蛋白质相对分子质量的测定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法

蛋白质相对分子质量的测定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
蛋白质相对分子质量的测定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法

蛋白质相对分子质量的测定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法

一、实验目的

1、学会SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法原理。

2、掌握用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量的操作技术。

二、实验原理

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是对蛋白质进行量化,比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。SDS与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。SDS-

蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后,蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,而电荷因素可以被忽略。SDS-PAGE因易于操作和广泛的用途,使它成为许多研究领域中一种重要的分析技术。

Acr和bis单独存在或混合在一起时是稳定的,但在具有自由基团体系时就能聚合。引发自由基的方法有化学法和光化学法两种。化学法的引发剂是过硫酸铵(Ap),催化剂十四甲基乙二胺(TEMED);光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸铵,在紫外光照射下引发自由基团。采用不同浓度的acr、bis、Ap、TEMED使之聚合,产生不同孔径的凝胶。因此可按分离物质的大小、形状来选择凝胶浓度。

SDS是十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate)的简称,它是一种阴离子表面活性剂,加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开,并结合到蛋白质分子上(在一定条件下,大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质),使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷,其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量,从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素,于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线,可求得未知物的分子量。

三、实验器材及数据

30%分离胶储存液、10%浓缩胶储存液、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、电泳缓冲液、样品溶解液、染色液、脱色液;标准蛋白,样品蛋白;电泳槽,移液管1ml,烧杯100ml

四、注意事项

1、acr和bis均为神经毒剂,对皮肤有刺激作用,操作时应戴口罩和手套,纯化应在通风处内进行。

2、玻璃板表面应光滑洁净,否则在电泳时会在凝胶板与玻璃板之间产生气泡

3、因SDS可吸附考马斯亮蓝燃料,染色前先用脱色液浸泡凝胶,洗去SDS。这可使染色及脱色时间缩短,并使蛋白带染色而背景不染色

五、实验步骤

1、安装垂直板电泳槽

(1)将密封用硅胶框放在平玻璃板上,然后将凹型玻璃与平玻璃重叠。

(2)用手将两块玻璃板夹住住放入电泳槽内,玻璃室凹面朝外,插入斜插板。

(3)用蒸馏水试验封口处是否漏水。

2、制备凝胶板

分离胶制备:30%Air-Bis溶液2.5ml,Tris-HCL缓冲液(pH值为8.9)1.5ml,去离子水2ml,

10%AP 60μl,TEMED 10μl,置于小烧杯中混匀。用移液枪吸取混合后的凝胶溶液,加至长、短玻璃板间的窄缝内,加胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm。用吸管在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸馏水(约3~4cm),用于隔绝空气,使胶面平整。分离胶凝固后,可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限。倒掉重蒸馏水,用滤纸吸去多余的水。

浓缩胶的制备:取Air-Bis溶液400μl,Tris-HCL缓冲液(pH值为6.7)750μl,去离子水0.9ml,10%AP 30μl,TEMED 7.5μl置于小烧杯中混匀。用移液枪吸取混合后的凝胶溶液,加至长、短玻璃板间的窄缝内(及分离胶上方),距短玻璃上缘0.5cm处,轻轻加入样品槽模板。待浓缩胶凝固后,轻轻取出样品模槽板,用手夹住两块玻璃板,上提斜插板,使其松开,然后取下玻璃胶室,去掉密封用胶框,用1%电泳缓冲液琼脂胶密封底部,再将玻璃胶室凹面朝里置入电泳槽。插入斜插板,将电泳缓冲液加置内槽玻璃凹口以上,外槽缓冲液加到距平玻璃上沿3mm处。

3、加样

用移液枪将一份2μl标准蛋白和3份5μl样品蛋白分别加入凝胶凹型样品槽底部,带所有凹型样品槽内都加了样品,即可开始电泳。

4、电泳

将直流稳压电泳仪开关打开,开始时将电压调至80V。待样品进入分离胶时,将电压调至120V。当标准蛋白带分离得较清晰时,将电压跳回到零,关闭电源。拔掉固定板,取出玻璃板,用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去,在玻璃板一端切除一角以作为标记,将胶板移至大培养皿中染色。

5、染色及脱色

将染色液倒入培养皿中,用微波炉加热20s,在摇床上放置2min,倒掉染色液,加入脱色液,在摇床上放置至能看清蛋白质带。

六、数据处理与记录

七、思考题

1、用SDS-凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量时为什么要用巯基乙醇?

答:保持蛋白质的二级结构.蛋白中如果有二硫键存在的话,会容易被氧化断开,使用巯基乙醇就可以免除这一隐患

2、是否所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其相对分子量?为什么?

答:SDS 凝胶电泳法测定的分子量是相对分子量,而且如果分子量如果太小或者>200Kd,一般都不会用PAGE来测定。SDS-PAGE分离范围一般在15~200Kd,超过这个范围,蛋白条带都挤在一起了,无法进行准确比较。

八、思考与总结

每次做实验都会犯一些很傻的错误啊TAT而且这次实验居然还预习错实验了……到实验室之后一脸懵逼地看着不认识的试剂。第一次配好分离胶,把胶加到玻璃板缝里之后发现是漏的……因为检漏的方法是错的,而且玻璃板没有固定好=_=||所以大家在等分离胶凝固的时候我们才开始重新配溶液。虽然有这样的小错误,但不影响之后的实验进程哦~老师在讲解怎么使用电泳槽的时候,同组的另一个同学在已经凝固的分离胶上加入了浓缩胶,等老师讲解完的时候我们的浓缩胶也凝固啦,正好赶上大家的进度OvO所以最后完成得很快,蛋白质带也挺清晰的~下一次实验也会加油的↖(^ω^)↗

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实 验原理和操作步骤 实验原理: SDS-PAGE是对蛋白质进行量化,比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。 SDS是一种去垢剂,可与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后,电荷因素可被忽略。蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。 试剂和器材: 试剂:1. 5x样品缓冲液(10ml):0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油,2ml 10%的SDS,0.5ml巯基乙醇,1ml 1%溴酚蓝,0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周,或在-20℃保存数月。 2. 凝胶贮液:在通风橱中,称取丙烯酰胺30g,甲叉双丙烯酰胺0.8g,加重蒸水溶解后,定容到100ml。过滤后置棕色瓶中,4℃保存,一般可放置1个月。 3. pH8.9分离胶缓冲液:Tris 36.3g ,加1mol/L HCl 48ml,

加重蒸水80ml使其溶解,调pH8.9,定容至100ml,4℃保存。 4. pH6.7浓缩胶缓冲液:Tris 5.98g ,加1mol/L HCl 48ml,加重蒸水80ml使其溶解,调pH 6.7,定容至100ml,4℃保存。 5. TEMED(四乙基乙二胺)原液 6.10%过硫酸铵(用重蒸水新鲜配制) 7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液:称取Tris 6.0g,甘氨酸28.8g,加蒸馏水约900ml,调pH8.3后,用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存,临用前稀释10倍。 8. 考马斯亮蓝G250染色液:称100mg考马斯亮蓝G250,溶于200ml蒸馏水中,慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸,最后补足水到250ml,搅拌1小时,小孔滤纸过滤。 器材:电泳仪,电泳槽,水浴锅,摇床。 实验操作

SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告

SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量 一、前言 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳,简称PAGE,是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成,聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂,以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。在聚合过程中,TEMED催化过硫酸铵产生自由基,后者引发丙烯酰胺单体聚合,同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联,从而形成三维网状结构。 PAGE根据其有无浓缩效应,分为连续系统和不连续系统两大类,连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同,带电颗粒在电场作用下,主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分,pH,凝胶浓度及电位梯度的不连续性,带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应,分子筛效应,还具有浓缩效应,因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶,凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶,凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性,这是样品浓缩的主要因素。

SDS是阴离子去污剂,作为变性剂和助溶试剂,它能断裂分子和分子间的氢键,使分子去折叠,破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇,二硫糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后,分子被解聚成多肽链,解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束,所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量,这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。 SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统,与连续缓冲系统相比,能够有较高的分辨率。 浓缩胶的作用是有堆积作用,凝胶浓度较小,孔径较大,把较稀的样品加在浓缩胶上,经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCl缓冲液,电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后,HCl解离成氯离子,甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷,因此一起向正极移动,其中氯离子最快,甘氨酸根离子最慢,蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大,超过蛋白,因此在后面形成低电导区,而电场强度与低电导区成反比,因而产生较高的电场强度,使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动,形成一稳定的界面,使蛋白聚集在移动界面附近,浓缩成一中间层。 此鉴定方法中,蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量,而与所带电荷和分子形状无关。 聚丙烯酰胺凝胶电泳作用原理 聚丙烯酰胺凝胶为网状结构,具有分子筛效应。它有两种形式:

蛋白质含量测定方法及其比较资料2

蛋白质含量测定法(一) 蛋白质含量测定法,是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法,即定氮法,双缩脲法(Biuret法)、Folin-酚试剂法(Lowry法)和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法,即考马斯亮蓝法(Bradford法)。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20倍,比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 五种蛋白质测定方法比较

值得注意的是,这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质,因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定,有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的,都有其优缺点。在选择方法时应考虑:①实验对测定所要求的灵敏度和精确度;②蛋白质的性质;③溶液中存在的干扰物质;④测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法(Bradford法),由于其突出的优点,正得到越来越广泛的应用。 一、微量凯氏(Kjeldahl)定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例,其反应式如下: NH2CH2COOH+3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3 (1) 2NH3+H2SO4——(NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4+2NaOH——2H2O+Na2SO4+2NH3 (3) 反应(1)、(2)在凯氏瓶内完成,反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化,可以加入CuSO4作催化剂,K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液,滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量,如欲求得样品中蛋白含量,应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量,即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。 二、双缩脲法(Biuret法) (一)实验原理 双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。 (二)试剂与器材

SDS-PAGE电泳问题总结

SDS-PAGE电泳问题总结(2012-04-19 20:07:12)转载▼ 标签:杂谈分类:々☆常用技术☆々 蛋白质条带为什么走到下面逐渐变宽发散? 回答:多数情况是因为小分子在胶里的运动不规律,这种情况常发生在高浓度胶或凝固不 一致的胶里,你可以加大阴极的缓冲液浓度,可能会有点改善 胶凝的快慢不在于TEMED多少,在于APS的量,APS提供自由基,TEMED帮助自由基作用,是催化剂,对凝固速度影响不是太大,可以试试加大APS的量 丙烯酰胺在凝胶中的百分比分离胶的分辨范围 15 %15~45 kDa 12.5%15~60 kDa 10 %18~75 kDa 7.5%30~120kDa 5 %60~212kDa 来源于《蛋白质技术手册》汪家政 每种浓度的变性胶的分离范围不是指能跑出哪个范围分子量的蛋白质,而是指在这个区 间内,蛋白质迁移率基本和分子量成正比,也就是线性关系,为了数据的可靠性,大家 尽量根据这个来选择自己配胶的浓度。 下层也就是阳极缓冲液的作用当然是导电,用普通TRIS缓冲液做阳极缓冲液,一样跑得好,阴极就不一样了,需要提供离子强度和SDS环境,而在电泳过程中,阴极缓冲液的一些离子损失,而且与样品接触,不适合再次使用
至于有些时候跑太大浓度的胶,因为药品,BUFFER配制过程的一些问题,导致会出现蛋白带无法电泳到分离胶的最下方,胶跑得难看情况比较多,一般来说,15%的胶已经能够跑出大约15KDa左右的蛋白,对于普通SDS-PAGE已经几乎到了极限,还跑不出来的MARK带,就不必去追究商品的问题了 SDS-PAGE胶的凝结速度受温度影响很大,随着温度的升高,凝结速度越来越快,温度降 低则反之。所以,夏天时胶凝结的比较快,而冬天脚的凝结速度则变慢,甚至不能凝结,解决此类问题较可行的方法是:冬天在原配方的基础上加倍过硫酸铵和TEMED的使用量,可很好的解决胶凝结速度过慢的问题。 做SDS-PAGE的时候,除了蛋白量上样一致,最好体积也一致,这样跑出来的胶各个泳道之间的band能做到一样宽,方便后面的比较,特别是WB。做法就是拿1X的上样缓冲补全要加的样做到体积一致,否则跑出来会有的宽有的窄,特别是上样体积相差较大的 加入染色液后,先放入微波炉里加热5-10秒,使染色液微热即可(千万不要加热太久, 否则冰醋酸就挥发了)。然后放水平摇床上摇20分钟,最多半小时就染好了。脱色也很 简单,不用脱色液,直接用去离子水,放微波炉里煮沸5分钟左右,然后将水倒掉,再换上新的去离子水煮,这样反复几次,就可以了。效果可能比正常的脱色稍差一点点,不 如那样清楚,只要电泳时比平时多上1/5的样品就可以了,关键是这样省时省材料(用不着含甲醇和冰醋酸的脱色液)。方便快捷!放心,反复煮胶不会把胶煮坏的。

蛋白质分子量测定:凝胶过滤层析法

蛋白质分子量测定:凝胶过滤层析法 一、目的: (1)初步掌握利用凝胶层析法测定蛋白质分子量的原理。 (2)学习用标准蛋白质混合液制作Ve,Kav对1gMr的“选择曲线”以及测定未知蛋白质样品分子量的方法。 二、原理: 凝胶层析法(即凝胶过滤法,gel filtration)是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法,又叫做分子筛层析法(molecular sieve chromatography),排阻层析法(exclusion chromatography)。凝胶本身是一种分子筛,它可以把分子按大小不同进行分离,好象过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不一样。将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸泡,使充分吸液膨胀,然后装入层析柱中,加入欲分离的混合物后,再以同一溶剂洗脱,在洗脱过程中,大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外,而小分子可以进入凝胶内部,流速缓慢,以致最后流出柱外,从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。分离过程中的示意见图17-1。 凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质,不论是天然凝胶还是人工合成凝胶,它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶(agarose gel,商品名Sepharose),人工合成凝胶是聚丙烯酰胺凝胶(商品名为Bio-gel-P)和葡聚糖(dextran)凝胶,后者的商品名称为Sephadex型的各种交联葡聚糖凝胶,它是个有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶,不溶于水,其化学结构式如图17-2所示。 这种聚合物的立体网状结构,其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。在凝胶充分溶胀后,交联度高的,孔隙小,只有相应的小分子可以通过,适于分离小分子物质。相反,交联度低的孔隙大,适于分离大分子物质。利用这种性质可分离不同分子量的物质。 为了说明凝胶层析的原理,将凝胶装柱后,柱床体积称为“总体积”,以Vt(total volume)表示。实际上Vt是由Vo,Vi与Vg三部分组成,即: Vt=Vo+Vi+Vg Vo称为“孔隙体积”或“外体积”(outer volume)又称“外水体积”,即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积,相应于一般层析法中柱内流动相的体积;Vi为内体 积(inner volume),又称“内水体积”,即凝胶颗粒内部所含水相的体积,相应于一般层析法中的固定相的体积,它可从干凝胶颗粒重量和吸水后的重量求得;Vg为凝胶本身的体积,因此Vt—Vo等于Vi+Vg 。它们之间的关系可用图17-3表示。洗脱体积(Ve,elution Volume)与Vo及Vi之间的关系可用下式表示: Ve=Vo+KdVi 式中Ve为洗脱体积,自加入样品时算起,到组分最大浓度(峰)出现时所流出的体积;Kd为样品组分在二相间的分配系数,也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数。 它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关,而与柱的长短粗细无关,也就是说它对每一物质为常数,与柱的物理条件无关。Kd可通过实验求得,上式可改写成: 上式中Ve为实际测得的洗脱体积;Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液(最好有颜色以便于观察,如血红蛋白,印度黑墨水,分子量约200万的蓝色葡聚糖-2000等)通过实际测量求出;Vi可由g·WR求得(g为干凝胶重,单位为克;WR为凝胶的“吸水量”,以毫升/克表示)。因此,对一层析柱凝胶床来说,只要通过实验得知某一物质的洗脱体积Ve,就可算出它的

SDS-PAGE电泳实验步骤

垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质 一、实验目的 学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。 二、实验原理 蛋白质是两性电解质,在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时,蛋白质本身带负电,在电场中将向正极移动;当溶液的pH小于蛋白质的等电点时,蛋白质带正电,在电场中将向负极移动;蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。 聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。本实验采用不连续凝胶系统,调整双丙烯酰胺用量的多少,可制成不同孔径的两层凝胶;这样,当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时,受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大,不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时,受到的阻滞基本相同,因此以相同的速率移动;当进入小孔胶时,分子量大的蛋白质移动速度减慢,因而在两层凝胶的界面处,样品被压缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时,在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时,采用两种缓冲体系;上层胶pH=6.7—6.8,下层胶pH=8.9;Tris —HCI缓冲液中的Tris用于维持溶液的电中性及pH,是缓冲配对离子;CI-是前导离子。在pH6.8时,缓冲液中的Gly-为尾随离子,而在pH=8.9时,Gly的解离度增加;这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性,控制了慢离子的解离度,进而达到控制其有效迁移率之目的。不同蛋白质具有不同的等电点,在进入分离胶后,各种蛋白质由于所带的静电荷不同,而有不同的迁移率。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应,分子筛效应及电荷效应,使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。 如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS),由于SDS带有大量的负电荷,且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性,特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下,蛋白质分子内的二硫键被还原,肽链完全伸展,使蛋白质分子与SDS充分结合,形成带负电性的蛋白质—SDS复合物;此时,蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量,掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。蛋白质分子量愈小,在电场中移动得愈快;反之,愈慢。蛋白质的分子量与电泳迁移率之间的关系是: M r =K(10-b·m) logM r =LogK—b·R m , 式中M r ——蛋白质的分子量; logK——截距; b——斜率; R m ——相对迁移率。 实验证明,蛋白质分子量在15,000—200,000的范围内,电泳迁移率与分子量

SDS-PAGE凝胶电泳

蛋白质亚基分子量测定SDS-PAGE凝胶电泳 一目的 掌握SDS-PAGE凝胶电泳测定蛋白质亚基分子量的基本原理和操作方法 二原理 SDS是一种阴离子去污剂,作为变性剂和助溶性试剂,能断裂分子内和分子间的氢键,使分子去折叠,破坏蛋白质分子的二级、三级结构;而强还原剂,如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。 因此,在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后,蛋白质分子被解聚为组成它们的多肽链,解聚后的氨基酸侧链与SDS结合后,形成带负电的蛋白质-SDS胶束,所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量,消除了不同分子间的电荷差异;同时,蛋白质-SDS聚合体的形状也基本相同,这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的影响。 基于上述SDS-PAGE的原理介绍,我们可以利用SDS-PAGE电泳进行未知蛋白质的分子量测定;以不同分子量的标准蛋白进行SDS-PAGE电泳得到不同标准蛋白的电泳迁移率,制作标准校正曲线,然后对未知蛋白在相同条件下进行SDS-PAGE电泳,测定迁移率,从标准曲线得到相应的分子量 三试剂和器材 试剂:1低分子量标准蛋白质 2 待测蛋白质样品(用上次测定的可溶性蛋白样液) 3 凝胶贮液:30g丙烯酰胺,0.8g甲叉双丙烯酰胺,溶于100ml蒸馏水中,过滤,于4°暗处贮存,一个月内使用 4 1mol/l,PH8.8 Tris-HCl 缓冲液,Tris121g溶于蒸馏水,用浓盐酸调至PH8.8,以蒸馏水定容至1000ml 5 10%(w/v)SDS 6 10%(w/v)过硫酸铵溶液(当天配) 7 四甲基乙二胺(TEMED) 8 电极缓冲液PH8.3:Tris30.3g,甘氨酸144.2g,SDS 10g,溶于蒸馏水并定容至1000ml,使用时稀释10倍。 9 2×样品稀释液:SDS 500mg,巯基乙醇1ml ,甘油3ml, 溴酚蓝4mg,1mol/L Tris-HCL (pH6.8),用蒸馏水溶解并定容至10ml,按每份1ml分装,可在4℃存放数周,或在-20℃保存数月。以此液制备样品时,样品若为液体,则加入与阳平等体积的原液混合即可。 10 固定液:500ml 乙醇,100ml冰醋酸,用蒸馏水定容至1000ml 11 脱色液:250ml乙醇,80ml冰醋酸,用蒸馏水定容至1000ml 12 染色液:0.29g考马斯亮蓝R-250溶解在250ml脱色液中 器材:微量进样针,电泳仪,电泳槽 四操作步骤 1分离胶制备: 凝胶浓度5% 7.5% 10% 12.5% 15% 凝胶贮液ml 5 7.5 10 12.5 15 1mol/LPH8.8 Tris-HClml 11.2 11.2 11.2 11.2 11.2 水ml 13.7 11.2 1.2 8.7 3.7 10% SDS ml 0.3 10% 过硫酸铵ml 0.1 TEMED (μL) 20 将上述胶液配好,混匀后,迅速加入两块玻璃板间隙中,使胶液面与矮玻璃和高玻璃之间形

蛋白质相对分子质量的测定(SDS法)

蛋白质相对分子质量的测定 (SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法) 一、实验原理 蛋白质在十二烷基硫酸钠(SDS)和巯基乙醇的作用下,分子中的二硫键还原,氢键等打开,形成按1.4gSDS/1g蛋白质比例的SDS-蛋白质多肽复合物,该复合物带负电,故可在聚丙烯酰胺凝胶电泳中向正极迁移,且主要由于凝胶的分子筛作用,迁移速率与蛋白质的分子量大小有关,因此可以浓缩和分离蛋白质多肽。 聚丙烯酰凝胶电泳分离蛋白质多数采用一种不连续的缓冲系统,主要分为较低浓度的成层胶和较高浓度的分离胶,配制凝胶的缓冲液,其pH值和离子强度也相应不同,故电泳时,样品中的SDS-多肽复合物沿移动的界面移动,在分离胶表面形成了一个极薄的层面,大大浓缩了样品的体积,即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩效应。 二、仪器及器材 垂直电泳槽及附件、直流稳压稳流电泳仪、移液器等。 三、试剂 1、凝胶贮备液:称取30g 丙烯酰胺(Acr)和0.8g 甲叉-双丙烯酰胺(Bis),蒸馏水溶解后定容至100mL,滤纸过滤贮存。 2、10% SDS:称取SDS 10g 加蒸馏水至100ml。 3、10%过硫酸胺(AP),用时现配。 4、N,N,N’,N’四甲基乙二胺(TEMED)。 5、电极缓冲液:3.03g Tris、14.14g甘氨酸、1.0g SDS溶于水,混匀后用HCL调节pH至8.3,加蒸馏水至1 000ml。 6、样品溶解(缓冲)液:0.6gTris、5mL甘油(丙三醇)1.0g SDS溶于水,混匀后用HCL调节pH至8.0,再加0.1g溴酚蓝、2.5mL巯基乙醇,定容至100mL。 7、下层胶(分离胶)缓冲液:18.17g Tris、0.4gSDS溶于水,混匀后用1mol/L HCL 调节pH至8.8,加蒸馏水至100ml。 8、上层胶(浓缩胶)缓冲液:6.06g Tris、0.4gSDS溶于水,混匀后用1mol/L HCL 调节pH至6.8,加蒸馏水至100ml。 9、固定液:25%异丙醇,10%乙酸。 10、染色液:0.125g考马斯亮蓝R-250加固定液250ml。 11、脱色液:冰乙酸75ml、甲醇50ml,加水定容至1000ml。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量

实验六报告: SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量 1.研究背景及目的 根据自然界中普遍存在的电泳现象,以及实践应用的需求,科学家不断完善了电泳技术,从移界电泳法、垂直管型盘状电泳、垂直板型电泳、垂直柱型盘状电泳到水平板型电泳。电泳技术广泛地应用于样品的分析鉴定。蛋白质分子量的测定在理论和实践中具有很重要的意义,比如临床中对于尿液中蛋白质分子量的测定可以监测人体内的某些疾病(肾小管损坏、多发性骨髓瘤等)。这种需要促进了相关技术的发明。具体过程见原理。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时,它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。从活性电泳到变性电泳经过了很多思考。从活性如果加入一种试剂使电荷因素及分子的形状消除,那电泳迁移率就取决于分子的大小,就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。 1967年,Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)具有这种作用[1] 。 通过向样品中添加入巯基乙醇和过量SDS,使蛋白质变性解聚,并让SDS与蛋白质结合成 带强负电荷的复合物,掩盖了蛋白质之间原有电荷的差异。SDS与蛋白质分子结合,不仅 使蛋白质分子带上大量的负电荷,而且使蛋白质分子的形状都变成短棒状,从而消除了蛋白质分子之间原有的电荷差异和分子形状的差异。因此蛋白质在SDS-PAGE中的时迁移率 主要取于其分子大小。由于SDS与蛋白质的结合,电泳迁移率在外界条件固定的情况下,只取决于蛋白质分子量大小这一因素,使得SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳具有分辨率高、重复性好等特性,因此广泛应用于未知蛋白质分子量测定。通过本次实验,学习和掌握垂直板型聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和方法,进一步学习和应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量。 2.原理 由于技术的发展,理论上可以通过测序测出蛋白质分子量的真值,但是实际操作过于繁琐,且生物大分子的数量级是KDa,实际中往往不需要特别精确。所以转向寻求其它方法,如果两种性质具有相关性,就会有相关理论基础和技术,发现分子量与迁移速率有关,于是寻找相关方面的技术。通过沉降平衡法测定分子量,但是需要很大的转速,且要考虑安全性和造价,于是舍弃;分子筛层析主要以分子量差异进行分离,可以用来测定分子量,但是需要很长的分离柱,分离速度较慢,还要测定OD值,操作麻烦,浪费时间,而且带 来的经济效益也不是很大;与此同时,电泳技术也发展起来,电泳相对时间较短,造价低,可操作性强。电泳与分子量、分子形状以及所带电荷量有关,其中含有分子量,理论上就可行了,于是用电泳测定分子量。首要矛盾是消除电荷差异和分子形状差异,从数学上彻底消除电荷效应是不可能的,使带电量相同也不可能实现,只有使分子带上非常大的电荷量从而使分子间的电荷差异可以忽略。想到通过引入外来物形成复合物,定量引入,定量结合,且结合后分子间差异并未发生改变。关于引入负电还是引入正电的问题,蛋白大多为球状,若结合后仍未球状,静电结合不稳定;双亲性物质彻底结合后破坏空间结构,所以引入负电,结合稳定。于是开始筛选阴离子去污剂,在众多的物质试验中,发现十二烷基硫酸钠(SDS)具有很好的效果。SDS通常与蛋白质以1.4:1的重量比结合,所引入净电 荷量约为蛋白质本身静电荷 10倍的静电荷,从而形成具有均一电荷密度和相同荷质比的SDS-蛋白质复合物,该复合物所带的电荷远远超过蛋白质原有的净电荷,从而消除或大大降低不同蛋白质之间所带净电荷

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 实验报告

一、实验目的 1.学习SDS-PAGE分离蛋白质的原理; 2.掌握垂直板电泳的操作方法。 二、实验原理 1、电泳: (1)定义:是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。 (2)影响电泳效果的因素: ①带电颗粒的大小和形状:颗粒越大,电泳速度越慢,反之越快; ②颗粒的电荷数:电荷越少,电泳速度越慢,反之越快; ③溶液的粘度:粘度越大,电泳速度越慢,反之越快; ④溶液的pH值:影响被分离物质的解离度,离等电点越近,电泳速度越慢,反之越快; ⑤电场强度:电场强度越小,电泳速度越慢,反之越快; ⑥离子强度:离子强度越大,电泳速度越慢,反之越快; ⑦电渗现象:电场中,液体相对于固体支持物的相对移动; ⑧支持物筛孔大小:孔径小,电泳速度慢,反之则快。 2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) (1)定义 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE):是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。 SDS-PAGE:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基磺酸钠) (2)SDS的作用 SDS是一种阴离子去垢剂,可与蛋白质结合,形成SDS-蛋白质复合物。 由于SDS带有大量负电荷,好比蛋白质穿上带负电的“外衣”,蛋白质本身带有的电荷则被掩盖,即消除了蛋白质分子之间电荷差异。 因此在电泳时,蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小 (3) SDS-PAGE分类: ?SDS-PAGE按照缓冲液pH值和凝胶孔径差异分为连续系统和不连续系统两大类: 连续系统:电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同,带电颗粒在电场作用下,主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统:缓冲液离子成分,pH,凝胶浓度及电位梯度均不连续性,带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应,分子筛效应,还具有浓缩效应,因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳 (4)聚丙烯胺凝胶的生成: 聚丙烯胺凝胶由丙烯酰胺单体(Acr)和N,N’-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂作用下聚合而成。在具有自由基时,Acr和Bis就会聚合。 引发产生自由基的方法有两种:

高等生化实验报告:蛋白质分子量的测定

实验一蛋白质分子量的测定—凝胶层析法 一、原理 凝胶层析法也称分子筛层析法,是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。当混合物随流动相经过凝胶层析柱时,其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。 凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质,每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致,像筛子,小的分子可以进入凝胶网孔,而大的分子则排阻于颗粒之外。当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时,这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动,流程短,移动速率快,先被洗出层析柱;而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部,然后再扩散出来,故流程长,移动速度慢,最后被洗出层析柱,从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质,则居二者之间从柱中流出。总之,各种不同相对分子质量的蛋白质分子,最终由于它们被排阻和扩散的程度不同,在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同,从而彼此可以分离开来。 将凝胶装在柱后,柱床体积称为“总体积”,以Vt表示。实质上Vt是由Vo,Vi与Vg三部分组成,Vo称为“孔隙体积”或“外水体

积”,即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积,相应于一般层析法中柱内流动相的体积;Vi为内体积,即凝胶颗粒内部所含水相的体积。Vg为凝胶本身的体积。洗脱体积(Ve)与Vo与Vi之间的关系可用下式表示:Ve=Vo+KdVi。 式中Ve为洗脱体积,自加入样品时算起,到组分最大浓度(峰)出现时所流出的体积;Kd为样品组分在二相间的分配系数,也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部与外部的分配系数。它只与被分离的物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关,而与柱的长度粗细无关,也就是说它对每一物质为常数,与柱的物理条件无关。Kd可通过实验求得,上式可以改写为:Kd=(Ve-Vo)/Vi。 上式中Ve为实际测得的洗脱体积;Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液(最好是有颜色以便于观察,如血红蛋白,印度黑墨水,分子量约200万的蓝色葡聚糖-2000等)通过实际测量求得;Vi可由g×Wr求得(g为干胶重量,单位为克;Wr为凝胶的“吸水量”,以毫升每克表示)。因此,对一层析柱胶床来说,只要通过实际实验得知某一物质的洗脱体积就可算出它的Kd值。 如果假定蛋白质分子近于球形,同时没有显著的水合作用,则不同大小分子量的蛋白质,在洗脱时峰的位置和该物质相对分子质量有直接的定量的关系。在一根凝胶柱中,凝胶颗粒间空隙所含水相体积为外水体积Vo,不能进入凝胶孔径的那些大分子,当洗脱体积为Vo 时,出现洗脱峰。 凝胶颗粒内部孔穴的总体积为内水体积Vi,能全部渗入凝胶的那

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定蛋白质分子量

实验七SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定蛋白质分 子量 实验数据: 标准蛋白质条带第一条第二条第三条第四条第五条 溴酚蓝前沿距离/cm 4.70 距离/cm 0.50 0.95 1.60 2.10 3.95 相对迁移率mr 0.11 0.20 0.34 0.45 0.84 分子量Mr 97400 66200 43000 31000 14400 LgMr 4.99 4.82 4.63 4.49 4.16 样品 1 2 3 溴酚蓝前沿/cm 4.90 4.80 4.60 样品迁移距离/cm 4.20 1.20 1.70 相对迁移率mr 0.86 0.25 0.37 标准曲线: y=5.05-1.10x

结果: 样品 1 2 3 Mr 12706 59566 43954 mr 4.104 4.775 4.643 一. 实验目的和要求 1 学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。 2 掌握垂直板电泳的操作方法。 3 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。 二 .实验原理 带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动,这种现象称为电泳。 区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液,然后加电场,分子在支持介质上或支持介质中迁移。支持介质的作用主要是为了防止机械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。 区带电泳使用不同的支持介质,早期有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树脂;以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜,现在则多用聚丙烯酰胺(PAGE)和琼脂糖凝胶。 PAGE根据其有无浓缩效应,分为连续系统和不连续系统两大类,连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同,带电颗粒在电场作用下,主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分,pH,凝胶浓度及电位梯度的不连续性,带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应,分子筛效应,还具有浓缩效应,因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基磺酸钠), SDS能断裂分子内和分子间氢键,破坏蛋白质的二级和三级结构,强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂,蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中,与SDS分子按比例结合,形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物,这种复合物由于结合大量的SDS,使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块,从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异,由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的,因此在进行电泳时,蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时,蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,符合下式:logMW=K-bX,式中:MW为分子量,X为迁移率,k、b均为常数,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中,待别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。影响它们结合的因素主要有三个: 1) 溶液中SDS单体的浓度,当单体浓度大于1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1:1.4,如果单休浓度降到0.5 mmol/L以下时,两者的结合比仅为1: 0.4这样就不能消除蛋白质原有的电荷差别,为保证蛋白质与SDS的充分结合,它们的重量比应该为1:4或1:3 2) 样品缓冲液的离子强度。SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低,通常是10~ 100mmol/L 3) 二硫键是否完全被还原

碱基与蛋白换算

碱基与蛋白换算 创建者: zizip 最后修改: 2010-6-4 23:05:47 状态: 公开 核酸数据 (Nucleic Acid Data) Kd是kilodaltons的缩写,既千道尔顿。是氨基酸的分子量单位。 Kbs是千碱基对的意思,是核酸的单位名称。 1个脱氧核糖核酸碱基的平均分子量为333 Daltons(道尔顿) 1个核糖核酸碱基的平均分子量为340 Daltons(道尔顿) DNA与表达蛋白之间分子量换算: 1 kb DNA = 333 amino acid ≈3.7 × 104 Da(道尔顿) 10,000 Da Protein ≈ 270 bp DNA 30,000 Da Protein≈ 810 bp DNA 50,000 Da Protein ≈1350 bp DNA 100,000 Da Protein ≈ 27 kb DNA 一个DNA碱基对(钠盐)的平均分子量= 650 道尔顿 1.0 A260 unit ds DNA = 50 μg/ml = 0.15 mM (in nucleotides) 1.0 A260 unit ss DNA = 33 μg/ml = 0.10 mM (in nucleotides) 1.0 A260 unit ss RNA = 40 μg/ml = 0.11 mM (in nucleotides) 双链DNA分子的分子量(道尔顿) = 碱基对数目×650 双链DNA分子的末端摩尔数= 2 ×DNA质量(克)/ DNA分子量(道尔顿)限制性内切酶酶切后的DNA末端摩尔数: a) 环状DNA分子: 2 × DNA摩尔数×位点数 b) 线性DNA分子: 2 × DNA摩尔数×位点数+ 2 × DNA摩尔数 1 μg 1000 bp DNA = 1.5 2 pmol = 9.1 × 1011 molecules 1 μg pUC18/19 DNA (2686 bp) = 0.57 pmol = 3.4 × 1011 molecules

蛋白质分子量的测定——凝胶层析法

实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法 一、实验目的 1.掌握凝胶层析的基本原理。 2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能。 二、实验原理 凝胶层析法也称分子筛层析法,是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。当混合物随流动相经过凝胶层析柱时,其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。 凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质,每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致,像筛子,小的分子可以进入凝胶网孔,而大的分子则排阻于颗粒之外。当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时,这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动,流程短,移动速率快,先被洗出层析柱;而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部,然后再扩散出来,故流程长,移动速度慢,最后被洗出层析柱,从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质,则居二者之间从柱中流出。总之,各种不同相对分子质量的蛋白质分子,最终由于它们被排阻和扩散的程度不同,在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同,从而彼此可以分离开来。 将凝胶装在柱后,柱床体积称为“总体积”,以Vt表示。实质上Vt是由 Vi与Vg三部分组成,Vo称为“孔隙体积”或“外水体积”,即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积,相应于一般层析法中柱内流动相的体积;Vi 为内体积,即凝胶颗粒内部所含水相的体积。Vg为凝胶本身的体积。洗脱体积(Ve)与Vo与Vi之间的关系可用下式表示:Ve=Vo+KdVi 式中Ve为洗脱体积,自加入样品时算起,到组分最大浓度(峰)出现时所流出的体积;Kd为样品组分在二相间的分配系数,也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部与外部的分配系数。它只与被分离的物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关,而与柱的长度粗细无关,也就是说它对每一物质为常数,与柱的物理条件无关。Kd可通过实验求得,上式可以改写为:Kd=(Ve-Vo)/Vi

5 SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子量

实验SDS - PAGE测定蛋白质的相对分子量 一、目的 了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理,并学会用这种方法测定蛋白质的相对分子量。 二、原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳之所以能将不同的大分子化合物分开,是由于这些大分子化合物所带电荷的差异和分子大小不同之故,如果将电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程度,这些化合物在凝胶上的迁移率则完全取决于相对分子质量。 SDS是十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate)的简称,它是一种阴离子去污剂,它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物,其负电荷远远超过了蛋白质原有的电荷,也就消除或降低了不同蛋白质之间原有的电荷差别,这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素,就可根据标准蛋白质的相对分子量的对数对迁移率所作的标准曲线求得未知蛋白质的相对分子质量。本实验用目前常用的垂直平板电泳,样品的起点一致,便于比较。 三、试剂和器材 (一)试剂 1. 凝胶贮备液:丙烯酰胺(Acr)29.2g和亚甲基双丙烯酰胺(Bis)0.8g重蒸水溶解后, 定容至100ml,棕色试剂瓶4℃保存,30天内使用。 2. 分离胶缓冲液:1.5mol/L Tris-HCl,pH8.8。 18.15 Tris(三羟甲基氨基甲烷),少许重蒸水溶解,用1M HCl调pH8.8,重蒸水定容 至100ml,4℃保存。 3. 浓缩胶缓冲液:0.5mol/LHCl,pH6.8。 6gTris,少许重蒸水溶解,用1M HCl调pH6.8,重蒸水定容至100ml,4℃保存。 4. 10%SDS,室温保存。 5. 两类样品缓冲液: 2倍还原缓冲液(2×reducing buffer) 0.5mol/L HCl,pH6.8 2.5 ml 甘油 2.0 ml 质量浓度10%SDS 4.0ml 质量浓度0.1%溴酚蓝0.5ml β-巯基乙醇 1.0 ml 总体积10 ml 6. 电极缓冲液,pH8.3。 Tris3g,甘氨酸14.4g,SDS1.0g加重蒸水溶解定容至1000ml,4℃保存。 7. 低分子量标准蛋白质(上海产)。 开封后溶于200μl重蒸水,加200μl 2倍样品缓冲液(还原缓冲液),分装20小管,-20℃保存。临用前沸水浴3~5min,其相对分子量(Mr)如下: 兔磷酸化酶B 97 400 牛血清白蛋白 66 200 兔肌动蛋白 43 000 牛碳酸酐酶 31 000 胰蛋白酶抑制剂 20 100 鸡蛋清溶菌酶 14 400 8. 质量浓度为10%过硫酸铵:(临用前配制) 9. 染色液: 0.25g考马斯亮蓝R250,加入40ml甲醇,10ml冰醋酸,蒸馏水定容至100ml,过滤。 10. 脱色液:50ml甲醇,75ml冰醋酸与875 ml重蒸水混合。 11. 待测蛋白样品。 12. 1%琼脂糖(最好用电极液配) 13 TEMED

蛋白质分子量标准(高)使用说明书

蛋白质分子量标准(高) Protein Molecular Weight Marker (High) 使用说明书 Takara Code : D531A 浓度: 10 μg/μl 制品内容(约200次量) Protein MW Marker(high)50 μl 5×Loading Buffer 1000 μl 1 M DTT(Dithiothreitol)100 μl 制品说明 Protein Molecular Weight Marker(High)是由五种纯化好的不同分子量的蛋白质组成的,它的分子量范围为:44.3 KDa~200KDa。进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时,经考马斯亮蓝R-250染色后的各种蛋白质的条带强度均一。每微升本制品的蛋白量为10 μg,稀释20倍后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,每次取5 μl(for SDS-PAGE mini gel)。以每次使用5 μl(20倍稀释液)计算时本制品约可使用200次。 保存条件 制品原液可在-20℃下长期保存,制品的20倍稀释液可在-20℃下保存2~3个月,制品的原液和制品的20倍稀释液都应避免多次反复冻融。 制品中的各种蛋白质种类 使用注意 推荐使用7.5~10%的聚丙烯酰胺凝胶。浓度太高,高分子量的蛋白分离效果不好,有可能聚集于分离胶的上部。使用方法 1. 首先按以下方法配制“稀释液”。 1 M DTT 2 μ l 5×Loading Buffer 20 μl * 稀释液可于室温下放置一个月左右。 2.按以下方法稀释本制品。 稀释液22 μl 灭菌蒸馏水73 μl * 20倍的制品稀释液可在-20℃下保存2~3个月,但应 避免多次反复冻融。如果一次稀释量较多时,可以小量 分装后在-20℃下保存,以避免反复冻融。 3. 均匀混合后,100℃加热处理5分钟,然后取5 μl进行7.5~10% 的聚丙烯酰胺凝胶电泳(for SDS-PAGE mini gel)。 4. 7.5%、10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳后,经考马斯亮蓝R-250染 色后的结果如下。 V2012,01 KDa 200.0 116.0 97.2 66.4 44.3 200.0 116.0 97.2 66.4 44.3 KDa 7.5% 10%

相关文档
最新文档