反应，将BP反应产物参照3.2.2.6进行转化，由于pDONR221载体为Kan抗性，所以选用含有50μg/mL Kan抗生素的LB平板进行阳性克隆筛选，参照3.2.2.7检测阳性克隆，然后根据3.2.2.8中的方法提取重组质粒，测定质量和浓度后送至测序公司进行测序。 进行BP反应时，需注意以下几项： (1)对于BP反应来说，最高效的是采用线性的att B-PCR产物和超螺旋的att P 入门载体； (2)为了提高BP反应的效率，可以将建议的25℃反应1h适当延长至4-6h，可 以将效率提高2-3倍，或者延长至过夜反应，可以将效率提高5-10倍，对 于长片段克隆来讲，适当的延长反应时间是非常必要的； (3)提高体系中PCR产物的量可以增加反应效率，但每10μL体系中PCR产物 最好不要超过250ng。 2.1.1.2诱饵载体构建 重组的入门载体测序正确后，通过LR反应来构建酵母双杂交的诱饵载体，LR反应体系如下： 入门载体(50-150 ng)1-7μL pDEST32 (150 ng/μL)1μL TE buffer, pH 8.0 补足8μL
CLONTECH酵母双杂中文版
目录 （一）介绍 4 （二）试剂盒物品清单 7 （三）额外附加物品列表9 （四）酵母菌株11 （五）酵母载体14 （六）方法简述：单杂交文库的构建和筛选16 方法简述：双杂交文库的构建和筛选17 （七）构建用于酵母单杂交的报告质粒载体18 （八）构建用于酵母双杂交的DNA-BD融合载体19 （九）构建生成cDNA文库21 （十）构建和筛选酵母单杂交和双杂交文库（简述）27 （十一）酵母单杂交文库的构建和筛选28 （十二）酵母双杂交文库的构建和筛选30 方法A:通过酵母配对（Yeast Mating）来筛选目的蛋白30 方法B:通过共转化的方法筛选目的蛋白35 （十三）分析阳性相互作用结果38 （十四）问题解决指南44 （十五）参考文献47 （十六）相关产品50 附录A: 双链 cDNA合成的典型结果51 附录B: 酵母感受态的制备—LiAc 法52 附录C：单杂交对照载体信息53 附录D：双杂对照载体信息54 表格列表 Table I． BD Matchmaker酵母菌株的基因型11 Table II． BD Matchmaker酵母菌株的表型11 Table III．单杂交系统的载体14 Table IV．双杂交系统的载体15 Table V．各BD-Matchmaker DNA-BD 载体的比较19 Table VI． RNA起始浓度和PCR扩增循环数之间的关系24 Table VII．单杂交共转化的对照实验的设置29 Table VIII．单杂共转化对照实验：期望的结果29 Table IX．双杂交转化的对照实验的设置33 Table X．双杂交配对筛选的对照实验的设置 Table XI．双杂交共转化的对照实验的设置 Table XII．双杂交共转化的对照实验：期望的结果 Table XIII．用于PCR筛选菌落的Assembling Master Mixs
!!酵母双杂交操作步骤(中文翻译)
各种SD培养基： 1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（？ “四缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ; 葡萄糖20g (即2%) 2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g. (即2%) 3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 4)SD/-leu (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g (即2%) 5)SD/-trp (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g (即2%) 注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。我们这用的是含硫酸铵的。（买来就加进去了的）。如果不含硫酸铵，那么要在终浓度0.17%的YNB中再加入0.5%的硫酸铵，即最终在1000 ml溶液中加入总量为6.7g的YNB与硫酸铵。 实际配制的方法是： 1.配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃ 以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。（李博士经验这一步不高压，过滤即可使用）2.酵母氮源6.7g，加DO supplement 在920ml水中溶解，调PH至5.8（李博士的经验大 约加10M NaOH 200ul即可），之后补水至950 ml。 3.高压完后待温度降至55℃以下，加入50 ml40%葡萄糖。
酵母双杂交技术
酵母双杂交系统 1．原理 酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的 结构域(domain)组成的。例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113 个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而 转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的DNA结合域不 能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只 有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。 2．试验流程 酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细 胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为: 2．1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建 成诱饵质粒。 2．2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。2．3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。 2．4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱 饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。 3．特点 优点 蛋白--蛋白相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。酵母双杂交系统的建立 为研究这一问题提供了有利的手段和方法。 缺点 尽管该系统己被证实为一种非常有效的方法，但它也有自身的缺点和问题。1、它并非对所有蛋白质都适用，这是由其原理所决定的。双杂交系统要求两种杂 交体蛋白都是融合蛋白，都必须能进入细胞核内。因为融合蛋白相互作用激活 报告基因转录是在细胞核内发生的。2、假阳性的发生较为频繁。所谓假阳性，即指未能与诱饵蛋白发生作用而被误认为是阳性反应的蛋白。而且部分假阳性 原因不清，可能与酵母中其他蛋白质的作用有关。3、在酵母菌株中大量表达外源蛋白将产生毒性作用，从而影响菌株生长和报告基因的表达。 使用酵母双杂交技术应注意的问题 真正明了酵母双杂交技术的主要原理及筛选方法是进行酵母双杂交实验的前提，构建成功的诱饵质粒及大量的材料准备是进行酵母双杂交实验的保证。只 有明了双杂交的原理，才有可能设计实验进程、才能有目的的进行材料准备， 并能对实验结果作出预测与分析，尤其要对具体实验中各种选择性压力培养基 的使用目的要十分清楚。大量的材料准备、较长的实验流程是酵母双杂交有别
酵母双杂交操作步骤(中文翻译)
（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中） 概念： 1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。 2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。优点：比次序转化更容易操作。 pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）？ pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林) ？ 各种SD培养基： 1) SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（？“四缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 2) SD/-leu/-trp/-his (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g. (即2%) 3) SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 4) SD/-leu (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）
酵母双杂交试验流程
4月4日划线配培养基TE/LIAC PEG/LIAC 配置培养基（YPD YPDA）取酵母细胞划线30°生长3天。 需要用品：三角瓶灭菌封口膜酵母提取物蛋白胨 注：以下所有涉及菌的操作均需在超净台中完成。 4月6号星期三 （1）选择2-3mm的单克隆（枪头吸取）放入3-5ml的YPDA液体培养基，30°摇菌200rpm，8h 7号下午开始，过夜培养，次日若菌液浓度达到标准，可先置于4度冰箱保存。 需要用品：200ul灭菌枪头、50ml三角瓶、YPDA液体培养基、摇床。 4月7号星期四 （2）吸取2.5-10ul酵母培养液，加入25mlYPDA液体培养基，摇菌16-20h直到OD值0.15-0.3。 下午4点开始8号8点结束 Tips：由于第一次活化的菌夜浓度不一，此处建议设置梯度，分别取2.5、5、10 ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基（转化5个以下质粒的话，25ml菌量就够后续使用）。 4月8号星期五 （3）将菌液转移至灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。 （4）弃掉上清，加入50ml新鲜的YPDA液体重悬菌体（由于离心转速较低，沉淀易悬起来，故倒掉上清液时要小心操作）。 （5）30°震荡培养，直到OD值达到0.4-0.5 （3-5h）。8号8点开始下午一点结束进行以下操作之前，配置好TE/LiAc溶液，并准备好冰浴。 （6）将上述菌液转移至一个灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。（7）弃掉上清，用30ml无菌水重悬菌体（小心操作）。 （8）再次用天平配平后，室温下700g离心5分钟，弃去上清，加入1.5ml 1.1xTE/LIAC重悬菌体。（9）将上述溶液转移到灭菌的1.5mlEP管中，高速离心15s。 （10）弃去上清，加入600ul 1.1x TE/LIAC，感受态细胞制备完成，置于冰上待用。 需要物品：50ml灭菌离心管、50ml 三角瓶、1.5ml EP管、5ml灭菌枪头、1ml灭菌枪头、灭菌ddH2O、YPDA液体培养基、1.1x TE/LIAC。 1.1x TE/LIAC10ML 10xTE 1.1ml 10xliac 1.1ml Dh2O8.8ml
蛋白的酵母双杂交操作手册大全
蛋白的酵母双杂交实验 ——以钓饵蛋白筛选cDNA 文库研究蛋白相互作用 第一部分 系统简介 1. 实验原理 蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用 对真核基因转录调控影响的实验。很早就已知道，转录活化蛋白可以和DNA 上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。这种DNA 结合与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两个相互独立的结构域即DNA 结合结构域(Binding Domain, BD)和转录活化结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的。目前酵母双杂交实验采用的系统有LexA 系统和Gal4系统两种。在LexA 系统中，DNA 结合结构域由一个完整的原核蛋白LexA 构成，转录活化结构域则由一个88个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录; 在 Gal4系统中，BD 和AD 分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域(1-147aa 与768-881aa)构成。在利用GAL4系统筛选cDNA 文库或研究蛋白间的相互作用时，DNA 结合结构域与靶蛋白即“诱饵”相结合，转录活化结构域与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。一般情况下，单独的BD 可以与GAL4上游活化序列（GAL UAS ）结合但不能引起转录，单独的AD 则不能与GAL UAS 结合，只有当BD 与AD 分别表达的融合蛋白由于相互作用而导致两者在空间上相互靠近时，BD 与AD 才能与GAL UAS 结合并且引起报道基因的转录。在BD 与AD 要导入的酵母菌AH109中，通过基因工程的方法在GAL4 UASs 和启动子的下游构建了3个报道基因——ADE2，HIS3，MEL1（或LacZ ），因此可以通过营养缺陷筛选和酵母菌表型的改变来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用。GAL4系统的原理如图所示： 图一：酵母双杂交系统工作原理 Kan r Amp r pGBKT7-bait pACT2-cDNA
文库构建及酵母双杂交技术
第四章基因文库构建及酵母双杂交技术 1 基因组文库的构建 基因组文库（genomic library）将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。 1. 1构建基因文库的载体选用 载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。
第四章基因文库构建及酵母双杂交技术1.1.1对载体的要求：载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。 1.1.2目前常用的载体： 载体系列（容量为24 kp ）、cosmid载体（容量为50 kb ）、YAC（容量为1 Mb ）、BAC （容量为300 kb） 1.2 基因文库构建的一般步骤 1.2.1染色体DNA大片段的制备：断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法，使用物理切割法或不完全酶切法。 1.2.2载体与基因组DNA大片段的连接：直接连接、人工接头或同聚物加尾。
噬菌体载体构建基因组文库
第四章基因文库构建及酵母双杂交技术2 cDNA文库的构建 cDNA克隆的基本过程是通过一系列，酶酶催作用，使poly(A) mRNA转变成双链cDNA群体并插入到适当的载体分子上，转化大肠杆菌寄主细胞，构建包含所有基因编码序列的cDNA基因文库。 2.1高质量mRNA的制备 应用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System 分离Poly(A)RNA。将Biotinylated Oligo(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的Streptavidin，用磁场吸附与PMP相连的SA-Biotinylated Oligo(dT)-mRNA。
酵母单杂交-实验步骤总结
1 pBait-AbAi载体的构建（酵母报道子的构建） 注：酵母报道子（pBait-AbAi）包含目的顺式作用元件的一个或多个拷贝，且插入到pAbAi载体AbAi r报告基因的上游。大量研究表明最有效的构建应包含目的DNA三个以上的首尾连接的拷贝。首尾连接的拷贝产生方式很多，但对于长度小于20 bp的调控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途径。 （1）设计并合成包含目的序列的两条反向平行的寡核苷酸序列，且两端加上与pAbAi载体酶切产物一致的粘性末端（建议合成一个目的序列的突变序列作为对照，以排除可能的假阳性）。 （2）用TE buffer溶解寡核苷酸至终浓度100 μmol/L。 （3）将正向链和反向链按照1:1的比例混合（退火后的双链寡核苷酸最大浓度为50 μmol/L）。 （4）95 ?C保温30 s，去除二级结构。 （5）72 ?C保温2 min，37 ?C保温2 min，25 ?C保温2min。 注：缓慢退火，有助于双链寡核苷酸的形成。 （6）冰上放置。退火后的产物可贮存在-20 ?C冰箱备用。 （7）酶切1 μL pAbAi载体，用凝胶回收纯化或柱纯化的方式纯化酶切产物。 注：回收前，可用琼脂糖凝胶检测是否酶切完全。 （8）将退火后的寡核苷酸稀释100倍至终浓度为0.5 μmol/L。 （9）在连接反应管中加入如下成分： pAbAi载体（50 ng/μL） 1.0 μL annealed oligonucleotide （0.5 μmol/L） 1.0 μL 10×T4 DNA ligase buffer 1.5 μL BSA（10 mg/mL）0.5 μL Nuclease-free H2O 10.5 μL T4 DNA ligase （400 U/μL）0.5 μL 总体积15 μL 注：如果有必要，可用1 μL nuclease-free H2O代替寡核苷酸作为阴性对照。 （10）将反应体系室温放置连接3 h，转化E coli，采用常规方法检测阳性克隆。
(完整版)酵母双杂交原理
酵母双杂交系统原理 酵母双杂交系统(Yeast Two-hybrid System)由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA 结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)，而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。 双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。 酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。主要是由于：①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型，X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交筛选原理 双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80年代的工作表明, 转录激活因子在结构上是组件式的(modular), 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, 简称为DB，？BD)和转录激活结构域(activation domain, 简称为AD), 它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合, 但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。如酵母细胞的Gal4蛋白的DB与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录。 Fields等人的工作标志双杂交系统的正式建立。他们以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型, 将前者与Gal4的DB结构域融合, 另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)。如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转
酵母双杂交实验流程(精).doc
模块七蛋白质之间的相互作用 1.实验目的 本实验以重组质粒和酵母细胞为材料, 学习检测蛋白质相互作用的基本原理和 技术方法。主要介绍酵母双杂交的基本原理与操作技术 ; 让学生了解和掌握酵母双 杂交系统的应用 ; 掌握酵母感受态的制备的基本原理和主要的操作步骤。 2.实验原理 1989 年Fields 和Song 等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认 识(即细胞内基因转录的起始需要转录激活因子的参与,提出并建立了酵母双杂交系 统。该系统作为发现和研究活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平 台 ,近几年得到了广泛的运用和发展。 相比于其它蛋白质筛选系统,酵母双杂交系统具有以下优点:(1 检测在真核活细 胞内进行 ,在一定程度上代表细胞内的真实情况。(2 作用信号是在融合基因表达后, 在细胞内重建转录因子的作用而给出的 ,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。(3 检测结果是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互 作用。(4 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA 文库 ,能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能蛋白。(5 通过mRNA 产生多种稳定的酶使信号放大。同时,酵母表型、X-Gal 及 HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交系统也具有一定的局限性。首先 , 经典的双杂交系统分析蛋白间的 相互作用定位于细胞核内,因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白 的研究。酵母双杂交系统的另一个局限性是“假阳性”。在酵母双杂交系统建立的 初期阶段 ,由于仅仅采用β-半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系,这种报告基因的表 达往往不能十分严谨地被控制,因此容易产生假阳性。由于某些蛋白本身具有激活 转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用, 使DNA 结合结构域融合蛋白在 无特异激活结构域的情况下也可被激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白
酵母双杂交试验流程
4月4日划线配培养基 TE/LIAC PEG/LIAC 配置培养基（YPD YPDA）取酵母细胞划线 30°生长3天。 需要用品：三角瓶灭菌封口膜酵母提取物蛋白胨 注：以下所有涉及菌的操作均需在超净台中完成。 4月6号星期三 （1）选择2-3mm的单克隆（枪头吸取）放入3-5ml的YPDA液体培养基，30°摇菌200rpm，8h 7号下午开始，过夜培养，次日若菌液浓度达到标准，可先置于4度冰箱保存。 需要用品：200ul灭菌枪头、50ml三角瓶、YPDA液体培养基、摇床。 4月7号星期四 （2）吸取2.5-10ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基，摇菌16-20h直到OD值0.15-0.3。 下午4点开始 8号 8点结束 Tips：由于第一次活化的菌夜浓度不一，此处建议设置梯度，分别取2.5、5、10 ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基（转化5个以下质粒的话，25ml菌量就够后续使用）。 4月8号星期五 （3）将菌液转移至灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。 （4）弃掉上清，加入50ml新鲜的YPDA液体重悬菌体（由于离心转速较低，沉淀易悬起来，故倒掉上清液时要小心操作）。 （5）30°震荡培养，直到OD值达到0.4-0.5 （3-5h）。8号 8点开始下午一点结束进行以下操作之前，配置好TE/LiAc溶液，并准备好冰浴。 （6）将上述菌液转移至一个灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。（7）弃掉上清，用30ml无菌水重悬菌体（小心操作）。 （8）再次用天平配平后，室温下700g离心5分钟，弃去上清，加入1.5ml 1.1xTE/LIAC重悬菌体。（9）将上述溶液转移到灭菌的1.5ml EP管中，高速离心15s。 （10）弃去上清，加入600ul 1.1x TE/LIAC，感受态细胞制备完成，置于冰上待用。 需要物品：50ml 灭菌离心管、50ml 三角瓶、1.5ml EP管、5ml灭菌枪头、1ml灭菌枪头、灭菌ddH2O、YPDA液体培养基、1.1x TE/LIAC。 1.1x TE/LIAC 10ML 10xTE 1.1ml 10xliac 1.1ml Dh2O 8.8ml
酵母双杂交操作手册 by shenao
酵母双杂交操作手册 by shenao Y2H所需材料: PJ69-4A PJ69-4α or AH109 Y187 pGBKT7 DNA-BD Vector (bait) pGADT7 AD Vector (prey) pGBKT7-53 Control Vector pGBKT7-Lam Control Vector pGADT7-T Control Vector pCL1 Control Vector 3' DNA-BD & AD Sequencing Primers Herring testes carrier DNA Yeast extract，Dextrose(glucose); SD base; DO Supplement; Peptone，with DMF) TE buffer DMSO PEG/LiAc (10X) TE/LiAc buffer (10X) X-a- gal( Yeast Phenotypes –––Ade, His, Leu, Requires adenine (Ade), histidine (His), leucine (Leu), or tryptophan (Trp) in the –or Trp medium to grow; is auxotrophic for at least one of these specific nutrients. Expresses the ADE2 reporter gene; i.e., does not require Ade in the medium to +Ade grow. +His Expresses the HIS3 reporter gene; i.e., does not require His in the medium to grow.
酵母双杂交实验 教案
酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid） 一、实验目的 掌握酵母双杂交原理和方法。 二、实验原理 酵母双杂交系统的原理是利用转录激活因子在结构上是组件式的，即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中有DNA结合结构域（DNA binding domain, DB）和转录激活结构域（activation domain, AD），它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合，但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。根据转录因子的这一特性，将BD 与已知的诱饵蛋白质X 融合，构建出BD-X质粒载体；将AD 基因与cDNA 文库，基因片段或基因突变体（以Y表）融合，构建AD-Y质粒载体。两个穿梭质粒载体共转化至酵母体内表达。 蛋白质X 和Y的相互作用导致了BD与AD在空间上的接近，从而激活UAS 下游启动子调节的酵母菌株特定报告基因（如ADE2，HIS3，MEL1或 LacZ）等的表达，使转化体由于HIS3 或LEU2 表达，而可在特定的缺陷培养基上生长，同时因LacZ 表达而在X-Gal 存在下显蓝色。 图 1-1 酵母双杂交基本原理 酵母双杂交系统在发展中增添了接合型酵母双杂交和反向酵母双杂交系统。其中接合型双杂交系统就是已预先将文库转化了某个接合型的单倍体酵母，然后再和转化了诱饵质粒的相反接合型的单倍体进行接合，形成二倍体，并检测报告基因的表达。 酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与DBD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。 (2)与AD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称靶蛋白(prey)。(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。而菌株则具有相应的缺陷型。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。 酵母双杂交系统常应用在：(1)研究两个已知蛋白是否存在相互作用，同一蛋白是否有自身相互作用以及相互作用的分子区域。(2)用已知功能的蛋白做诱饵，在cDNA文库中寻找有相互作用的未知蛋白，以获取蛋白质相互作用的网络途径信息。(3)以功能未知的新蛋白去筛选文库，根据选到的靶蛋白的已知功能来推测该新蛋白的功能。(4)建立蛋白质相互作用的图谱。 使用酵母双杂交系统应注意如下问题：(1) 在筛选文库之前，要检测诱饵质粒转化后表达的诱饵蛋白本身能否激活报告基因。(2)由于诱饵蛋白的存在致使报告基因His产生渗漏表达（leaky）。一般情况下，在培养基中加入3-AT（3-amino-1,2,4-triazole）可以有效地抑止His报告基因的渗漏表达。(3)在完成筛选之后，需检测猎物蛋白是否自激活。 一个完整的利用酵母双杂交筛选相互作用蛋白的实验包括cDNA文库的构建，诱饵基因载体构建，载体
酵母双杂交实验流程
模块七蛋白质之间的相互作用 1. 实验目的 本实验以重组质粒和酵母细胞为材料，学习检测蛋白质相互作用的基本原理和技术方法。主要介绍酵母双杂交的基本原理与操作技术；让学生了解和掌握酵母双杂交系统的应用；掌握酵母感受态的制备的基本原理和主要的操作步骤。 2. 实验原理 1989年Fields和Song等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认识（即细胞内基因转录的起始需要转录激活因子的参与），提出并建立了酵母双杂交系统。该系统作为发现和研究活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，近几年得到了广泛的运用和发展。 相比于其它蛋白质筛选系统，酵母双杂交系统具有以下优点：（1）检测在真核活细胞内进行，在一定程度上代表细胞内的真实情况。（2）作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。（3）检测结果是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互作用。（4）酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能蛋白。（5）通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型、X-Gal 及HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交系统也具有一定的局限性。首先，经典的双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白的研究。酵母双杂交系统的另一个局限性是“假阳性”。在酵母双杂交系统建立的初期阶段，由于仅仅采用β-半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系，这种报告基因的表达往往不能十分严谨地被控制，因此容易产生假阳性。由于某些蛋白本身具有激活转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域融合蛋白在无特异激活结构域的情况下也可被激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生“假阳性”结果。产生“假阴性”结果的原因可能有许多蛋白质间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、磷酸化和二硫键形成，还有些蛋白的正确折叠和功能有赖于某些非酵母蛋白的辅助等。 现在的酵母双杂交系统大都采用多种报告基因，如AH109酵母株含有三类报告基因—ADE2、HIS3、MEL1/lacZ，这三类报告基因受控于三种完全不同、异源性的GAL4-反应元件和三类启动子元件-GAL1、GAL2以及MEL1（如图6-1-1）。通过这种方法就消除了两类最主要的假阳性，一类是融合蛋白可以直接与GAL4结合位点结合或者是在结合位点附近结合所带来的假阳性；另一类是融合蛋白和某种转录因子结合后再结合到特定的TA TA盒上所带来的假阳性。ADE2一种报告基因就已经能够提供较强的营养选择压力，这时选择性地使用HIS3报告基因，一来可以降低假阳性率；二来可以控制筛选的严格性（如果需要筛选与诱饵蛋白具有较强结合的蛋白，就可以同时使用ADE2、HIS3两种报告基因；如果只需要筛选与诱饵蛋白具有中等强度或较弱结合的蛋白，就可以使用ADE2或HIS3两者中的一种）。MEL1和lacZ分别编码α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶，可以作用于相应的底物
酵母双杂交实验步骤
LexA酵母双杂交系统简介 一、LexA酵母双杂交系统的设计原理 报告质粒p8op-LacZ的GAL4 UAS编码序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活剂的情况下，报告基因LacZ的转录活性为零，该基因的筛选标志为URA3，可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因组DNA上。 质粒pLexA的筛选标志为HIS3，在双杂交系统中用于表达DNA-BD(202个氨基酸残基组成的LexA蛋白)与目标蛋白(钓饵，Bait)的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控，选择与报告基因的操纵子LexA×8结合。 质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位点(EcoR I与Xho I)上游，含有SV40核定位(SV40 nuclear localization)、HA(血凝素)及AD(来自于E.coli的88个氨基酸残基组成的B42蛋白)等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu，它与LacZ报告基因具有相同的操纵子-LexA，但两者启动子不同。 根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性，即可激活报告基因的转录和表达。分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载体和pB42AD质粒载体的多克隆位点中，然后共同转入含有报告基因的酵母菌株，如果蛋白X与Y能相互作用，则启动报告基因的转录和表达，通过检测报告基因的表达情况，就可以间接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。 如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库，则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白，并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。 二、商品化酵母双杂交系统的组成 1. 载体质粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库 2. 酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侣菌株） 3. 大肠杆菌菌株：E.coli KC8株 4. 对照质粒： 质粒用途 pLexA-53，pB42AD-T 阳性对照 pLexA-Pos(LexA/GAL4 AD融合蛋白〕阳性对照 pLexA-Lam(LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用) 假阳性检测质粒 5. 引物： pLexA测序引物及pB42AD测序引物。 三、酵母双杂交实验的基本流程 1. 将报告基因p8op-LacZ转化酵母EGY48菌株，用培养基SD/-Ura筛选。 2. 同时构建或扩增DNA文库，并纯化足够的质粒以转化酵母细胞。 3. 构建DNA-BD/靶蛋白质粒pLexA-X，作为钓饵(bait)。 4. 将上述钓饵质粒pLexA-X转化EGY48(p8op-LacZ)细胞株，用SD/-His/-Ura筛选；并用固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Ura检测此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激活报告基因的活性，以及对酵母细胞是否具有杀伤毒性。 转化质粒选择培养基克隆生长情况说明
蛋白质组学-酵母双杂交实验策略
蛋白质组学-酵母双杂交联合实验策略 蛋白质作为生命活动实际执行的分子，在生物机理研究中处于非常重要的地位。随着蛋白与表型的相关关系、因果关系被逐渐阐明，生物机理的研究往往需要深入到蛋白相互作用层面。如何选择合适的蛋白分子，研究与之相互作用的蛋白网络，从而阐释生理过程也是科研实践中的经典问题。另一方面，天然情况下的蛋白互作，可以采用Co-IP等技术进行检测，然而对于植物、微生物、非模式动物等研究，往往缺乏合适的抗体，定制抗体周期长造价又高。 如何选择合适的蛋白，如何在没有抗体的情况下开展蛋白互作研究？这里，小编和大家一起分享一篇最新的文献，一起来看一看蛋白互作研究“套路”吧。 标题：Identification of proteins using iTRAQ and VIGS reveals three bread wheat proteins involved in the response to combined osmotic-cold stress 期刊：J ournal of Proteome Research 主要技术：iTRAQ、酵母双杂交（Y2H） 研究背景：非生物逆境压力（Abiotic stress）对作物的影响巨大，其具体机制尚不明确。本文拟通过蛋白质组学与酵母双杂交等技术，初步研究渗透压-寒冷联合胁迫对小麦生长影响的机制。 研究结果： 1. 渗透压-寒冷联合胁迫影响小麦表型 对实验材料渗透压-寒冷联合胁迫处理24小时，可以发现其高度、根系长度、根与叶的重量等一系列表型发生显著的变化。
图1 渗透压-寒冷联合胁迫对小麦表型的影响 2. 渗透压-寒冷联合胁迫影响小麦蛋白表达 分别提取实验组（渗透压-寒冷联合胁迫处理）与对照组小麦根和叶片的蛋白，采用iTRAQ标记进行蛋白质组学研究，分别鉴定到3703（根）和3009（叶）个蛋白，其中差异表达蛋白分别为250（根）和258（叶）个。对差异蛋白分别进行GO和KEGG分析，从整体上分析差异表达蛋白的生理功能（图2）。
酵母单杂交实验方法.
酵母单杂分析 酵母单杂交技术是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用的一种方法，通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析来鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因，或对结合位点进行分析。运用此技术能筛选到与DNA结合的蛋白质，并可直接从基因文库中得到编码该蛋白质的核苷酸序列而无需复杂的蛋白质分离纯化操作，故在蛋白质研究中具有一定的优势；而且酵母属真核细胞，通过酵母系统得到的结果比其它体外技术获得的结果更能体现真核细胞内基因表达调控的情况。 【实验目的】 了解酵母单杂交的基本原理和应用，掌握酵母单杂交的主要步骤及注意事项，学会酵母感受态的制作与转化，基因文库的构建及筛选。 【实验原理】 酵母单杂交方法是根据DNA结合蛋白（即转录因子）与DNA顺式作用元件结合调控报告基因表达的原理来克隆编码目的转录因子的基因（cDNA）。该方法也是细胞内分析鉴定转录因子与顺式作用元件结合的有效方法。如图所示，将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子（minimal promoter，Pmin）上游，Pmin启动子下游连接报告基因。进行cDNA融合表达文库时，编码目的转录因子的cDNA融合表达载体被转化进入酵母细胞后，其编码产物（转录因子）与顺式作用元件结合，就可以激活Pmin启动子，并促使报告基因表达。根据报告基因的表达，筛选出与已知顺式元件结合的转录因子。
“Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System”提供了一个简单高效的构建cDNA文库并进行酵母单杂交筛选的方法，它使用aureobasidin A 抗性基因作为报告基因，筛选效率高，背景低。单杂交筛选是从酵母双杂交筛选发展而来，利用单杂交筛选可以对cDNA文库进行筛选直接获得与目的顺式作用元件相结合的蛋白质。 图2 用Matchmaker Gold One-Hybrid System筛选protein-DNA相互作用的原理 The Matchmaker Gold One-Hybrid Library Screening process主要包括以下步骤： 1 将已知序列（bait）克隆到pAbAi载体。 2 pBait-AbAi质粒转化Y1HGold酵母菌株，使其与酵母基因组发生重组，生成bait/reporter酵母菌株。 3 检测Y1HGold bait菌株AbAi r基因的本底表达水平。 4 合成cDNA并通过cDNA和pGADT7-Rec载体共转化酵母进行细胞内同源重组筛选cDNA文库。 5 筛选结果的验证和分析。 【实验准备】 1 仪器设备 微量取液器（2.5 μL；20 μL；50 μL；100 μL；200 μL；1000 μL）、PCR仪、低温离心机、台式离心机、CHROMA SPIN TM+TE-400纯化柱、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统、恒温摇床、恒温孵箱、通风橱、制冰机、振荡器、恒温金属浴、酒精浴、无菌接种环、10 cm培养皿、15 cm培养皿等。