实验四 转氨基作用

实验四 转氨基作用
实验四 转氨基作用

实验四转氨基作用(纸层析法)

原理

氨基酸分子上的氨基转移到α-酮酸分子上的反应过程称为转氨基作用(或称氨基移换作用)。转氨基作用是氨酸代谢的重要反应之一,由转氨酶催化。经转氨后,原来的α-—氨基酸变成了相应的α-—酮酸,原来的α-—酮酸则成为新的、相应的α-—氨基酸。

本实验观察谷氨酸与丙酮酸在肌匀浆中的谷氨酸—丙酮酸转氨酶(简称GPT)的催化进行转氨基的过程。然后用纸层析法检查反应体系中丙氨酸的生成。为便于观察转氨基作用,在反应中须加一碘醋酸(或—溴醋酸),以抑制谷氨酸和丙酮酸的其它代谢过程。

试剂

1.0.9% NaCl溶液。

2.PH7.4 0.01mol/L磷酸缓冲液:取0.2mol/LNa2HPO4溶液81ml与0.2mol/LNaH2PO4溶液19ml 混匀,稀释至2000ml。

3.1%谷氨酸钾溶液:取谷氨酸1g ,加水20ml,用5%KOH调到中性,然后用pH7.4 0.01mol/L 磷酸缓冲液稀释至100ml。

4.1%丙酮酸钠溶液:取丙酮酸1g加pH7.4 0.01mol/L磷酸缓冲溶液溶解成100ml。

5.0.25%一碘酸钠溶液:取一碘醋酸0.25g加水1ml,用5%KOH调到中性,然后加pH7.4,0.01mol/L磷酸缓冲液成100ml。(一碘醋酸可用一溴醋酸代替)。

6.2%HAc

操作

1.肌匀浆的制备(由实验室准备室制备)

取小白兔一只,猛击头部处死后,立即剪颈放血,取肌肉若干经0.9%NaCl溶液洗去血污后,称取肌肉约100g置电动匀浆器中,再加0.01mol/LpH7.4磷酸缓冲液500ml磨成匀浆。

2.转氨基反应:取小试管2支编号,所加试剂以滴为单位。

编号

1 2

试剂

肌匀浆10 10

将2号管置沸水浴中5分钟,然后取出冷却

1%谷氨酸钾10 10

1%丙酮酸钠10 10

0.25%—碘醋酸钾 5 5

混匀后同置40℃水浴中保温45分钟(或60分钟)。在保温过程中,时加振摇。取出两管各加入2%醋酸2滴,再同置沸水浴中5分钟,使蛋白质完全凝固,冷却后,离心(200r/min)

5分钟,(或静置10分钟),将上清液作氨基酸的纸层析。

附氨基酸的纸层析

原理

层析法又称色层分离法,原指有色物质在吸附剂上因吸附能力不同而得到分离的方法。后来此方法也应用于无色物质的分离。层析法除了吸附层析以外,还有离子交换层析、分配层析和亲和层析等。纸层析是分配层析中的一种。

分配层析是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数不同而得到分离的。通常用a表示分配系数。

溶质在固定相中的浓度(Cs)

a= —————————————

溶质在流动相中的浓度(CL)

一种物质在某溶剂系统中的分配系数,在一定的温度下是一个常数。

纸层析是以纸作为惰性支持物的分配层析,纸纤维上的羟基具有亲水性,因此以滤纸吸附的水作为固定相,而通常把有机溶剂作为流动相。有机溶剂沿着滤纸自下而上流动的,称为“上行法”;自上而下流动的,称为“下行法”。

将样品点在滤纸上(此点称为原点),进行展开,样品中的种种溶质(如各种氨基酸)即在两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同,不同的溶质随流动相移动的速率不等,于是就将这些溶质分离出来,形成距原点不等的层析点。

溶质在滤纸上的移动速率用Rf值表示;

原点到层析点中心的距离

Rf=———————————————————

原点到溶剂前沿的距离

只要条件(如温度、展开溶剂的组成、滤纸的质量等)不变,Rf值是常数。故可根据Rf值作定性分析。

层析后,各种溶质在滤纸上的位置可用适当的化学或物理方法处理而使其显示出来。对于氨基酸常用茚三酮使之显色。

试剂

1.饱和水的酚:取50 g重蒸馏酚(隔水加热溶化,量取50ml。)与25ml水,在分液漏斗中充分混匀,于暗处放置过夜(7—10小时),分成两层,收集下层清液放入棕色瓶中保存。注意:在重蒸馏和移取酚时,务必防止溅在皮肤上,若溅在皮肤上,立即用70%酒精擦洗,以免腐蚀皮肤。

2.0.1—0.25% 茚三酮丙酮(或乙醇)溶液。

3.0.1 谷氨酸溶液:将转氨基作用实验中的试剂3,用pH7.4 0.01mol/L磷酸缓冲液稀释10倍。

4.0.1丙氨酸溶液:取丙氨酸用pH7.4 0.01mol/L磷酸缓冲液配制。

操作

1.向层析缸中装入饱和水的酚(其深度约1.5cm)。

2.取宽4.5cm,长18cm滤纸一条,(手指不可接触纸面)在滤纸条一端2cm处划一水平线(原线),在此线上以间隔相等的距离用铅笔画四个直径约2—4mm的小圆圈,标明号码。

3.用毛细管向各小圈中央点上各种不同的氨基酸溶液,并记录之。例如:第一点为谷氨酸,第二点为丙氨酸,第三点及第四点为转氨基作用实验中的1号及2号试管溶液。点样直径以3mm为宜。

4.待干燥后可重复点样一、二次,再干燥。然后将此纸条插入上述准备好的层析缸中。先

将纸条悬挂于玻璃缸内的横玻棒上(或用棉线代替),调节其高度,使纸条的下端浸入酚内约1 cm ( 勿使氨基酸小点与溶剂直接接触),然后把盖盖紧。(如图20所示)。

图20上行法纸层析

5.经1—1.5小时,当溶剂上升至约10—15 cm高时,取出滤纸,置烘箱烘干或用电吹风吹干,使酚蒸发。

6.将已烘干的滤纸浸入茚三酮酒精溶液,再置干燥箱中烘干(或用电吹风吹干),这时在纸的不同位置上,可见紫红色的斑点出现,用铅笔描绘溶剂前沿和斑点的中心位置。

结果

计算出各氨基酸的Rf值。

附注

1.纸层析法不仅可以用于氨基酸的分离和定性,还可以用于定量测定(把紫色斑点剪下来,用硫酸铜乙醇溶液洗脱下来比色),更可以应用于糖、维生素、抗菌素、有机酸等小分子物质的分离和分析。

2.各种氨基酸在同一实验条件下(即相同的溶剂、温度、滤纸质量)各有其特有的、不变的Rf值,这是我们鉴定氨基酸的重要根据。并且同一氨基酸的Rf值也可随溶剂,滤纸质量或操作情况(如温度等)的不同而改变。例如在溶剂中Rf值相近的二种氨基酸在乙溶剂中可能Rf植相差较多。因此为了彻底分离某一混合氨基酸溶液(例如蛋白水解液),常可用更换溶剂或双向层析的方法。

实验十六 转氨基作用

实验十六转氨基作用 【目的】 氨基酸的转氨作用在体内所有器官组织几乎都能进行,但不同的组织器官ALT(GPT)的活性大小不同。 【原理】 丙氨基酸与α-酮戊二酸在Ph7.4时,经ALT催化进行转氨基作用生成丙酮酸和谷氨酸。丙酮酸与2,4-二硝基苯肼作用,生成棕红色丙酮酸2,4-二硝基苯腙,用颜色深浅表示酶活性大小。本实验以肝和肌进行比较。 ALT 丙氨酸 + α–酮戊二酸谷氨酸 + 丙酮酸 37℃ 丙酮酸 + 2,4 –二硝基苯肼丙酮酸二硝基苯腙(棕红色) 【试剂】 1.0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4) 称取磷酸氢二钠(Na2HPO4)11.928g,磷酸二氢钾(KH2PO4)2.176g加蒸馏水溶解并稀释至1000ml。 2.ALT基质液 称取DT-丙氨酸1.79g, α-酮戊二酸29.2mg于烧瓶中,加0.1 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液80ml,煮沸溶解后待冷,用1mol/L NaOH调节pH至7.4(约加0.5ml),再用0.1mol/L磷酸盐缓冲液稀释到100ml,混匀加氯仿数滴置冰箱可保存数周。 3.2,4-二硝基苯肼溶液 2,4-二硝基苯肼19.8mg用10mol/L HCl 10ml溶解后,加蒸馏水100ml,置于棕色瓶内,冰箱保存。 4.0.4 mol/L氢氧化钠溶液 将16g氢氧化钠溶解于水中,并加水至1000ml。 【器材】 乳钵和细砂、滴管、试管、试管架、恒温水浴箱。 【操作】

1.将家兔处死后,立即取出肝和肌,分别以冰生理盐水洗去血液。取10g新鲜肝和肌组织,分别剪碎,加pH7.4缓冲液10ml加细砂研碎,研成匀浆后再加pH7.4缓冲液20ml混匀,用棉花过滤,此即为肝和肌的浸提液. 2.取试管2支按下表操作: 表3-18 转氨基作用操作步骤 【结果及分析】 【思考题】 比较两管颜色,说明哪种组织ALT活性高,为什么?

实验十二转氨作用(精)

实验十二 转氨作用 【实验目的】 1.通过实验掌握水平方向滤纸层析原理和技术 2.了解转氨作用过程。 【实验原理】 转氨基作用是由转氨酶(氨基转移酶)催化的,在这个反应中,α-氨基酸的氨基与α-酮酸的酮基之间交换,α-氨基酸转变成相应的α-酮酸,α-酮酸变成新的一种α-氨基酸。转氨基作用是一种可逆反应。每个转氨基反应均由专一的转氨酶所催化,在不同的生物有机体中均有转氨酶分布。 本实验是将丙氨酸和α-酮戊二酸与肝匀浆一起水浴反应,肝中的丙氨酸氨基转移酶(ALT ,又称谷丙转氨酶GPT )含量丰富,该酶可将丙氨酸的氨基转移给α-酮戊二酸,产生丙酮酸和谷氨酸。利用圆盘纸层析鉴定谷氨酸的存在,并且验证组织中的转氨作用。在肝脏谷丙转氨酶(GPT)催化的转氨基作用,反应方程式如下: CH COOH CH 2NH 2CH 2COOH + + C O COOH CH 3CH CH 3COOH NH 2 C COOH CH 2O CH 2COOH 谷氨酸 丙氨酸 丙酮酸α‐酮戊二酸 【实验材料】 1. 实验器材 培养皿;表面皿;滤纸;匀浆器;试管;试管架;恒温水浴锅;毛细管;移液管;喷雾器;剪刀;铅笔;格尺。 2. 实验试剂 ⑴ 0.01M pH7.4磷酸缓冲液:0.2MNa 2HPO 4溶液81ml , 0.2MNaH 2P04溶液19ml 混匀,蒸馏水稀释20倍。 ⑵ 0.1M 丙氨酸溶液:称取丙氨酸0.891克先溶于少量0.01MpH7.4磷酸缓冲液中,以1MNa0H 仔细调节至pH7.4后,用磷酸盐缓冲液加至100ml 。 ⑶ 0.01M a-酮戊二酸溶液:称取a-酮戊二酸1.461克先溶于少量0.01M pH7.4磷酸缓冲液中,用1M Na0H 仔细调节至pH7.4后,用磷酸盐缓冲液加至100ml 。 ⑷ 0.1M 谷氨酸溶液:称取谷氨酸0.735克先溶于少量0.01M pH7.4磷酸缓冲液中, 以1MNa0H 仔细调节至pH7.4后,用磷酸缓冲液加至100ml 。 ⑸ 0.2%茚三酮溶液:称取茚三酮0.2克溶于100ml 95%乙醇中。 (6)层析溶剂:水饱和的苯酚。 【实验操作】 1. 肝匀浆的制备: 取新鲜的猪肝5g,加入20m1预冷0.01M pH7.4磷酸缓冲液,用捣碎机迅速成匀浆(1万转大约30秒)。两人一组进行如下的实验。 2. 转氨反应: 取干燥大试管二支,分别标明测定管与对照管,按下表进行操作: 试剂(ml) 测定管 对照管 肝匀浆 0.5 0.5

22 生物化学实验--纸层析法测定肝组织的转氨基作用

纸层析法测定肝组织的转氨基作用 【目的】 1 .掌握纸层析法的原理和方法。 2 .熟悉相关转氨酶的临床意义。 【原理】 转氨基作用是氨基酸代谢的一个重要反应。在转氨酶作用下,将氨基酸的氨基转移到α- 酮酸上。每种转氨基反应均由专一的转氨酶催化。转氨酶广泛分布于机体各器官、组织,例如肝细胞中存在的丙氨酸氨基转移酶,能催化α- 酮戊二酸与丙氨酸之间的转氨基作用。反应式如下: 纸层析是以滤纸作为支持物,与滤纸纤维素结合的水(约占纸重 20 ~ 30 %)称为层析中的“固定相”。另一种和固定相不能混合或部分混合的溶剂则为“流动相”。把欲分离的物质加在纸的一端,并使流动相借滤纸的毛细现象移动,此时,待分离溶质因分配系数不同而逐渐分布于滤纸的不同部位。层析过程中或层析结束时,用显色剂使被分离的物质显出颜色,成为一个个色斑。分配在固定相中趋势较大的成分在纸上随流动相移行的速度就小,色斑距原点的位置就较近。反之,分配在固定相内趋势较小的成分移行就远,色斑位置离原点也远。溶质在纸上的移动速率可用比移(R f )表示: 同一氨基酸在相同的层析条件下 R f 值相同,不同氨基酸在相同层析条件下 R f 值不同,因此可以根据 R f 值来鉴定被分离的氨基酸。层析时,用显色剂茚三酮使氨基酸显色,将样品氨基酸的 R f 值与标准氨基酸的 R f 值比较,即可确定所分离氨基酸的种类。 【器材】 1 .研钵

2 .剪刀 3 .恒温水浴 4 .点样毛细管 5 .漏斗 6 .表面皿或小平皿 7 .新鲜动物肝脏 8 .直径 10cm 圆型新华滤纸 9 .中试管和小试管 10 .电炉或吹风机或烘箱 11 .直径 10cm 的培养皿 【试剂】 1 . 0.2mol/L , pH7.4 磷酸缓种液 Na 2 HPO4 溶液 81ml 与 0.2mol/L NaH 2 PO4 溶液 19ml 混匀,再用蒸馏水稀释 20 倍。 2 . 0.1mol/L 丙氨酸溶液 称取丙氨酸 0.891g 先溶于少量 pH7.4 磷酸盐缓冲液中,以 0.1mol/LNaOH 仔细调节至 pH7.4 后,用磷酸缓冲液加至 100ml 。 3 . 0.1mol/L 谷氨酸溶液 称取谷氨酸 0.735g ,先溶于少量 pH7.4 磷酸缓冲液中,以 1mol/LNaOH 仔细调节至 pH7.4 后,用磷酸缓冲液加至 50ml 。 4 . 0.1mol/L α- 酮戊二酸溶液 称取α- 酮戊二酸 1.46g 先溶于少量 pH7.4 磷酸缓冲液中,以 1mol/L NaOH 仔细调至 pH7.4 后,用磷酸缓冲液加至 100ml 。 5 .层析剂(展开剂) 取 100ml 重蒸苯酚与 25ml 水摇匀,加入茚三酮使终浓度达 0.1% 。

实验六纸层析法观察转氨基作用实验报告课件.doc

实验六纸层析法观察转氨基作用 【实验名称】:纸层析法观察转氨基作用 09 救援一班第三大组李岚宇2009222336 室温:28° (一)实验目的: 1、学习氨基酸纸层析的基本原理。 2、掌握氨基酸纸层析的操作原理。 (二)实验原理: 转氨基作用是氨基酸代谢过程中的一个重要反应,在转氨酶的催化下,氨基酸的а-酮酸与α- 酮基的互换反应称为转氨基作用。转氨基作用广泛地存在于机体各组织器官中,是体内氨基 酸代谢的重要途径。氨基酸反应时均由专一的转氨酶催化,此酶催化氨基酸的α-氨基转移 到另一α-酮基酸上。各种转氨酶的活性不同,其中肝脏的丙氨酸氨基转移酶(ALT )催化如下反应: ALT α—酮戊二酸+ 丙氨酸谷氨酸+ 丙酮酸 本实验以丙氨酸和α-酮戊二酸为底物,加肝匀浆保温后,用纸层析法检查谷氨酸的出现, 以证明转氨基作用。纸层析属于分配层析。以滤纸为支持物,滤纸纤维与水亲合力强,水被吸附在滤纸的纤维素的纤维之间形成固定相。有机溶剂与水不相溶,把预分离物质加到滤纸 的一端,使流动溶剂经此向另一端移动,这样物质随着流动相的移动进行连续、动态的不断 分配。由于物质分配系数的差异,而使移动速度就不一样,在固定相中,分配趋势较大的组 分,随流动相移动的速度就慢,反之,在流动相分配趋势较大的成分,移动速度快,最终不 同的组分彼此分离,物质在纸上移动的速率可以用比值Rf 表示: 物质在一定的溶液中的分配系数是一定的,故比值Rf 也相对稳定,因此在同一层析体系中 可用Rf 值来鉴定被分离的物质。 (三)实验材料与仪器: 试剂: 1、0.01mol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲液。 2、0.2mol/L Na 2HPO4 溶液81ml 与0.2mol/L NaH 2 PO4 溶液19ml 混匀,用蒸馏水稀释 20 倍。 3、0.1mol/L 丙氨酸溶液称取丙氨酸0.891 克,先溶于少量0.01mol/L pH 7.4 磷酸盐缓 冲液中,以1.0 N NaOH 仔细调至pH7.4 后, 加磷酸盐缓冲液至100ml。 4 、0.1mol/L -α酮戊二酸称取α-酮戊二酸 1.461 克,先溶于少量0.01mol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲液中,以 1.0 N NaOH 仔细调至pH 7.4 后,加磷酸盐缓冲液至100ml。 5、0.1mol/L 谷氨酸溶液称取谷氨酸0.735 克,先溶于少量0.01mol/LpH 7.4 磷酸盐缓 冲液中,以 1.0 N NaOH 仔细调至pH 7.4 后, 加磷酸盐缓冲液至50 ml。 6、0.5%茚三酮溶液称取茚三酮0.5 克于100 ml 丙酮中溶解。 7、层析溶剂:将重蒸过的酚 2 份和水 1 份按比例混合后,放入分液漏斗中,震荡, 静置24 小时后分层,将下部酚层转移到瓶中备用。 仪器:玻璃匀浆器、10ml 试管、培养皿、表面皿、沸水浴锅、37℃恒温水浴箱、9cm 圆滤纸、烘箱、手术剪刀、分液漏斗。

浙大生化实验报告氨基转换反应

实验报告 课程名称: 生化实验甲 指导老师: 成绩:__________________ 实验名称: 氨基移换反应及其产物的鉴定 实验类型: 同组学生姓名: 一、实验目的和要求(必填) 二、实验内容和原理(必填) 三、实验材料与试剂(必填) 四、实验器材与仪器(必填) 五、操作方法和实验步骤(必填) 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析(必填) 八、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、学习鉴定氨基移换反应的简便方法及其原理; 2、学习纸层析的原理和操作技术。 二、实验基本原理 1.氨基移换反应: 在氨基移换酶(转氨酶)的催化下,氨基酸的α-氨基和α-酮酸的α-酮基之间发生的互换反应。 转氨酶的种类很多,任何一种氨基酸进行转氨作用时都由其专一的转氨酶催化。转氨酶的最适pH 接近7.4,在各种转氨酶中,谷丙转氨酶(GPT )和谷草转氨酶(GOT )的活性最强。 转氨酶广泛存在于机体的各种组织中。在肝、心、肾等组织中谷丙转氨酶(glutamic pyruvic transaminase, GPT )、谷草转氨酶(glutamic oxalacetic transaminase,GOT )活性较高。 GPT 催化下的转氨基反应为: L -谷氨酸脱氢酶在体内特别是在肝细胞内含量丰富,活性高,催化L -谷氨酸氧化脱-NH2,加碘乙酸能抑制其活性,从而可以保护氨基移换反应的产物L -谷氨酸。 本实验用纸层析法,检查由丙氨酸和α—酮戊二酸在肝细胞谷丙转氨酶(GPT) 的作用下所生成的谷氨酸,证明组织内的氨基移换作用。 2. 纸层析原理: 滤纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。利用不同物质在两个互不相溶的溶剂中分配情况(溶解度)的不同来分离混合物的一种技术。 层析溶剂是由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上羟基具有亲水性,因此吸附一层水作为固定相,而通常把有机溶剂作为流动相。进行分离时,由于被分离物质的组分在两相中的分布不同,随着流动相的移动,物质将在两相间进行连续的、动态的不断分配,从而造成不同组分移动的速度也不相同。易溶于流动相中的组分移动快,在固定相中溶解度大的组分移动慢,于是得到分离。

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